楊志文，阿古達(dá)木，韓怡茹，烏新林

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 胃腸外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010

結(jié)直腸癌是全球第3大常見(jiàn)惡性腫瘤，也是第4大癌癥死亡原因[1]。一旦早期確診，手術(shù)是結(jié)直腸癌患者的首選治療方法[2]；復(fù)發(fā)并發(fā)展至晚期時(shí)，輔助化療可以緩解腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[3]。然而，上述治療手段并未取得預(yù)期的成功[4]。目前，針對(duì)原癌基因或抑癌基因的靶向治療也得到了發(fā)展，但治療效果十分有限[5]。因此，不斷探索與結(jié)直腸癌進(jìn)展有關(guān)的新的藥物靶點(diǎn)非常重要。MicroRNAs(miRNAs)是內(nèi)源性非編碼小RNA分子，通過(guò)與mRNAs結(jié)合介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)，參與各種生物過(guò)程的調(diào)控[6-7]。有研究報(bào)道，miR-494-3p在多種癌癥的進(jìn)展中具有顯著特征，例如，在卵巢癌中表達(dá)下調(diào)可抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]，在骨肉瘤中通過(guò)抑制胰島素受體底物-1來(lái)阻止骨肉瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[9]。本研究旨在探討miR-494-3p/RRS1軸對(duì)結(jié)直腸癌的影響作用及機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院自2018年1月至2020年1月收治的192例結(jié)直腸癌患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)組織學(xué)或病理學(xué)確診為結(jié)直腸癌；血、肝、腎功能基本正常；同意進(jìn)行本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有精神疾病；合并其他器官功能損傷；采集標(biāo)本前經(jīng)過(guò)化療；患有嚴(yán)重感染性疾??；患有其他腫瘤。192例患者中，男性118例，女性74例；平均年齡(52.51±20.09)歲。收集患者的治療前癌組織及癌旁組織并保存于-80℃冰箱中。所有患者均簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。siRNA、miR-494-3p mimics、miR-494-3p inhibitor、RRS1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒均由南京金斯瑞設(shè)計(jì)和合成；人結(jié)直腸正常細(xì)胞株NCM460購(gòu)自深圳震科生物科技有限公司(貨號(hào)NCM460)；人結(jié)直腸癌細(xì)胞株RKO、HCT116、SW480、HT-29購(gòu)自Procell公司(貨號(hào)CL-0196、CL-0096、CL-0223、CL-0118)；Lipofectamine 2000購(gòu)自北京德航五洲科技有限公司(貨號(hào)VTY30520-1.5 ml)；Trizol試劑購(gòu)自艾德科技(北京)有限公司(貨號(hào)5301100)；超純RNA試劑盒購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司(貨號(hào)CW0581M)；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自北京沃格東方科技有限公司(貨號(hào)28025013)；SYBR試劑盒購(gòu)自深圳康體生命科技有限公司(貨號(hào)KTSM602)；雙熒光素酶報(bào)告試劑盒購(gòu)自百賽生物公司(貨號(hào)F6075S)；3-(4，5-二甲基-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購(gòu)自深圳市益百順科技有限公司(貨號(hào)IM0280-200 mg)；CDKN1A、CDC25C、p53[10]、MKI67、CDK1、RRS1抗體購(gòu)自abcam公司(貨號(hào)ab102013、ab32444、ab26、ab15580、ab133327、ab188161)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 人結(jié)直腸正常細(xì)胞株NCM460和人結(jié)直腸癌細(xì)胞株RKO、HCT116、SW480、HT-29在RPMI-1640培養(yǎng)基、37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。siRNA、miR-494-3p mimics、miR-494-3p inhibitor、RRS1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒均用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 RNA抽取與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 根據(jù)制造商說(shuō)明，用Trizol試劑和超純RNA試劑盒從指定的細(xì)胞中分離總RNA。用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄0.8 μg總RNA。采用SYBR法在實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)儀TP800上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)。引物序列為：RRS1正向，5′-ccctaccggaccagtaa-3′；RRS1反向，5′-CCGAAAAGGGGTTGAAACTTCC-3′；GAPDH正向，5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′；GAPDH反向，5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。RRS1相對(duì)表達(dá)歸一化為GAPDH，采用對(duì)比CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 細(xì)胞周期測(cè)定 用碘化丙啶染色的流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期進(jìn)展。將處理過(guò)的SW480細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)至80%融合。細(xì)胞核碘化丙啶染色分析細(xì)胞周期。碘化丙啶吸光度通過(guò)流式細(xì)胞儀上的熒光激活細(xì)胞分選來(lái)測(cè)定。

1.2.4 細(xì)胞增殖低水平測(cè)定 SW480細(xì)胞以2 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，在37℃下分別培養(yǎng)0、1、2 d。PBS洗滌2次后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)。孵育4 h后，取每孔上清，加入100 μl二甲基亞砜溶解甲氧嘧啶鹽。10 min后，用微版閱讀器在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量光密度。

1.2.5 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建野生型(wild type，WT)和突變型(mutant type，MT)熒光素酶報(bào)告載體，并用 Lipofectamine 2000將miR-494-3p mimics或相應(yīng)對(duì)照轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞中。2 d后，用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定系統(tǒng)對(duì)熒光素酶活性進(jìn)行量化。

1.2.6 免疫印跡 用細(xì)胞裂解緩沖液從SW480細(xì)胞中分離總蛋白，用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。總蛋白經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶在室溫下封膜1 h，4℃下用一抗免疫印跡過(guò)夜。PBST洗3次后二抗室溫下孵育1 h。PBST洗3次后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者miR-494-3p表達(dá)水平及其對(duì)結(jié)直腸癌患者生存率、細(xì)胞增殖影響 miR-494-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平低于癌旁組織(P<0.05)。見(jiàn)圖1a。根據(jù)miR-494-3p在結(jié)直腸癌組織中的平均表達(dá)水平，將192例患者分入miR-494-3p低表達(dá)組(n=96)和miR-494-3p高表達(dá)組(n=96)。miR-494-3p高表達(dá)組生存率高于miR-494-3p低表達(dá)組(P<0.05)。見(jiàn)圖1b。與結(jié)直腸正常細(xì)胞株NCM460比較，miR-494-3p表達(dá)水平在結(jié)直腸癌細(xì)胞株RKO、HCT116、SW480、HT-29中均處于低表達(dá)水平，且SW480細(xì)胞株中miR-494-3p表達(dá)水平最低(P<0.05)。見(jiàn)圖1c。因此，本研究選取SW480細(xì)胞株為研究對(duì)象進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。過(guò)表達(dá)miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖水平下降(P<0.05)。見(jiàn)圖1d。敲低miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖水平上升(P<0.05)。見(jiàn)圖1e。過(guò)表達(dá)miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中S期細(xì)胞減少、G2/M期細(xì)胞增多(P<0.05)。見(jiàn)圖1f。敲低miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中S期細(xì)胞增多、G2/M期細(xì)胞減少(P<0.05)。見(jiàn)圖1g。即miR-494-3p使結(jié)直腸癌細(xì)胞在G2/M期細(xì)胞周期阻滯。

圖1 結(jié)直腸癌患者miR-494-3p表達(dá)水平及其對(duì)結(jié)直腸癌患者生存率、細(xì)胞增殖影響

2.2 RRS1對(duì)結(jié)直腸癌患者細(xì)胞增殖影響及miR-494-3p靶向RRS1對(duì)結(jié)直腸癌患者細(xì)胞增殖調(diào)控作用 通過(guò)miRDB預(yù)測(cè)miR-494-3p的潛在底物，選取評(píng)分最高的80個(gè)候選基因進(jìn)行siRNA敲低篩選。敲低RRS1后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖水平下降(P<0.05)。見(jiàn)圖2a、2b。過(guò)表達(dá)RRS1后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖水平上升(P<0.05)。見(jiàn)圖2c。敲低RRS1后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中S期細(xì)胞減少、G2/M期細(xì)胞增多(P<0.05)。見(jiàn)圖2d。過(guò)表達(dá)RRS1后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中S期細(xì)胞增多、G2/M期細(xì)胞減少(P<0.05)。見(jiàn)圖2e。過(guò)表達(dá)miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中RRS1 mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05)；敲低miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中RRS1 mRNA表達(dá)水平上升(P<0.05)。見(jiàn)圖2f。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-494-3p靶向RRS1 mRNA的3’端非翻譯區(qū)(P<0.05)。見(jiàn)圖2g。即miR-494-3p靶向RRS1使結(jié)直腸癌細(xì)胞在G2/M期細(xì)胞周期阻滯。

圖2 RRS1對(duì)結(jié)直腸癌患者細(xì)胞增殖影響及miR-494-3p靶向RRS1對(duì)結(jié)直腸癌患者細(xì)胞增殖調(diào)控作用

2.3 miR-494-3p及RRS1對(duì)結(jié)直腸癌患者細(xì)胞周期相關(guān)因子表達(dá)水平影響 過(guò)表達(dá)miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中細(xì)胞周期相關(guān)因子CDKN1A、CDC25C、p53表達(dá)水平上升，MKI67、CDK1表達(dá)水平下降(P<0.05)。見(jiàn)圖3a。

敲低miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中細(xì)胞周期相關(guān)因子CDKN1A、CDC25C、p53表達(dá)水平下降，MKI67、CDK1表達(dá)水平上升(P<0.05)。見(jiàn)圖3b。敲低RRS1后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中細(xì)胞周期相關(guān)因子CDKN1A、CDC25C、p53表達(dá)水平上升，MKI67、CDK1表達(dá)水平下降(P<0.05)。見(jiàn)圖3c。過(guò)表達(dá)RRS1后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中細(xì)胞周期相關(guān)因子CDKN1A、CDC25C、p53表達(dá)水平下降，MKI67、CDK1表達(dá)水平上升(P<0.05)。見(jiàn)圖3d。

圖3 miR-494-3p及RRS1對(duì)結(jié)直腸癌患者細(xì)胞周期相關(guān)因子表達(dá)水平影響

3 討論

miRNA是非編碼RNA家族的成員，長(zhǎng)度為21～23個(gè)核苷酸[11]。有證據(jù)表明，miRNA作為癌基因或腫瘤抑制因子在多種癌癥中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[12]。miR-494-3p可誘導(dǎo)肺癌發(fā)生并調(diào)節(jié)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移及凋亡[13]；但其在某些癌癥中充當(dāng)腫瘤抑制因子，如前列腺癌[14]。本研究結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖水平下降(P<0.05)，S期細(xì)胞減少、G2/M期細(xì)胞增多(P<0.05)。即miR-494-3p在結(jié)直腸癌中充當(dāng)腫瘤進(jìn)展的抑制分子。有研究報(bào)道，miRNA可通過(guò)直接與目標(biāo)mRNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[15]，通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，miRNA廣泛參與各種生物過(guò)程和人類(lèi)疾病。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：過(guò)表達(dá)miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中RRS1 mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05)；敲低miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中RRS1 mRNA表達(dá)水平上升(P<0.05)；miR-494-3p靶向RRS1 mRNA的3’端非翻譯區(qū)(P<0.05)。這提示，miR-494-3p通過(guò)調(diào)節(jié)RRS1發(fā)揮抑制結(jié)直腸癌進(jìn)展的功能。

RRS1的主要功能是參與核糖體的生物發(fā)生，這是蛋白質(zhì)合成所必需的。癌細(xì)胞增殖增強(qiáng)常伴隨蛋白質(zhì)合成增加[16]。有研究證實(shí)，一些核糖體蛋白在癌癥發(fā)展中具有明確作用[17]。有學(xué)者稱(chēng)，RRS1突變可延遲G1到S相的轉(zhuǎn)變[18]，這提示了RRS1在細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變中的重要作用。本研究結(jié)果顯示：敲低RRS1后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中S期細(xì)胞減少、G2/M期細(xì)胞增多(P<0.05)；過(guò)表達(dá)RRS1后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中S期細(xì)胞增多、G2/M期細(xì)胞減少(P<0.05)。本研究結(jié)果還顯示：過(guò)表達(dá)miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中細(xì)胞周期相關(guān)因子CDKN1A、CDC25C、p53表達(dá)水平上升，MKI67、CDK1表達(dá)水平下降(P<0.05)；敲低miR-494-3p后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中細(xì)胞周期相關(guān)因子CDKN1A、CDC25C、p53表達(dá)水平下降，MKI67、CDK1表達(dá)水平上升(P<0.05)；敲低RRS1后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中細(xì)胞周期相關(guān)因子CDKN1A、CDC25C、p53表達(dá)水平上升，MKI67、CDK1表達(dá)水平下降(P<0.05)；過(guò)表達(dá)RRS1后，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中細(xì)胞周期相關(guān)因子CDKN1A、CDC25C、p53表達(dá)水平下降，MKI67、CDK1表達(dá)水平上升(P<0.05)。上述結(jié)果提示，miR-494-3p/RRS1軸在一定程度上通過(guò)上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白來(lái)影響細(xì)胞周期。

綜上所述，miR-494-3p/RRS1軸可影響結(jié)直腸癌發(fā)展，靶向miR-494-3p/RRS1軸可能是一種有前途的結(jié)直腸癌治療策略。