嚴京哲，梁衍濤，袁 勇，周 莉

吉林省腫瘤醫(yī)院1.腹部腫瘤二科；2.骨及軟組織腫瘤外科；3.婦瘤二科，吉林 長春 130021

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，早期多無明顯癥狀，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已處于晚期。卵巢上皮性癌5年生存率低，預后不理想[1]。實質性腫瘤存在缺氧微環(huán)境，缺氧狀態(tài)會促進腫瘤進展[2-3]。缺氧能夠通過上調缺氧誘導因子-1α表達，激活其下游蛋白轉錄[4-5]，抑制缺氧誘導的下游蛋白轉錄可能會成為治療腫瘤的熱點。親環(huán)素是高度保守的多蛋白家族，親環(huán)素A(Cyclophilin A，CypA)具有肽基脯氨酰基順反異構酶活性[6-7]。有研究報道，缺氧環(huán)境可誘導腫瘤細胞CypA表達升高[8]，而CypA與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移及耐藥等均具有一定相關性[9-13]。本研究旨在探討缺氧誘導人卵巢癌OVCAR3細胞CypA表達水平的變化及其臨床意義?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及培養(yǎng) 人卵巢漿液腺癌OVCAR3細胞購于上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司。在OVCAR3細胞中加入DMEM培養(yǎng)液(高糖型，含10%無菌小牛血清)中，將其置于5%CO2、37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)。缺氧環(huán)境條件設置：將對數(shù)生長期的人卵巢癌OVCAR3細胞置于Bactron厭氧室，37℃、1%O2、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)0、3、6、12、24 h。

1.2 CypA mRNA測定 采用RT-PCR法測定CypA mRNA，提取細胞總RNA，轉錄為cDNA，以PCR擴增。CypA引物序列：上游5′-GCAAGCTTACCATGGTCAACCCCACC-3′，下游5′-GCGGATCCGAGTTGTCCACAGTCGGA-3′。內(nèi)參照選擇GAPDH。以1%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad 4.6.2版)分析結果。采用2-△△Ct法計算CypA相對表達量。

1.3 小干擾RNA應用 以CypA基因為靶點的CypA-siRNA(CypA-siRNA組)和control-siRNA(control-siRNA組)均由Eurogene Tech公司合成[CypA-siRNA(sense，5′-UGACUUCACACGCCAUAAUdTdT-3′；antisense，5′-AUUAUGGCGUGUGAAGUCAdTdT-3′)；control-siRNA(universal negative control)]。

1.4 轉染 胰酶消化對數(shù)生長期的人卵巢癌OVCAR3細胞，接種于DMEM培養(yǎng)基的12孔板中，每孔2×104個細胞，置于37℃、5%CO2孵箱中。培養(yǎng)24 h，待匯合率達70%后，以GenePORTER Transfection Reagent將CypA-siRNA和control-siRNA轉染，轉染后置于缺氧環(huán)境(37℃、1%O2、5%CO2)培養(yǎng)48 h。同時，設置對照組，細胞缺氧環(huán)境培養(yǎng)48 h，不轉染。采用Western Blot法觀察RNA干擾情況。

1.5 Western Blot法檢測OVCAR3細胞CypA蛋白表達 收集細胞后，用預冷PBS溶液進行洗滌，加入細胞裂解液，提取總蛋白。蛋白樣品用10% SDS-PAGE分離等量后，將其轉移至PVDF膜上，1.5%牛血清蛋白(BSA)封閉后4℃過夜，加一抗(1∶800)后室溫孵育2 h，再將二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。ECL顯色，系統(tǒng)定量采用Bio-Rad凝膠分析對蛋白表達灰度值進行計算。

1.6 MTT比色法測定細胞增殖 在轉染后置于缺氧環(huán)境培養(yǎng)48 h的OVCAR3細胞12孔板的每孔中加入MTT培養(yǎng)液1 ml，培養(yǎng)1 h。再在每孔中加入150 μl DMSO，振蕩sd10 min，595 nm波長下采用Bio-Rad酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度，取3孔平均值。

2 結果

2.1 缺氧環(huán)境下培養(yǎng)OVCAR3細胞各時間點CypA mRNA表達水平比較 缺氧環(huán)境下培養(yǎng)OVCAR3細胞3 h后CypA mRNA表達開始上調，24 h表達水平最高，培養(yǎng)3、6、12、24 h時的CypA mRNA表達水平均高于培養(yǎng)0 h時(P<0.05)。見圖1。

圖1 缺氧環(huán)境下培養(yǎng)OVCAR3細胞各時間點CypA mRNA表達水平比較

2.2 缺氧環(huán)境下培養(yǎng)OVCAR3細胞各時間點CypA蛋白表達水平比較 缺氧環(huán)境下培養(yǎng)OVCAR3細胞3 h后CypA蛋白表達開始上調，24 h表達水平最高，培養(yǎng)3、6、12、24 h時的CypA蛋白表達水平均高于培養(yǎng)0 h時(P<0.05)。見圖2。

圖2 缺氧環(huán)境下培養(yǎng)OVCAR3細胞各時間點CypA蛋白表達水平比較

2.3 CypA-siRNA和control-siRNA對OVCAR3細胞增殖和CypA蛋白表達影響 與對照組比較：control-siRNA組CypA蛋白表達無明顯變化(P>0.05)，CypA-siRNA組CypA蛋白未表達(P<0.05)；control-siRNA組OVCAR3細胞增殖無明顯變化(P>0.05)，CypA-siRNA組OVCAR3細胞增殖明顯降低(P<0.05)。見圖3～4。

圖3 CypA-siRNA和control-siRNA對OVCAR3細胞CypA蛋白表達影響 圖4 CypA-siRNA和control-siRNA對OVCAR3細胞增殖影響

3 討論

缺氧是中晚期實體腫瘤的普遍特征，缺氧狀態(tài)有利于腫瘤進展。缺氧誘導因子-1α是一種低氧誘導因子，能夠促進糖降解和血管生成等，且可被低氧誘導[14]。缺氧反應元件是主要位于DNA序列目的基因的一種核苷酸序列，缺氧誘導因子-1α能夠與其特異性結合，在缺氧狀態(tài)下促進目的基因轉錄。多項研究顯示，人類癌細胞在缺氧環(huán)境下能夠上調缺氧誘導因子-1α表達[4-5]，缺氧誘導因子-1α表達上調能夠在轉錄水平提高CypA mRNA表達，進而提高CypA蛋白表達，CypA蛋白表達越高，活性氧生成能力越低，活性氧對腫瘤的殺傷作用越弱。CypA在胰腺癌細胞[9]、肺癌[10-11]、大腸癌[13]等多種腫瘤細胞中均高表達，CypA蛋白與上述腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展密切相關。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中CypA蛋白的表達在胰腺癌的生長、侵潤、轉移中發(fā)揮重要作用[15-16]。

本研究結果顯示：缺氧環(huán)境下培養(yǎng)3、6、12、24 h時的CypA mRNA和CypA蛋白表達水平均高于培養(yǎng)0 h時(P<0.05)；與對照組比較，control-siRNA組OVCAR3細胞增殖和CypA蛋白表達無明顯變化(P>0.05)，CypA-siRNA組OVCAR3細胞增殖明顯降低(P<0.05)且CypA蛋白未表達(P<0.05)。即缺氧環(huán)境能夠快速上調OVCAR3細胞的CypA mRNA和CypA蛋白表達水平，抑制CypA mRNA表達可降低OVCAR3細胞對抗缺氧等不利環(huán)境的應急能力。

綜上所述，CypA在人卵巢癌組織中的高表達與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展存在一定關聯(lián)，其對于揭示卵巢癌發(fā)病機制、開發(fā)藥物靶標等具有重要意義。