李樂(lè)樂(lè)，楊學(xué)為，羅雪韻，范 柳，尹樂(lè)斌,2*

（1.邵陽(yáng)學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南邵陽(yáng) 422000；2.豆制品加工與安全控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南邵陽(yáng) 422000）

豆渣是豆制品加工副產(chǎn)物，其富含膳食纖維、有機(jī)酸和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分。由于豆渣有機(jī)物豐富，水分大且口感粗糙，導(dǎo)致其處理成本高昂，豆渣的綜合利用也成為豆制品企業(yè)急需解決的問(wèn)題[1]。大豆多肽即肽基蛋白水解物，其主要是通過(guò)酶解和微生物發(fā)酵使大分子蛋白水解為小分子多肽，研究表明大豆多肽具有抗氧化、降血壓、降血糖和抗疲勞等生理活性[2-4]。不同分子量大豆多肽生理活性也存在差異。鄧成萍等[5]運(yùn)用中性蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶水解制備大豆多肽，并超濾分離成4個(gè)多肽組分，同時(shí)探究不同分子量多肽的物理性質(zhì)和生物活性，研究發(fā)現(xiàn)小分子大豆多肽的DPPH自由基清除能力和ACE抑制活性顯著增強(qiáng)。

超濾分離是一種應(yīng)用廣泛的膜分離技術(shù)，在壓力差作用下利用超濾膜將不同分子量物質(zhì)分離，具備操作簡(jiǎn)單、成本低、適應(yīng)力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，通常被用于分離純化多肽、多糖等活性成分[6]。豆渣經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備大豆多肽，其發(fā)酵液顏色較深。本實(shí)驗(yàn)利用活性炭對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行脫色處理，超濾分離純化不同組分多肽，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行比較分析，以深入了解不同組分多肽的生理活性，同時(shí)為探究大豆多肽的純化技術(shù)提供有效的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與菌株

豆渣由實(shí)驗(yàn)室提供；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），綠隴生物有限公司。

1.1.2 試劑

活性炭，臺(tái)山市粵僑試劑塑料有限公司；ABTS，分析純，安徽酷兒生物工程有限公司；DPPH，分析純，南京都萊生物技術(shù)有限公司；抗壞血酸，福晨化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；VELOCITY 14R臺(tái)式冷凍離心機(jī)，Dynamica公司；D-7型紫外分光光度計(jì)，南京菲勒儀器有限公司；微濾機(jī)組，使用纖維膜和不同分子量的超濾膜，上海摩速科學(xué)器材有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大豆多肽的制備

回收干凈的濕豆渣利用精細(xì)磨粉碎成糊漿狀，加入純化水調(diào)整豆渣的干基使其達(dá)到5.8%，在豆渣糊中加入纖維素酶水解形成豆渣酶解液，將其置于80 ℃水浴鍋滅酶10 min（將pH值調(diào)整為7.2）。將枯草芽孢桿菌接種在豆渣酶解液中開(kāi)始液態(tài)發(fā)酵（控制發(fā)酵條件為溫度37 ℃，接種量3%，時(shí)間60 h），將發(fā)酵液在冷凍離心機(jī)下以10 000 r/min離心10 min后取上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 活性炭脫色處理

由于豆渣發(fā)酵液顏色呈黃褐色，因此考慮利用活性炭進(jìn)行脫色處理。量取20 mL發(fā)酵液置于錐形瓶中，在一定的活性炭用量（0.25%、0.50%、1.00%、1.50%和2.00%）、脫色溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃）、脫色 時(shí) 間（15 min、30 min、45 min、60 min和75 min）下對(duì)豆渣發(fā)酵液進(jìn)行脫色處理，脫色液經(jīng)抽濾和離心后，在400 nm波長(zhǎng)下測(cè)定脫色前后吸光度變化，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定脫色前后多肽含量變化，以脫色率和多肽保留率為指標(biāo)，確定最佳脫色條件。脫色率和多肽保留率計(jì)算公式如下：

式中：A1為脫色前吸光度；A2為脫色后吸光度；B為脫色后多肽含量，%；B0為脫色前多肽含量，%。

1.2.3 超濾分離

將脫色處理后的發(fā)酵液進(jìn)行冷凍離心（5 200 r/min，12 min），分別通過(guò)預(yù)先清洗的纖維膜和10 kDa、5 kDa、3 kDa和500 Da的超濾膜，壓力調(diào)整為40 MPa，25 ℃下進(jìn)行回流超濾。發(fā)酵液最初體積為4 000 mL，起初將發(fā)酵液通過(guò)含有纖維膜的柱子以除去其中的不溶性雜質(zhì)，然后由大到小經(jīng)過(guò)10 kDa、5 kDa、 3 kDa、500 Da超濾膜，分階段收集5～10 kDa、3～5 kDa、500～3 000 Da和＜500 Da的組分，將不同組分樣品進(jìn)行冷凍干燥，凍干粉置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本課題的前期實(shí)踐研究階段已告一段落，在前期實(shí)踐研究中各教研組扎實(shí)的開(kāi)展課例研討活動(dòng)、學(xué)校舉辦了青年教師賽課活動(dòng)，本課題小組通過(guò)這一系列的活動(dòng)收集到與課題相關(guān)的課例小結(jié)、課堂實(shí)錄、教學(xué)反思以及經(jīng)驗(yàn)論文等資料，已取得部分的成效，現(xiàn)將研究情況報(bào)告如下。

1.2.4 多肽的抗氧化性

測(cè)定不同多肽組分的ABTS陽(yáng)離子清除率、DPPH自由基清除率、OH自由基清除率[7-8]。根據(jù)不同自由基在不同波長(zhǎng)下存在特征吸收峰確定波長(zhǎng)，由于自由基與抗氧化劑共存時(shí)，其體系溶液顏色變淺，故可以用于判定多肽樣品的抗氧化能力，根據(jù)不同波長(zhǎng)下樣品的吸光度值即可得到不同自由基的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性炭脫色處理

2.1.1 脫色溫度對(duì)發(fā)酵液脫色效果的影響

如圖1所示，隨著脫色溫度提高，發(fā)酵液脫色率呈先快速上升后趨于緩慢下降的趨勢(shì)，多肽保留率呈先急劇下降后緩慢下降得趨勢(shì)，當(dāng)脫色溫度低于50 ℃時(shí)，隨著溫度升高，發(fā)酵液脫色率快速升高且多肽保留率下降明顯，當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃時(shí)，脫色率和多肽保留率緩慢降低，可能是由于溫度升高，體系中分子加快擴(kuò)散，加速了活性炭對(duì)色素及其他分子的吸附，但當(dāng)溫度過(guò)高，會(huì)使活性炭的解吸大于吸附，同時(shí)也會(huì)使部分活性成分損失[9]。綜合考慮，選擇脫色溫度50 ℃為最佳。

圖1 脫色溫度對(duì)發(fā)酵液脫色效果的影響

2.1.2 脫色時(shí)間對(duì)發(fā)酵液脫色效果的影響

如圖2所示，隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液脫色率呈先快速上升后趨于平緩的趨勢(shì)，多肽保留率呈先急劇下降后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，當(dāng)脫色時(shí)間＞45 min，發(fā)酵液脫色率和多肽保留率相對(duì)穩(wěn)定，這是由于活性炭吸附存在吸附和解析的動(dòng)態(tài)平衡，在脫色時(shí)間45 min時(shí)到達(dá)了平衡點(diǎn)。綜合考慮，選擇脫色時(shí)間45 min為最佳。

圖2 脫色時(shí)間對(duì)發(fā)酵液脫色效果的影響

2.1.3 活性炭添加量對(duì)發(fā)酵液脫色效果的影響

圖3 活性炭添加量對(duì)發(fā)酵液脫色效果的影響

2.2 抗氧化能力測(cè)定

2.2.1 ABTS陽(yáng)離子清除率測(cè)定

ABTS與過(guò)硫酸鉀反應(yīng)，生成藍(lán)綠色的ABTS自由基在734 nm處有特征吸收峰，當(dāng)與抗氧化劑共存時(shí)，體系顏色變淺，在734 nm處的吸光度下降，因其反應(yīng)靈敏、操作簡(jiǎn)便而被廣泛應(yīng)用于抗氧化活性指標(biāo)的評(píng)定[10]。不同多肽組分對(duì)ABTS陽(yáng)離子清除效果如圖4所示，發(fā)酵液的不同超濾組分樣品均具有一定的清除效果，＜500 Da的多肽樣品比其他組分對(duì)ABTS陽(yáng)離子清除效果強(qiáng)。

圖4 不同多肽組分對(duì)ABTS陽(yáng)離子 清除效果

2.2.2 DPPH自由基清除率測(cè)定

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，由于其具有單電子，其醇溶液在517 nm具有明顯的吸收峰，當(dāng)DPPH中單電子與其他抗氧化劑中的單電子配對(duì)時(shí)，517 nm處吸光度降低，因此常被用來(lái)分析體外抗氧化實(shí)驗(yàn)[10]。不同多肽組分對(duì)DPPH自由基清除效果如圖5所示，發(fā)酵液的不同超濾組分樣品對(duì)DPPH自由基都具有一定的清除效果，其中5～10 kDa的多肽樣品比其他組分清除效果強(qiáng)。

圖5 不同多肽組分對(duì)DPPH的清除效果

2.2.3 OH自由基清除率測(cè)定

OH自由基是活性氧中對(duì)生物體毒害作用最強(qiáng)的一種自由基，與細(xì)胞衰老和損傷有關(guān)[11]。不同多肽組分對(duì)OH自由基清除效果如圖6所示，發(fā)酵液的不同超濾組分樣品對(duì)OH自由基都具有一定的清除效果，其中3～5 kDa的多肽樣品比其他組分清除效果強(qiáng)。

圖6 不同多肽組分對(duì)OH的清除效果

3 結(jié)論

本研究利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆渣酶解液制備大豆多肽，利用活性炭脫色處理，再通過(guò)超濾分離不同組分多肽，并研究不同組分的抗氧化能力。結(jié)果表明，最佳脫色條件為活性炭添加量1%、脫色溫度50 ℃、脫色時(shí)間45 min；不同組分對(duì)3種自由基均有一定的清除活性，其中＜500 Da多肽組分對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性最強(qiáng)，5～10 kDa多肽組分對(duì)DPPH自由基清除活性最強(qiáng)，3～5 kDa對(duì)OH自由基清除活性最強(qiáng)。本研究為探究大豆多肽生理活性和開(kāi)發(fā)前景提供數(shù)據(jù)參考。