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        缺氧誘導人卵巢癌OVCAR3細胞親環(huán)素A表達水平變化及其臨床意義

        2022-05-14 08:09:20嚴京哲梁衍濤
        臨床軍醫(yī)雜志 2022年4期
        關鍵詞:環(huán)境水平

        嚴京哲,梁衍濤,袁 勇,周 莉

        吉林省腫瘤醫(yī)院1.腹部腫瘤二科;2.骨及軟組織腫瘤外科;3.婦瘤二科,吉林 長春 130021

        卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤,早期多無明顯癥狀,大部分患者發(fā)現(xiàn)時已處于晚期。卵巢上皮性癌5年生存率低,預后不理想[1]。實質性腫瘤存在缺氧微環(huán)境,缺氧狀態(tài)會促進腫瘤進展[2-3]。缺氧能夠通過上調缺氧誘導因子-1α表達,激活其下游蛋白轉錄[4-5],抑制缺氧誘導的下游蛋白轉錄可能會成為治療腫瘤的熱點。親環(huán)素是高度保守的多蛋白家族,親環(huán)素A(Cyclophilin A,CypA)具有肽基脯氨酰基順反異構酶活性[6-7]。有研究報道,缺氧環(huán)境可誘導腫瘤細胞CypA表達升高[8],而CypA與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移及耐藥等均具有一定相關性[9-13]。本研究旨在探討缺氧誘導人卵巢癌OVCAR3細胞CypA表達水平的變化及其臨床意義?,F(xiàn)報道如下。

        1 材料與方法

        1.1 細胞來源及培養(yǎng) 人卵巢漿液腺癌OVCAR3細胞購于上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司。在OVCAR3細胞中加入DMEM培養(yǎng)液(高糖型,含10%無菌小牛血清)中,將其置于5%CO2、37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)。缺氧環(huán)境條件設置:將對數(shù)生長期的人卵巢癌OVCAR3細胞置于Bactron厭氧室,37℃、1%O2、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)0、3、6、12、24 h。

        1.2 CypA mRNA測定 采用RT-PCR法測定CypA mRNA,提取細胞總RNA,轉錄為cDNA,以PCR擴增。CypA引物序列:上游5′-GCAAGCTTACCATGGTCAACCCCACC-3′,下游5′-GCGGATCCGAGTTGTCCACAGTCGGA-3′。內(nèi)參照選擇GAPDH。以1%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物,采用凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad 4.6.2版)分析結果。采用2-△△Ct法計算CypA相對表達量。

        1.3 小干擾RNA應用 以CypA基因為靶點的CypA-siRNA(CypA-siRNA組)和control-siRNA(control-siRNA組)均由Eurogene Tech公司合成[CypA-siRNA(sense,5′-UGACUUCACACGCCAUAAUdTdT-3′;antisense,5′-AUUAUGGCGUGUGAAGUCAdTdT-3′);control-siRNA(universal negative control)]。

        1.4 轉染 胰酶消化對數(shù)生長期的人卵巢癌OVCAR3細胞,接種于DMEM培養(yǎng)基的12孔板中,每孔2×104個細胞,置于37℃、5%CO2孵箱中。培養(yǎng)24 h,待匯合率達70%后,以GenePORTER Transfection Reagent將CypA-siRNA和control-siRNA轉染,轉染后置于缺氧環(huán)境(37℃、1%O2、5%CO2)培養(yǎng)48 h。同時,設置對照組,細胞缺氧環(huán)境培養(yǎng)48 h,不轉染。采用Western Blot法觀察RNA干擾情況。

        1.5 Western Blot法檢測OVCAR3細胞CypA蛋白表達 收集細胞后,用預冷PBS溶液進行洗滌,加入細胞裂解液,提取總蛋白。蛋白樣品用10% SDS-PAGE分離等量后,將其轉移至PVDF膜上,1.5%牛血清蛋白(BSA)封閉后4℃過夜,加一抗(1∶800)后室溫孵育2 h,再將二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。ECL顯色,系統(tǒng)定量采用Bio-Rad凝膠分析對蛋白表達灰度值進行計算。

        1.6 MTT比色法測定細胞增殖 在轉染后置于缺氧環(huán)境培養(yǎng)48 h的OVCAR3細胞12孔板的每孔中加入MTT培養(yǎng)液1 ml,培養(yǎng)1 h。再在每孔中加入150 μl DMSO,振蕩sd10 min,595 nm波長下采用Bio-Rad酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度,取3孔平均值。

        2 結果

        2.1 缺氧環(huán)境下培養(yǎng)OVCAR3細胞各時間點CypA mRNA表達水平比較 缺氧環(huán)境下培養(yǎng)OVCAR3細胞3 h后CypA mRNA表達開始上調,24 h表達水平最高,培養(yǎng)3、6、12、24 h時的CypA mRNA表達水平均高于培養(yǎng)0 h時(P<0.05)。見圖1。

        圖1 缺氧環(huán)境下培養(yǎng)OVCAR3細胞各時間點CypA mRNA表達水平比較

        2.2 缺氧環(huán)境下培養(yǎng)OVCAR3細胞各時間點CypA蛋白表達水平比較 缺氧環(huán)境下培養(yǎng)OVCAR3細胞3 h后CypA蛋白表達開始上調,24 h表達水平最高,培養(yǎng)3、6、12、24 h時的CypA蛋白表達水平均高于培養(yǎng)0 h時(P<0.05)。見圖2。

        圖2 缺氧環(huán)境下培養(yǎng)OVCAR3細胞各時間點CypA蛋白表達水平比較

        2.3 CypA-siRNA和control-siRNA對OVCAR3細胞增殖和CypA蛋白表達影響 與對照組比較:control-siRNA組CypA蛋白表達無明顯變化(P>0.05),CypA-siRNA組CypA蛋白未表達(P<0.05);control-siRNA組OVCAR3細胞增殖無明顯變化(P>0.05),CypA-siRNA組OVCAR3細胞增殖明顯降低(P<0.05)。見圖3~4。

        圖3 CypA-siRNA和control-siRNA對OVCAR3細胞CypA蛋白表達影響 圖4 CypA-siRNA和control-siRNA對OVCAR3細胞增殖影響

        3 討論

        缺氧是中晚期實體腫瘤的普遍特征,缺氧狀態(tài)有利于腫瘤進展。缺氧誘導因子-1α是一種低氧誘導因子,能夠促進糖降解和血管生成等,且可被低氧誘導[14]。缺氧反應元件是主要位于DNA序列目的基因的一種核苷酸序列,缺氧誘導因子-1α能夠與其特異性結合,在缺氧狀態(tài)下促進目的基因轉錄。多項研究顯示,人類癌細胞在缺氧環(huán)境下能夠上調缺氧誘導因子-1α表達[4-5],缺氧誘導因子-1α表達上調能夠在轉錄水平提高CypA mRNA表達,進而提高CypA蛋白表達,CypA蛋白表達越高,活性氧生成能力越低,活性氧對腫瘤的殺傷作用越弱。CypA在胰腺癌細胞[9]、肺癌[10-11]、大腸癌[13]等多種腫瘤細胞中均高表達,CypA蛋白與上述腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展密切相關。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn),胰腺癌組織中CypA蛋白的表達在胰腺癌的生長、侵潤、轉移中發(fā)揮重要作用[15-16]。

        本研究結果顯示:缺氧環(huán)境下培養(yǎng)3、6、12、24 h時的CypA mRNA和CypA蛋白表達水平均高于培養(yǎng)0 h時(P<0.05);與對照組比較,control-siRNA組OVCAR3細胞增殖和CypA蛋白表達無明顯變化(P>0.05),CypA-siRNA組OVCAR3細胞增殖明顯降低(P<0.05)且CypA蛋白未表達(P<0.05)。即缺氧環(huán)境能夠快速上調OVCAR3細胞的CypA mRNA和CypA蛋白表達水平,抑制CypA mRNA表達可降低OVCAR3細胞對抗缺氧等不利環(huán)境的應急能力。

        綜上所述,CypA在人卵巢癌組織中的高表達與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展存在一定關聯(lián),其對于揭示卵巢癌發(fā)病機制、開發(fā)藥物靶標等具有重要意義。

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