高廣榮，王鑫宇，呂晨光，石三保，段福孝，張 成

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 普通外科，遼寧 沈陽 110016

創(chuàng)傷是中青年人群死亡的主要原因之一，全球每年約580多萬人死于創(chuàng)傷。其中，創(chuàng)傷失血性休克占創(chuàng)傷早期死亡的30%～40%。目前，雖然醫(yī)學(xué)救治水平不斷進(jìn)步，但是創(chuàng)傷失血性休克致死率仍保持在相對(duì)較高的水平[1-2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)性低溫復(fù)蘇可明顯改善失血性休克的預(yù)后[3]。進(jìn)一步研究證實(shí)，誘導(dǎo)性低溫復(fù)蘇可通過降低機(jī)體代謝率、增加能量儲(chǔ)備等方式減少能量耗損，進(jìn)而提高復(fù)蘇效率[4]。PGC-1是參與能量代謝調(diào)控的重要基因[5]。目前，失血性休克誘導(dǎo)性低溫復(fù)蘇對(duì)PGC-1有何影響尚不明確。本研究旨在探討誘導(dǎo)性低溫復(fù)蘇對(duì)失血性休克大鼠肺PGC-1表達(dá)的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級(jí)成年雄性Wistar大鼠18只(體質(zhì)量280～310 g)，由北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。Datex-Ohmeda S/5多功能監(jiān)護(hù)儀(芬蘭德恩公司)，壓力傳感器(新加坡 Biosensors International PET.Ltd)，PCR擴(kuò)增儀(德國Biometra)，高速離心機(jī)(美國Sigma公司)，微量輸液泵(浙大醫(yī)學(xué)器械有限公司W(wǎng)Z-50cz)。RNA固定液(北京天恩澤基因科技有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒(大連寶生物工程大連有限公司)。PGC-1引物合成(大連寶生物工程大連有限公司)。PGC-1(sc-13067)抗體(SANTA CRUZ公司)。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備 將大鼠隨機(jī)分為A組(對(duì)照)、B組(37℃～38℃常溫復(fù)蘇)及C組(33℃～34℃低溫復(fù)蘇)3組，每組各6只。A組僅行外科插管操作。B組、C組建立失血性休克模型后分別在預(yù)定溫度下進(jìn)行復(fù)蘇。按照標(biāo)準(zhǔn)建立壓力控制失血性休克模型。戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉成功后進(jìn)行氣管內(nèi)插管和小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，潮氣量設(shè)定為7～8 ml/kg，呼吸頻率設(shè)定為80次/min，吸入氧濃度為40%。進(jìn)行雙側(cè)股動(dòng)脈及右側(cè)股靜脈插管(PE-50)。右側(cè)股動(dòng)脈用于監(jiān)測(cè)血壓，左側(cè)股動(dòng)脈用于放血，右側(cè)股靜脈用于復(fù)蘇。所有外科操作均在無菌條件下進(jìn)行。外科操作結(jié)束后經(jīng)過15 min穩(wěn)定期，記錄基礎(chǔ)平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)。建立模型時(shí)，通過左側(cè)股動(dòng)脈插管在10 min內(nèi)抽血使MAP降至40 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。抽出的血液儲(chǔ)存在肝素化(7.5 U/ml)的無菌注射器內(nèi)，置于4℃冰箱中，待復(fù)蘇時(shí)回輸至大鼠體內(nèi)。在休克觀察的90 min內(nèi)通過繼續(xù)抽血或少量回輸抽出的血液維持大鼠MAP在40～45 mmHg。休克90 min結(jié)束后，將抽出的血液及等體積生理鹽水在10 min內(nèi)通過右側(cè)股靜脈用微量輸液泵回輸至大鼠體內(nèi)，連續(xù)觀察180 min。各組大鼠在外科操作結(jié)束后持續(xù)測(cè)量直腸溫度，若直腸溫度<37℃即開始用紅外線燈照射大鼠腹部，A組和B組在實(shí)驗(yàn)觀察期間通過間斷照射紅外線燈維持大鼠直腸溫度在37℃～38℃，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。C組在復(fù)蘇期間通過在大鼠腹部涂抹乙醇及吹冷風(fēng)的方法在5 min內(nèi)將大鼠直腸溫度降至33℃～34℃，在復(fù)蘇觀察的180 min內(nèi)持續(xù)監(jiān)測(cè)直腸溫度，若直腸溫度>34℃將繼續(xù)涂抹乙醇及吹冷風(fēng)以維持直腸溫度在33℃～34℃，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3 標(biāo)本留取 在失血性休克復(fù)蘇180 min后處死大鼠，留取大鼠雙肺下葉組織標(biāo)本各4塊，重1 g，置于-80℃低溫冰箱待測(cè)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) RNA提取：TRIzol一步法提取RNA。反轉(zhuǎn)錄：采用大連寶生物工程大連有限公司試劑盒合成cDNA，反應(yīng)條件：37℃、15.0 min；85℃、5 sed。PCR擴(kuò)增，PGC-1引物序列：上游5′-CAGCCCTCTTCATCTCCAAG-3′，下游5′-TCGTGCAGGTCATCAAGAAG-3′；actin引物序列：上游5′-TCATCACCATTGGCAATGAG-3′，下游5′-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3′。PCR反應(yīng)按下列條件循環(huán)：95℃、0.5 min，預(yù)變性，然后95℃、30 s，60℃、34 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后，60℃、1 min延伸。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，熒光定量PCR儀自動(dòng)分析并計(jì)算結(jié)果，按2-△△CT法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 蛋白免疫印跡法 采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)PGC-1蛋白表達(dá)。肺組織加入5倍體積預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，冰浴下勻漿，再用冰水浴超聲粉碎。4℃、12 000 r/min離心1 h取上清液，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。SDS-PAGE分離樣品(40 μg)后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，封閉后，加入一抗(PGC-1，1∶500)室溫下免疫沉淀1 h，搖洗后加入標(biāo)記二抗(1∶2 000)，室溫下作用2 h。ECL浸膜，顯影。照片在圖像分析儀上進(jìn)行分析定量，記錄相應(yīng)蛋白條帶的平均光強(qiáng)度值，計(jì)算PGC-1和actin吸光度值的比值。

1.6 活性氧檢測(cè) 1 g肺組織勻漿后應(yīng)用清潔液漂洗，再以300 r/min離心5 min。將組織沉淀依據(jù)試劑盒說明書處理后，用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)活性氧水平。

1.7 肺三磷酸腺苷檢測(cè) 將20 mg肺組織用組織裂解液裂解后，以12 000 r/min離心10 min，收集上清液。上清液依據(jù)試劑盒說明書處理后，用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織活性氧水平比較 失血性休克復(fù)蘇180 min，A組肺組織活性氧水平為(101.67±6.50)，B組為(320.00±11.87)，C組為(208.83±8.84)。B組、C組肺組織活性氧水平高于A組，且B組高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組肺組織ATP水平比較 失血性休克復(fù)蘇180 min，A組ATP水平為(20.65±2.02)，B組為(4.92±0.32)，C組為(15.4±1.0)。B組、C組ATP水平低于A組，且B組低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 各組肺組織PGC-1 mRNA表達(dá)量比較 A組大鼠肺組織PGC-1 mRNA表達(dá)量為(1.47±1.22)，B組為(0.07±0.05)，C組為(0.28±0.07)。B組、C組PGC-1 mRNA表達(dá)量低于A組，且B組低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 各組肺組織PGC-1蛋白比較 B組、C組PGC-1蛋白低于A組，且B組低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織PGC-1蛋白變化

3 討論

失血性休克患者易出現(xiàn)自發(fā)性低體溫，對(duì)機(jī)體重要臟器功能及內(nèi)環(huán)境平衡產(chǎn)生不利影響，是預(yù)后不良的標(biāo)志[6]。有研究報(bào)道，誘導(dǎo)性低溫可保護(hù)重要臟器功能，提高復(fù)蘇效率，降低病死率[7]。因此，有計(jì)劃的治療性低溫或誘導(dǎo)性低溫復(fù)蘇可以對(duì)失血性休克的治療發(fā)揮積極作用。

活性氧主要是線粒體有氧呼吸過程中的呼吸鏈副產(chǎn)物[8]。有研究認(rèn)為，失血性休克時(shí)，機(jī)體在多種強(qiáng)烈因素作用下，體內(nèi)活性氧生成增加，活性氧水平變化可以作為預(yù)測(cè)失血性休克早期肺損傷的標(biāo)志物[9]。本研究結(jié)果顯示，失血性休克常溫復(fù)蘇后大鼠肺組織活性氧水平顯著升高，與常溫復(fù)蘇組比較，低溫復(fù)蘇后大鼠肺組織活性氧水平明顯下降。短時(shí)間內(nèi)大量積聚的活性氧會(huì)對(duì)線粒體的能量代謝呼吸鏈具有顯著損傷、破壞及毒性作用，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體腫脹，ATP迅速減少，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10]。B組大鼠肺組織內(nèi)ATP水平明顯下降，而C組ATP水平明顯高于B組(P<0.05)，提示失血性休克后采取誘導(dǎo)性低溫復(fù)蘇降低了大鼠肺組織活性氧水平，進(jìn)而改善了線粒體的功能，提高了大鼠肺組織ATP水平，促進(jìn)了能量代謝平衡。

PGC-1作為重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可結(jié)合多種轉(zhuǎn)錄因子，增強(qiáng)靶基因轉(zhuǎn)錄效率，廣泛參與多種代謝通路的調(diào)節(jié)活動(dòng)[11]，在適應(yīng)性產(chǎn)熱、線粒體生成、脂肪酸氧化等過程中有著重要作用[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，正常大鼠肺組織內(nèi)有PGC-1的表達(dá)，失血性休克復(fù)蘇后大鼠肺組織PGC-1 mRNA表達(dá)明顯降低，PGC-1蛋白水平也相應(yīng)降低，而C組大鼠肺組織PGC-1 mRNA的表達(dá)被明顯上調(diào)，PGC-1蛋白水平也有所升高，提示失血性休克后的誘導(dǎo)性低溫復(fù)蘇能夠上調(diào)大鼠肺組織PGC-1基因和蛋白的表達(dá)。PGC-1是線粒體生理代謝的重要調(diào)控因子，PGC-1的活性增加，能夠刺激線粒體的生物合成，進(jìn)而加速了ATP的生成[14]。也有研究證實(shí)，PGC-1可以調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性，減少活性氧的含量，發(fā)揮抗氧化作用[15]。

綜上所述，誘導(dǎo)性低溫復(fù)蘇失血性休克能夠調(diào)控PGC-1表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)ATP和活性氧的水平，減輕肺損傷程度，利于休克的救治。但目前尚不清楚誘導(dǎo)性低溫調(diào)控PGC-1表達(dá)的具體機(jī)制，仍需進(jìn)一步的深入研究。