李長悅，解 飛，馬 立

（上海大學(xué) 機(jī)電工程與自動(dòng)化學(xué)院，上海 200444）

近年來，水凝膠在生物工程領(lǐng)域中得到了快速發(fā)展，其應(yīng)用越來越廣。例如，水凝膠支架可用于藥物運(yùn)輸，傳遞生物活性分子或包囊分泌性細(xì)胞[1]；利用微流道芯片制造結(jié)構(gòu)復(fù)雜的水凝膠纖維等[2]。其中，海藻酸鈣水凝膠的應(yīng)用最為廣泛，它具有無毒、良好的生物相容性、優(yōu)良的生物降解性、制備方法簡單和低廉的價(jià)格等優(yōu)點(diǎn)[3]。組織工程中控制水凝膠的形狀至關(guān)重要，因?yàn)榧?xì)胞間的相互作用在形狀一定的水凝膠微環(huán)境中才得以實(shí)現(xiàn)[4]。目前，制備海藻酸鈣水凝膠的常用方法有乳化法、微模塑法、微流控紡絲法等，但這些方法都無法控制Ca2+的釋放數(shù)量和釋放位置，更不能準(zhǔn)確控制水凝膠的形狀、大小，因此常采用電沉積法制備不同形狀結(jié)構(gòu)的水凝膠[5～7]。電沉積法可以通過調(diào)節(jié)電壓大小、電極形狀、電沉積時(shí)間等因素來控制Ca2+的釋放[8]。

與傳統(tǒng)的在驅(qū)動(dòng)電極上生成水凝膠的單電極電沉積法不同，雙極電化學(xué)法制備海藻酸鈣水凝膠原理是：當(dāng)1個(gè)導(dǎo)體置于2個(gè)驅(qū)動(dòng)電極之間且場強(qiáng)足夠大時(shí)發(fā)生極化，在導(dǎo)體兩端會(huì)產(chǎn)生電化學(xué)反應(yīng)。雙極電化學(xué)法在傳感器、微納米機(jī)器人、材料科學(xué)等領(lǐng)域已逐步得到應(yīng)用[9～11]，例如，基于金屬雙電極的傳感裝置的制備[12]、利用電擊法控制化學(xué)反應(yīng)和產(chǎn)物的生成[13]等。在生物工程領(lǐng)域，應(yīng)用雙極電化學(xué)法進(jìn)行體外支架構(gòu)建的研究才開始起步，這種方法具有靈活性高、成本低、可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，有深入研究的必要。

本文提出了一種基于雙極電化學(xué)法制備海藻酸鈣水凝膠的方法，使用光刻技術(shù)制造出圓形、橢圓形、齒輪形和六邊形的雙極電極(Bipolar electrode，BPE)，通過控制驅(qū)動(dòng)電極的電壓、間距進(jìn)而控制Ca2+的釋放速率，達(dá)到定量、準(zhǔn)確制備水凝膠的效果。此外，本文還建立了基于雙極電化學(xué)法的海藻酸鈣水凝膠高度生長模型，分析了影響海藻酸鈣水凝膠生成高度的關(guān)鍵因素。最后，在制備出的圖案化海藻酸鈣水凝膠支架中培養(yǎng)Hepa 1-6 小鼠肝癌細(xì)胞，驗(yàn)證該方法的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

海藻酸鈉：黏度1.05～1.15 Pa·s，天津市福晨化學(xué)試劑廠；碳酸鈣(CaCO3)、無水氯化鈣(CaCl2)、氫氧化鈉、醫(yī)用消毒酒精、無水乙醇、丙酮：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；光刻膠：AZ5214，蘇州研材微納科技有限公司；磷酸緩沖液(PBS)、完全培養(yǎng)基:上海中喬新舟生物科技有限公司；活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染色試劑盒：上海翊圣生物科技有限公司。

滅菌培養(yǎng)瓶：上海柏根生物科技有限公司；直流電源：LP305DE，深圳市樂達(dá)精密工具有限公司；勻膠機(jī)(手動(dòng)型)：KW-4A，北京市賽德凱斯電子有限公司；生物光學(xué)顯微鏡(帶熒光組件)：OLYMPUSCKX53，廣州市明美光電技術(shù)有限公司；鉑(Pt)片電極：北京市中華儀器有限公司；ITO 導(dǎo)電玻璃：洛陽市古洛玻璃有限公司；定制掩模板：長沙韶光鉻版有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材消毒處理

為了防止細(xì)菌與灰塵等污染實(shí)驗(yàn)器材、影響細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，稱取氫氧化鈉20 g，用定量移液管吸取無水乙醇75 mL和丙酮5 mL，加入培養(yǎng)瓶配置100 mL清洗液。使用一次性棉片蘸取清洗液擦拭磁力攪拌器、鉑片、直流電源表面，再用75%的醫(yī)用消毒酒精擦拭，清除表面殘留的清洗液。最后，用酒精棉片擦干實(shí)驗(yàn)器材，置于超凈臺(tái)上紫外線照射10 min，保證其無菌狀態(tài)。

1.3 實(shí)驗(yàn)溶液配置

首先配置電沉積溶液。稱取0.50 g 的海藻酸鈉粉末和0.25 g 的CaCO3粉末，倒入無菌培養(yǎng)瓶并用玻璃棒攪拌。將裝有粉末試劑的無菌培養(yǎng)瓶置于磁力攪拌器中，設(shè)置攪拌溫度為37 ℃、攪拌速度為400 r/min、攪拌時(shí)間為24 h。最后，取10 g 氫氧化鈉粉末加入攪拌后的溶液中并用玻璃棒再次攪拌，調(diào)至溶液

pH=7.3。

然后配置氯化鈣溶液。取培養(yǎng)瓶裝取100 mL超純水。用電子分析天平稱取1.1 g 無水氯化鈣顆粒，加入培養(yǎng)瓶中并用玻璃棒充分?jǐn)嚢?，得到濃?.1%的CaCl2溶液。將配好的CaCl2溶液與電沉積溶液放在超凈臺(tái)上紫外線照射10 min，保證其無菌狀態(tài)。

1.4 圖案化BPE制備流程

由于用雙極電化學(xué)法制備水凝膠時(shí)，水凝膠會(huì)在BPE 上沉積。因此，可以通過控制BPE 上的圖案來控制海藻酸鈣水凝膠的沉積形狀。本文利用氧化銦錫(Indium tin oxide,ITO)導(dǎo)電玻璃進(jìn)行光刻制作圖案化BPE，其具體制作流程如Fig.1所示。

Fig.1 Flow chart fabrication of microelectrode by photolithography

Fig.2 Patterned electrodes on ITO glass

首先，將絕緣的光刻膠滴加在ITO導(dǎo)電玻璃上，用勻膠機(jī)均勻涂抹；然后，蓋上印有圖案的掩模板，用紫外燈照射10 s 左右，未被掩模板蓋住的光刻膠可溶性改變，放入110 ℃的烤箱中固化5 min；最后，將覆有光刻膠的ITO 玻璃置于顯影液中，被紫外燈照射的光刻膠與顯影液發(fā)生反應(yīng)被溶解，即可在ITO 玻璃上留下特定形狀的BPE。本實(shí)驗(yàn)定制了不同大小的圓形、六邊形、齒輪等形狀的掩膜板，用光刻法做出如Fig.2所示的BPE。

1.5 雙極電化學(xué)法原理

當(dāng)直流電源接通后，浸入溶液中的導(dǎo)電物體會(huì)產(chǎn)生電勢(shì)差，在該導(dǎo)體上同時(shí)發(fā)生氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)，于是稱這種導(dǎo)體為BPE[14，15]。本文采用雙極電化學(xué)法制備形狀可控的水凝膠實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)包括鉑片電極、電沉積溶液和BPE。Fig.3 所示是一種典型的雙極電化學(xué)法的原理圖。將BPE 放在電解液中，在驅(qū)動(dòng)電極之間施加電壓，其化學(xué)反應(yīng)如Fig.3所示。

首先，隨著施加直流電壓，在BPE靠近陰極端的溶液中的水發(fā)生電解，生成氫離子：

然后，氫離子與碳酸鈣反應(yīng)生成鈣離子并釋放二氧化碳：

Fig.3 Schematic diagram of the bipolar electrochemical method

最后，釋放的鈣離子與溶液中的海藻酸根離子發(fā)生離子交聯(lián)反應(yīng)生成海藻酸鈣水凝膠：根據(jù)式（1）～（3）可知，水凝膠的沉積量會(huì)隨著發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)時(shí)間的變化而變化。

1.6 細(xì)胞活性檢測(cè)準(zhǔn)備

將存活率相對(duì)較高、價(jià)格便宜的Hepa 1-6小鼠肝癌細(xì)胞(上海中喬新舟生物科技有限公司)接種到25 cm2無菌培養(yǎng)瓶中，并置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，當(dāng)培養(yǎng)至密度約為90%時(shí)可用。在培養(yǎng)瓶中加入胰酶，用滅菌膠頭滴管輕輕吹打使細(xì)胞分散，得到密度為(4.0～6.0) × 106mL-1混合均勻的細(xì)胞懸液。最后，將適量的電沉積溶液(海藻酸鈉1%g/mL；Ca-CO30.5%g/mL)加入細(xì)胞懸液中，得到的細(xì)胞密度約為(1.0～2.0)×104mL-1。

1.7 水凝膠高度生長模型建立

Fig.4為本實(shí)驗(yàn)用于進(jìn)行基于雙極電化學(xué)法的海藻酸鈣水凝膠沉積的裝置圖，實(shí)驗(yàn)裝置包括直流電源、2 個(gè)10 mm×20 mm 的鉑片驅(qū)動(dòng)電極、20 mm×20 mm×2 mm 的ITO 玻璃制作的BPE 和裝有電沉積溶液的培養(yǎng)皿。

為建立基于雙極電化學(xué)法的海藻酸鈣水凝膠高度生長模型，對(duì)溶液中的電勢(shì)差進(jìn)行分析，如Fig.5所示，ΔEelec代表了形成水凝膠所需的BPE 兩端電位差，由式(4)求得

式中：Etot—驅(qū)動(dòng)電極的外加電壓值(直流電源電壓)；lbipo—BPE 長度；ltot—驅(qū)動(dòng)電極間距。將整個(gè)雙極電化學(xué)反應(yīng)的系統(tǒng)等效為如Fig.6 所示的閉合電路，R4與R0的值滿足式(5)

Fig.4 Diagram of the experimental device

Fig.5 Solution potential of the system

其中，2個(gè)驅(qū)動(dòng)電極與電沉積溶液間的界面可以分別等效為RC電路，R1和R2分別為ITO 玻璃與兩驅(qū)動(dòng)電極間溶液的內(nèi)阻，R3為電解質(zhì)溶液(在BPE 范圍)的內(nèi)阻，R0是總電路中的其他電阻之和(包括電源內(nèi)阻，電極與電解液間的電阻)。E0為電解液的反電動(dòng)勢(shì),R4兩端電壓等效為BPE 分到的電壓，I為回路中的總電流，I1和I2等效為ITO玻璃與兩驅(qū)動(dòng)電極間的電流。通過計(jì)算可得：

Fig.6 Equivalentelectriccircuitofthebipolar electrochemistrysystem

式中：U0—陽極-溶液和陰極-溶液的界面電容引起的壓降，與E0相比可以忽略不計(jì)；U1，U2—C1與C2兩端的電壓。

在BPE 長度lbipo=20 mm、驅(qū)動(dòng)電極間距l(xiāng)tot=30 mm的實(shí)驗(yàn)條件下，每隔20 s分別測(cè)量12 V，12.5 V，13 V電壓下閉合電路中的電流值，如Fig.7中的散點(diǎn)所示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著電壓增強(qiáng)，電流也逐漸增強(qiáng)；且在最開始通電時(shí)電流強(qiáng)度最大，隨著時(shí)間延長，電流逐漸減小并趨于平穩(wěn)。這是因?yàn)椋S著電化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行，陽極極板上沉積了一層致密的水凝膠且溶液中Ca2+濃度降低，反應(yīng)速率下降，與式(10)中推導(dǎo)出的閉合回路中電流的表達(dá)式相符。

根據(jù)t=0s 時(shí)測(cè)量得到的電流值It1=6.60μA(Etot1=12 V)，It2=7.03μA(Etot2=12.5 V)，首先可以計(jì)算出通電瞬間電解液的反電動(dòng)勢(shì)(E0)。將通電瞬間的等效電路視為短路，E0可通過式(7)計(jì)算

得E0=2.919 V。

求解式(6)可以推導(dǎo)出等效電路閉合回路中總電流(I)的表達(dá)式

在直流電源電壓分別為12 V，12.5 V時(shí)，經(jīng)過擬合得到的電流值與時(shí)間的關(guān)系

由式(9)和式(10)可分別求得2 組R(R1,R2)和2組C(C1,C2)的值，取平均值作為最終的結(jié)果，具體參數(shù)如Tab.1所示。

Tab.1 Parameters achieved by curve fitting and the decided value for parameters in built circuit model

將求出的參數(shù)代入式(8)可以得到在兩極間電壓強(qiáng)度不同時(shí)，閉合回路中的電流隨時(shí)間變化的關(guān)系式

繪制出電壓分別為12 V，12.5 V和13 V時(shí)，根據(jù)式（11）計(jì)算所得的電流隨時(shí)間變化的曲線，如Fig.7

中虛線所示；繪制出12 V，12.5 V和13 V下測(cè)量值的散點(diǎn)圖與擬合曲線作對(duì)比。求得3種電壓下測(cè)量值的擬合曲線與計(jì)算所得曲線之間的絕對(duì)平均誤差分別為ε12.0=0.533,ε12.5=0.790,ε13.0=0.741，由此可以看出，預(yù)測(cè)電流與測(cè)量電流之間的整體匹配度較高，但由于等效電路中沒有考慮包括電感在內(nèi)的其他影響因素，某些時(shí)間段內(nèi)的預(yù)測(cè)值有一定偏差。

Fig.7 Measurements and the calculated curves at different voltages

由于水凝膠的沉積量與生成的H+數(shù)成正比，而H+的生成數(shù)又與電荷量成正比，故水凝膠的沉積量與電荷量也成正比

式中：ρ—海藻酸鈣水凝膠的密度；S—發(fā)生反應(yīng)的雙電極區(qū)域面積；h—生成水凝膠的高度；k—常數(shù)；Q—電荷量。水凝膠的生長高度表達(dá)式為

式(11)可看作將回路中的電流值等效成2 個(gè)電容器充電電流之和，即法拉第電流和非法拉第電流，然而，其中只有法拉第電流用于海藻酸鈣水凝膠的沉積。電容器C2的充電電流不會(huì)通過電解液，因此，電容器C1的充電電流決定了水凝膠的形成。故水凝膠的高度可表示為

式中：a—比例系數(shù)；a=k/Sρ由水凝膠的沉積區(qū)域面積和水凝膠密度決定。

分析最終建立的水凝膠高度模型可以看出，水凝膠的高度與直流電源電壓、驅(qū)動(dòng)電極間距與BPE的長度比值、電化學(xué)反應(yīng)時(shí)間這幾種參數(shù)密切相關(guān)。為了確定比例系數(shù)a的值，在2 個(gè)電壓(12 V,12.5 V)時(shí)，分別利用MATLAB軟件計(jì)算a的值(a12V=204.7，a12.5V=220.3)，取平均值a=212.5 作為最終結(jié)果，所以水凝膠的高度表達(dá)式為

2 結(jié)果與討論

2.1 雙極電化學(xué)法制備水凝膠

在直流電源電壓12.5 V，BPE 的長度與極板間距比值（）為2/3(極板間距為30 mm)，電化學(xué)反應(yīng)時(shí)間為50 s 時(shí)，基于雙極電化學(xué)法制備出的海藻酸鈣水凝膠如Fig.8(a)和Fig.8(b)所示，僅沉積在圖案化的BPE區(qū)域，且所制備的圖案化水凝膠高度平整，密度較為均勻，由于反應(yīng)生成了CO2氣體，水凝膠中包含了氣泡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙極電化學(xué)法制備海藻酸鈣水凝膠可以有效地控制水凝膠的沉積形狀，通過使用不同圖案的BPE就能夠制備出特定形狀與尺寸的海藻酸鈣水凝膠。此外，使用定制的陣列化圖案的掩模板制備出如Fig.8(c)所示的圖案化水凝膠陣列，正方形為ITO 玻璃，它的表面是一層光刻膠，只在圖案處沉積了薄薄的水凝膠。Fig.8(d)清楚地顯示出通過雙極電化學(xué)法制備的水凝膠高度，為探究測(cè)得的高度參數(shù)與影響高度的實(shí)驗(yàn)參數(shù)之間的關(guān)系做準(zhǔn)備。

Fig.8 Calcium alginate hydrogel with different shapes

2.2 實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)水凝膠高度的影響

根據(jù)雙極電化學(xué)法制備水凝膠的生長模型可知，水凝膠的生長高度與直流電源的電壓(Etot)、反應(yīng)時(shí)間(t)、BPE 長度與極板間距之比()的大小有關(guān)：當(dāng)Etot與一定時(shí)，e-t與h成反比；當(dāng)Etot與t一定時(shí)，與h成正比；當(dāng)與t一定時(shí)，Etot與h成正比。為驗(yàn)證水凝膠的高度生長模型的可靠性并探究各參數(shù)對(duì)高度生長的影響，利用控制變量原則，針對(duì)不同直流電源電壓、不同電化學(xué)反應(yīng)時(shí)間以及不同條件對(duì)水凝膠沉積的影響展開實(shí)驗(yàn)。圖中的“工”形為誤差棒，上下限分別為5 次實(shí)驗(yàn)中的最大和最小值，圓點(diǎn)為相同實(shí)驗(yàn)條件下5次測(cè)量數(shù)據(jù)的平均值。

2.2.1 直流電源電壓：為了研究不同直流電源電壓對(duì)水凝膠高度的影響，（考慮到水凝膠需要包埋Hepa 1-6小鼠肝癌細(xì)胞），電壓不宜過大。在BPE的長度與極板間距比值為2/3、電化學(xué)反應(yīng)時(shí)間為50 s、在直流電源電壓分別為12 V，12.5 V，13 V，13.5 V時(shí)，制備了圖案化海藻酸鈣水凝膠，并觀察水凝膠的沉積效果。其中一組如Fig.9(a)所示，其厚度根據(jù)像素比例計(jì)算得出。如Fig.9(b)所示，實(shí)驗(yàn)值與根據(jù)高度模型繪制的直線誤差在5%以內(nèi)。由此可以看出，在一定電壓范圍內(nèi)，水凝膠高度隨著直流電源電壓的增加而增加。這是由于電壓越大，BPE 上的電壓也越大，BPE 與驅(qū)動(dòng)電極陽極之間的電勢(shì)差也隨之增加。這就導(dǎo)致電解水反應(yīng)更加劇烈，產(chǎn)生了更多的H+，從而使電解液中未溶解的CaCO3納米顆粒釋放出的Ca2+總量增加。釋放的Ca2+與海藻酸根離子發(fā)生離子交聯(lián)反應(yīng)，致使水凝膠高度增加，這與生長模型的規(guī)律也是符合的。

Fig.9 (a)Height chart of hydrogel at different voltages;(b)comparison of measured and predicted values

Fig.10 (a)Height chart of hydrogel at different time;(b)comparison of measured and predicted values

2.2.2 電化學(xué)反應(yīng)時(shí)間：為研究不同電化學(xué)反應(yīng)時(shí)間與水凝膠高度的關(guān)系，在BPE 的長度與極板間距比值()為2/3、直流電源電壓為13 V時(shí)，分別測(cè)量時(shí)間為20 s，40 s，60 s，80 s，100 s，200 s 在BPE 圖案上海藻酸鈣水凝膠的沉積高度，其中一組的實(shí)驗(yàn)效果如Fig.10(a)所示。如Fig.10(b)所示，實(shí)驗(yàn)值與根據(jù)高度模型計(jì)算得到曲線之間的誤差在5%以內(nèi)。由此看出，在一定時(shí)間范圍內(nèi)水凝膠的沉積高度隨著時(shí)間的延長而增加。這是因?yàn)殡娀瘜W(xué)反應(yīng)時(shí)間越長，溶液中電解產(chǎn)生的H+數(shù)量更多，從而促使水凝膠沉積量增加。不過隨著時(shí)間延長，水凝膠會(huì)由體積增加為主轉(zhuǎn)向密度增加為主，所以隨著時(shí)間延長，水凝膠高度的增長速率逐漸降低。

Fig.11 (a)Height chart of hydrogel at different ratios of BPE length to Pt plate spacing;(b)comparison of measured and predicted values

2.3 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)

為檢測(cè)海藻酸鈣水凝膠支架中細(xì)胞的存活率，本文采用Calcein-AM/PI 活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染色試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)給細(xì)胞染色，染色試劑溶液中的鈣黃綠素(AM)和碘化丙啶(PI)的濃度分別為2μmol/L 和4.5μmol/L。將包埋細(xì)胞的海藻酸鈣水凝膠均分為6組，置于溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)0 h，4 h，8 h，12 h，16 h和20 h。將熒光顯微鏡波長設(shè)置為490 nm觀察染色細(xì)胞的熒光圖像Fig.12(a)，其中紅色熒光細(xì)胞為死細(xì)胞，綠色熒光細(xì)胞為活細(xì)胞。對(duì)各個(gè)時(shí)間熒光圖像通過ImageJ 軟件計(jì)算活細(xì)胞的數(shù)量，即計(jì)算熒光圖像中綠色通道中的像素?cái)?shù)獲得活細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而求得細(xì)胞存活率，如Fig.12(b)所示，前8 h 隨著時(shí)間增長，海藻酸鈣水凝膠支架中的細(xì)胞存活率下降緩慢，8 h 后細(xì)胞存活率逐漸趨于穩(wěn)定，在20 h 時(shí)測(cè)得細(xì)胞存活率大于80%。

Fig.12 (a)Cell-encapsulated alginate gel staining results using calcein-AM and propidium iodide at 0 h,4 h,8 h,12 h,16 h,and 20 h;(b)average cell viability in the patterned hydrogel

3 結(jié)論

本文提出了一種制備特定形狀和尺寸的海藻酸鈣水凝膠微支架的新方法。通過光刻法制備圖案化BPE，利用雙極電化學(xué)法在BPE上沉積圓形、齒輪形的水凝膠。然后，通過建立等效電路推導(dǎo)出海藻酸鈣水凝膠的生長模型，分析影響成膠高度的主要參數(shù)，得到高度模型與實(shí)際測(cè)量值之間的誤差在5%以內(nèi)。然后在直流電源電壓為12.5 V，驅(qū)動(dòng)電極間距為30 mm，電化學(xué)反應(yīng)時(shí)間為50 s時(shí)，制備出圓形和齒輪形的水凝膠支架及水凝膠陣列。最后，成功將Hepa1-6 小鼠肝癌細(xì)胞包埋在基于雙極電化學(xué)法制備的海藻酸鈣水凝膠支架中，檢測(cè)20 h后Hepa1-6小鼠肝癌細(xì)胞的存活率大于80%。

使用該方法制備海藻酸鈣水凝膠支架具有成本低、可控性強(qiáng)、細(xì)胞存活率較高的優(yōu)點(diǎn)，在體外構(gòu)建人工組織器官方向顯示出了廣闊的應(yīng)用前景，為生物醫(yī)學(xué)與組織工程學(xué)領(lǐng)域提供了新的研究思路。