姜玉池，趙怡晴，謝 奎，陳 成，車會(huì)蓮，韓詩(shī)雯,*

（1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.海普諾凱營(yíng)養(yǎng)品有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410000）

乳及乳制品含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、礦物質(zhì)及維生素等20多種人體所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，尤其是鈣含量高，且鈣磷比適宜，易被人體消化吸收。然而最常見(jiàn)的乳制品——牛乳，卻是聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織公布的八大類常見(jiàn)過(guò)敏食物之一，常發(fā)生于3歲以下兒童。歐洲一項(xiàng)2000—2012年流行病學(xué)研究確定了歐洲地區(qū)牛乳過(guò)敏發(fā)病率高達(dá)6.0%[1]；加拿大10個(gè)省的調(diào)查結(jié)果顯示牛乳過(guò)敏發(fā)病率為2.2%[2]。牛乳過(guò)敏臨床癥狀以腹瀉為主，并伴有皮膚瘙癢、濕疹、咽部水腫、流涕、噴嚏、鼻塞、喘息、哮喘等皮膚、胃腸道和呼吸系統(tǒng)癥狀[3]，嚴(yán)重影響了牛乳過(guò)敏患者的生活質(zhì)量。牛乳過(guò)敏主要是由免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，初次進(jìn)入機(jī)體的乳蛋白誘發(fā)B細(xì)胞產(chǎn)生特異性IgE抗體，并與肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等表面的FcεRI結(jié)合，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)；在激發(fā)階段，耐受了胃液消化分解的乳蛋白通過(guò)小腸吸收進(jìn)入免疫系統(tǒng)，與致敏肥大細(xì)胞表面的IgE抗體特異性結(jié)合，使表面的FcεRI活化，促使肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放出組胺等介質(zhì)，引起體溫下降、瘙癢、血管滲透性增加等過(guò)敏表征[4]。目前緩解食物過(guò)敏最有效的方法是規(guī)避過(guò)敏原，即避免食用牛乳及其相關(guān)制品，但這會(huì)影響機(jī)體獲取蛋白質(zhì)、鈣等牛乳中豐富的營(yíng)養(yǎng)素；也可選用深度水解乳蛋白的配方乳粉作為替代品，但往往失去了乳制品本身的口感和風(fēng)味。因此，尋找一種具有豐富營(yíng)養(yǎng)成分但致敏水平較低的替代乳制品是乳品工業(yè)發(fā)展所面臨的一大挑戰(zhàn)。

山羊乳是世界上飲用歷史最早的動(dòng)物乳，且其飲用人數(shù)最多。目前，世界上有113個(gè)國(guó)家或地區(qū)生產(chǎn)山羊乳，山羊乳產(chǎn)量約占總?cè)樵吹?%。山羊乳及其制品（包括奶酪和酸乳）具有味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、易消化等特點(diǎn)[5]，被視為乳品中的精品，近年來(lái)，其作為“奶中之王”受到越來(lái)越多的關(guān)注。目前研究表明，牛乳和山羊乳在化學(xué)特性、蛋白質(zhì)組成等方面具有相似性。牛乳的pH值和酸度分別為6.63和0.13%，山羊乳的pH值和酸度分別為6.49和0.12%[6]；脫脂牛乳和脫脂羊乳的酪蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白以及α-乳白蛋白含量均相近[7]。Lara-Villoslada等[8]在特應(yīng)性小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，山羊乳的免疫原性比牛乳的免疫原性更低。有研究發(fā)現(xiàn)，山羊乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道菌群中有益菌的比例更高，進(jìn)而促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育，減少氣道反應(yīng)的發(fā)生[9]。Jirillo等[10]發(fā)現(xiàn)山羊乳可以調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，如人外周血單核細(xì)胞和多形核中性粒細(xì)胞中一氧化氮（NO）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），下調(diào)T輔助（T helper，TH）2型細(xì)胞的活化，通過(guò)維持免疫穩(wěn)態(tài)而降低過(guò)敏反應(yīng)。此外，不同來(lái)源乳蛋白之間可能會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，在一項(xiàng)對(duì)牛乳過(guò)敏患者的研究中發(fā)現(xiàn)僅50%的患者會(huì)與山羊乳產(chǎn)生交叉反應(yīng)[11]，這可能為將來(lái)利用山羊乳替代牛乳降低過(guò)敏反應(yīng)提供了可能。

為了系統(tǒng)比較山羊乳與牛乳的致敏性，研究?jī)烧咧g的交叉反應(yīng)性，本研究依據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織公布的蛋白質(zhì)潛在致敏性樹狀評(píng)估策略[12]對(duì)一種山羊乳配方乳粉和一種牛乳配方乳粉進(jìn)行了致敏性評(píng)價(jià)，該評(píng)估策略已被廣泛應(yīng)用于食物蛋白和轉(zhuǎn)基因食品外源蛋白的致敏性評(píng)價(jià)中[13]，能夠有效評(píng)估食物蛋白的致敏性。此外，本研究還利用已確診的牛乳過(guò)敏患者血清與山羊乳配方乳粉進(jìn)行交叉反應(yīng)性研究，為后續(xù)利用山羊乳配方乳粉作為替代乳降低牛乳過(guò)敏性疾病的發(fā)生提供可能。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

60只4～5周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)東校區(qū)SPF級(jí)動(dòng)物房（SYXK（京）2020-0052）。飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在（22±1）℃，相對(duì)濕度穩(wěn)定在（55±5）%，每12 h晝夜氣流交替1次。所用飼料為商業(yè)化SPF級(jí)維持飼料，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。本研究中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過(guò)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

乳山羊乳配方乳粉和牛乳配方乳粉由海普諾凱營(yíng)養(yǎng)品有限公司提供，兩種乳粉加工工藝及所含添加劑種類一致，且符合GB 19644—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 乳粉》中各項(xiàng)要求。其中山羊乳配方乳粉中蛋白質(zhì)含量為16.1 g/100 g，牛乳配方乳粉中蛋白質(zhì)含量為18.6 g/100 g。

乙腈（質(zhì)譜純） 美國(guó)Fisher Chemical公司；胰蛋白酶（測(cè)序級(jí)） 美國(guó)Promega公司；甲酸（質(zhì)譜純）、碳酸氫銨（質(zhì)譜純）、二硫蘇糖醇（分析純）、碘乙酰胺（分析純）、酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白、乳鐵蛋白、IgG和組胺酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒 北京冬歌偉業(yè)公司；來(lái)源于豬胃黏膜的胃蛋白酶（＞3 200 units/mg蛋白）、霍亂毒素（cholera toxin，CT）佐劑、伊文思藍(lán) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；小鼠抗人IgE、羊抗小鼠IgE、羊抗小鼠IgG1（均為辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記） 美國(guó)Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒 江蘇康為世紀(jì)公司。

實(shí)驗(yàn)所用血清均來(lái)自河南新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院。本研究所使用的人體血清樣本已取得患者的知情同意。血清樣本采集方法、貯存方法、研究方案及樣本處理等均已獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)人體研究倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)。血清來(lái)源的具體信息如下：

1#、2#、3#均為經(jīng)過(guò)敏原檢測(cè)后確定為非過(guò)敏人群的血液樣本；4#：女，1歲，牛乳陽(yáng)性（+）、雞蛋白陽(yáng)性（+）、黃豆弱陽(yáng)性（+－）、海魚組合（鱈魚/龍蝦/扇貝）弱陽(yáng)性（+－）；5#：男，1歲，牛乳陽(yáng)性（+）、牛肉陽(yáng)性（+）；6#：女，7歲，牛乳（+－）、塵螨組合（屋塵螨/粉塵螨）（++）、霉菌組合（+－）。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate3000毛細(xì)管高效液相色譜儀、電噴霧-組合型離子阱Orbitrap質(zhì)譜儀、Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；5430低速高溫離心機(jī)美國(guó)Eppendorf公司；WI88375小鼠肛溫計(jì) 北京冀諾泰科技發(fā)展有限公司；DSHZ-300恒溫水浴箱 江蘇太倉(cāng)醫(yī)用儀器廠；DYCZ-24DN電泳儀 北京六一儀器廠；JY-ZY5電轉(zhuǎn)儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；BX51T-PHD-J11顯微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定蛋白

為了比較兩種配方乳粉中的蛋白質(zhì)種類和主要過(guò)敏原含量，利用蒸餾水配制兩種乳粉的蛋白溶液（質(zhì)量濃度為5 mg/mL），經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和胰蛋白酶酶解進(jìn)行前處理后進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatopraphy tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）檢測(cè)。預(yù)柱（5 mm×300 μm，5 μm，100 ?）；Acclaim PepMap反相液相色譜（reversed-phase liquid chromatography，RPLC）C18分析柱（150 mm×150 μm，1.9 μm，100 ?）。流動(dòng)相A為0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸+2%乙腈；流動(dòng)相B為0.1%甲酸+80%乙腈。流速600 nL/min。每個(gè)組分分析時(shí)間為60 min。質(zhì)譜原始文件使用Maxquant（v1.6.2.10）軟件分別檢索uniprot-Bos taurus和uniprot-Capra hircus數(shù)據(jù)。

1.3.2 體外模擬胃液消化

模擬胃液配制（參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部869號(hào)公告-2-2007）：將0.2 g氯化鈉（NaCl）和83 mg胃蛋白酶溶于70 mL重蒸餾水，加入730 μL鹽酸，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1.2，加蒸餾水定容至100 mL。

按照BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書，將蒸餾水溶解的蛋白樣品調(diào)整為同一質(zhì)量濃度（5 mg/mL），參照農(nóng)業(yè)部869號(hào)公告-2-2007，將模擬胃液分別與由兩種乳粉配制的蛋白溶液按照19∶1（V/V）的比例混合，快速振蕩混勻，置于37 ℃水浴中，計(jì)時(shí)。在0、15 s及2、30、60 min時(shí)間點(diǎn)取樣，向模擬胃液中快速加入70 μL 0.2 mol/L碳酸氫鈉溶液終止反應(yīng)，再加入5×上樣緩沖液，沸水煮5 min，進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色、脫色，并拍照分析。

1.3.3 人體血清學(xué)方法評(píng)價(jià)蛋白樣品致敏性

參照農(nóng)業(yè)部2406號(hào)公告-5-2016，將待測(cè)蛋白樣品充分溶解于包被緩沖液中，配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的樣品。選取未檢測(cè)出主要已知過(guò)敏原的健康人血清，作為陰性對(duì)照血清；選取已確診對(duì)牛乳過(guò)敏的患者血清作為檢測(cè)血清。通過(guò)間接ELISA法測(cè)定樣品結(jié)合血清中IgE的能力。以450 nm波長(zhǎng)下測(cè)得的光密度大于或等于陰性對(duì)照血清孔光密度平均值2 倍的樣品為陽(yáng)性結(jié)果。

1.3.4 BALB/c小鼠食物過(guò)敏模型

BALB/c雌性小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分成5組，分別為牛乳配方乳粉組（牛乳配方乳粉+CT佐劑）、山羊乳配方乳粉組（山羊乳配方乳粉+CT佐劑）、雞蛋卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）陽(yáng)性組（OVA+CT佐劑）、CT佐劑組（對(duì)照組）和陰性對(duì)照組（生理鹽水），每組12只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠自由飲水和進(jìn)食，每周稱體質(zhì)量并記錄。實(shí)驗(yàn)開始第0、7、14、21、28天分別經(jīng)口灌胃給予牛乳配方乳粉組、山羊乳配方乳粉組、雞蛋卵清蛋白陽(yáng)性組每只小鼠1 mg受試蛋白（吸附10 μg CT佐劑，用100 μL生理鹽水稀釋），CT佐劑組僅給予10 μg CT，陰性對(duì)照組接受相同體積（100 μL）的生理鹽水。在實(shí)驗(yàn)第42天進(jìn)行經(jīng)口大劑量刺激，即灌胃5 mg牛乳配方乳粉、山羊乳配方乳粉受試蛋白或OVA蛋白，測(cè)試刺激前后小鼠肛溫，觀察并記錄刺激后30 min內(nèi)小鼠抓撓、活動(dòng)降低、毛發(fā)直立、行走困難、呼吸緩慢等過(guò)敏癥狀。臨床癥狀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下：沒(méi)有癥狀記0 分；抓鼻子、撓頭記1 分；眼睛、嘴巴周圍浮腫，毛發(fā)豎立，活動(dòng)減少或呼吸頻率升高記2 分；哮喘、呼吸困難，嘴和尾巴周圍蒼白記3 分；刺激后抽搐或靜止記4 分；死亡記5 分。按下式計(jì)算實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠的食物利用率。

30 min后對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行眼部?jī)?nèi)眥采血，置于含乙二胺四乙酸二鉀抗凝劑的離心管中，5 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取血漿，保存于－20 ℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 ELISA檢測(cè)

ELISA檢測(cè)包括2個(gè)實(shí)驗(yàn)。首先，為了確定兩種配方乳粉中過(guò)敏原蛋白種類和含量，采用ELISA試劑盒測(cè)定牛乳配方乳粉和山羊乳配方乳粉中酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白、乳鐵蛋白和IgG共6種蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。其次，為了確定不同致敏處理后BALB/c小鼠的過(guò)敏反應(yīng)，利用ELISA試劑盒檢測(cè)了小鼠血漿中組胺的水平。具體操作參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

此外還依據(jù)ELISA原理利用羊抗小鼠IgE或羊抗小鼠IgG1檢測(cè)了小鼠血漿中過(guò)敏原（牛乳配方乳粉或山羊乳配方乳粉或OVA）特異性IgE和特異性IgG1的水平，以反映兩種配方乳粉的免疫原性。使用預(yù)先包被的96 孔板，每孔加入100 μL血漿于37 ℃下孵育2 h，洗滌3次后每孔加入100 μL HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgE或羊抗小鼠IgG1，37 ℃下孵育1 h，洗滌3次后每孔加入90 μL 3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）顯色液，于37 ℃下避光孵育15～30 min，最后加入50 μL終止液后輕輕混勻，5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm波長(zhǎng)下的光密度。

1.3.6 血管滲透性觀察

伊文思藍(lán)染色結(jié)果能夠反映血管滲透性。大劑量刺激激發(fā)前，小鼠經(jīng)尾靜脈注射100 μL體積分?jǐn)?shù)0.5%伊文思藍(lán)溶液，再經(jīng)口灌胃10 mg受試蛋白（牛/山羊乳配方乳粉和OVA蛋白），30～40 min后觀察小鼠腳掌的滲出物顏色，并拍照記錄。

1.3.7組織病理學(xué)觀察

采用頸椎脫臼法處死小鼠，取各組小鼠肝臟、肺、脾臟和空腸放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，對(duì)臟器進(jìn)行脫水透明處理后，使石蠟浸入臟器中。將浸蠟后的組織置于融化的固體石蠟中。修正蠟塊后進(jìn)行切片，厚度一般為4～6 μm。脫蠟后使用蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色法染色或甲苯胺藍(lán)染色，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.3.8 Western blotting檢測(cè)

40 μg牛乳配方乳粉或山羊乳配方乳粉蛋白樣品上樣至Tricine SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，80 V恒壓下電轉(zhuǎn)2 h，將蛋白條帶印跡到硝酸纖維素膜上。用含5%牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）的TBST緩沖液封閉1 h，加入1#、2#、3#混合血清（100∶1、V/V）于4 ℃下孵育過(guò)夜，TBST清洗6次（5 min/次）。按體積比8 000∶1加入抗兔IgG抗體、HRP標(biāo)記抗體于37 ℃下孵育1 h，TBST清洗8次（5 min/次）。加入ECL化學(xué)發(fā)光劑孵育5 min顯影曝光后分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

生物信息學(xué)采用軟件MaxQuant 1.6.2.10分析，其余數(shù)據(jù)利用GraphPad Prism 5.01軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析和單因素方差分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種配方乳粉中蛋白質(zhì)種類鑒定

為了確定兩種配方乳粉中蛋白質(zhì)組成，通過(guò)LC-MS/MS分析得到牛乳配方乳粉和山羊乳配方乳粉中蛋白質(zhì)數(shù)量和種類。其中牛乳配方乳粉中共鑒定出137種蛋白質(zhì)，山羊乳配方乳粉中共鑒定出167種蛋白質(zhì)。表1列出按照含量由高到低排名前10種蛋白質(zhì)。

表1 牛乳配方乳粉和山羊乳配方乳粉中含量由高到低排名前10的蛋白質(zhì)Table 1 Top 10 most abundant proteins in bovine and goat milk formula powder

2.2 乳品中已確定的主要過(guò)敏原水平分析

對(duì)IUIS過(guò)敏原命名數(shù)據(jù)庫(kù)（IUIS Allergen Nomenclature）中公布的牛乳中過(guò)敏原（酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白、乳鐵蛋白和免疫球蛋白）進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖1所示，其中山羊乳配方乳粉中β-乳球蛋白（（103.46±2.86）μg/mL）和α-乳清蛋白（（43.15±2.08）μg/mL）水平顯著低于牛乳配方乳粉（（110.75±2.52）μg/mL、（47.91±1.36）μg/mL）（P＜0.05）。此外，山羊乳配方乳粉的牛血清白蛋白、IgG及乳鐵蛋白水平均低于牛乳配方乳粉。在山羊乳配方乳粉中，僅酪蛋白水平高于牛乳配方乳粉，且無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 牛乳和山羊乳配方乳粉中6種主要過(guò)敏原質(zhì)量濃度比較Fig. 1 Comparison of contents of six major allergens in bovine and goat milk formula powder

2.3 兩種配方乳粉體外模擬胃液消化后的穩(wěn)定性比較

食物蛋白經(jīng)胃蛋白酶消化后的穩(wěn)定性是影響其被腸道免疫系統(tǒng)識(shí)別并提呈給T細(xì)胞的關(guān)鍵因素，理論上過(guò)敏原在經(jīng)過(guò)小腸吸收進(jìn)入免疫系統(tǒng)前需耐受消化降解，保持足夠完整又有免疫原性的蛋白或蛋白片段才具有潛在致敏性。一些重要的食物過(guò)敏原（如大豆中的β-伴大豆球蛋白）在模擬胃液中能穩(wěn)定60 min以上，而非過(guò)敏原（如馬鈴薯酸性磷酸酶）在15 s內(nèi)就被完全消化[14]。對(duì)牛乳和山羊乳配方乳粉體外模擬胃液消化后進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖2所示，35～40 kDa附近的條帶為酪蛋白的不同亞基，15～25 kDa附近的條帶主要是β-乳球蛋白，其分子質(zhì)量在18 kDa左右[15]。β-乳球蛋白和酪蛋白是乳中的主要過(guò)敏原[16]，其中，約82%的牛乳過(guò)敏患者對(duì)β-乳球蛋白過(guò)敏[17]。牛乳配方乳粉及消產(chǎn)物的可見(jiàn)蛋白片段，尤其是β-乳球蛋白于60 min仍不能被全部消化，表明牛乳配方乳粉中的蛋白質(zhì)在模擬胃液中極難消化；山羊乳配方乳粉及消化產(chǎn)物的可見(jiàn)蛋白片段在15 s～2 min內(nèi)全部消化，表明山羊乳配方乳粉中的蛋白在模擬胃液中易消化。

圖2 牛乳和山羊乳配方乳粉模擬胃液消化后的SDS-PAGE圖Fig. 2 Electrophoresis profiles of simulated gastric digests of bovine and goat milk formula powder

2.4 人體血清學(xué)分析兩種配方乳粉的致敏性

食物蛋白與其特異性IgE的結(jié)合能力是食物過(guò)敏效應(yīng)階段激活肥大細(xì)胞的關(guān)鍵，過(guò)敏患者的血清與特異性IgE結(jié)合能力越低，則越不易發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)。參照農(nóng)業(yè)部2406號(hào)公告-5-2016，利用牛乳過(guò)敏患者血清分析了牛乳配方乳粉、山羊乳配方乳粉與血清中其特異性IgE的結(jié)合能力。結(jié)果如圖3所示，樣品蛋白與過(guò)敏患者血清結(jié)合組OD值大于非過(guò)敏血清結(jié)合組OD值的2 倍，且存在顯著性差異（P＜0.05），呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，表明兩種乳粉均具有致敏性。此外，對(duì)于每名過(guò)敏患者來(lái)說(shuō)，牛乳配方乳粉組的OD值大于山羊乳配方乳粉組，表明牛乳比山羊乳中過(guò)敏原與血清IgE的結(jié)合能力更強(qiáng)，表現(xiàn)出更高的致敏性。

圖3 人體血清學(xué)分析兩種配方乳粉的致敏性Fig. 3 Allergenicity of two formula milk powders with human serological study

2.5 BALB/c小鼠食物過(guò)敏模型分析比較兩種配方乳粉致敏性

動(dòng)物模型能夠反映食物蛋白在體內(nèi)引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的實(shí)際情況，用于評(píng)價(jià)食物潛在致敏性。BALB/c小鼠具有顯性遺傳性過(guò)敏性疾病，是高IgE應(yīng)答品系，適合作為食物致敏性評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型。本研究采用BALB/c小鼠食物過(guò)敏模型比較了牛乳配方乳粉和山羊乳配方乳粉誘發(fā)機(jī)體發(fā)生過(guò)敏的程度。實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠體質(zhì)量和食物利用率分別如圖4A、B所示，各組間小鼠體質(zhì)量與食物利用率均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖4 小鼠的體質(zhì)量變化及食物利用率情況Fig. 4 Changes in body mass and feed utilization of BALB/c mice

2.5.1 致敏小鼠體溫變化及食物過(guò)敏癥狀評(píng)分

對(duì)BALB/c小鼠致敏處理后進(jìn)行大劑量刺激，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生體溫下降的系統(tǒng)性過(guò)敏癥狀。本研究中，監(jiān)測(cè)了刺激前至刺激后30 min內(nèi)小鼠體溫變化，體溫下降幅度如圖5A所示，陰性對(duì)照組與CT佐劑組之間無(wú)顯著性差異；與陰性對(duì)照組（（－0.35±0.14）℃）和CT佐劑組（（－0.54±0.52）℃）相比，OVA陽(yáng)性組（（－0.69±0.35）℃）、牛乳配方乳粉組（（－1.61±0.76）℃）和山羊乳配方乳粉組（（－0.92±0.68）℃）小鼠的體溫均明顯下降。其中牛乳配方乳粉組體溫下降程度顯著高于OVA陽(yáng)性組和山羊乳配方乳粉組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致敏后大劑量刺激30 min內(nèi)會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)烈的過(guò)敏癥狀。本研究記錄了刺激后30 min內(nèi)小鼠臨床過(guò)敏癥狀，并進(jìn)行評(píng)分。如圖5B所示，陰性對(duì)照組和CT佐劑組小鼠均未出現(xiàn)過(guò)敏癥狀，評(píng)分為0；OVA陽(yáng)性組、牛乳配方乳粉組和山羊乳配方乳粉組小鼠均出現(xiàn)了不同程度的過(guò)敏癥狀，表現(xiàn)為毛發(fā)豎立、活動(dòng)減少、呼吸困難、毛發(fā)較少處浮腫、嘴巴和尾巴蒼白等臨床過(guò)敏癥狀，其中牛乳配方乳粉組有一半小鼠過(guò)敏評(píng)分為3 分，山羊乳配方乳粉組1/3的小鼠過(guò)敏癥狀評(píng)分為3 分。山羊乳配方乳粉致敏小鼠從體溫和臨床癥狀中表現(xiàn)出更低評(píng)分的過(guò)敏癥狀。

圖5 小鼠體溫變化（A）及臨床過(guò)敏癥狀（B）Fig. 5 Body temperature change (A) and clinical allergy symptoms in vivo (B)

2.5.2 小鼠血漿中組胺水平比較

經(jīng)口大劑量刺激BALB/c小鼠能誘發(fā)血漿組胺水平的增加，這與食物過(guò)敏效應(yīng)階段的過(guò)敏癥狀相關(guān)。通過(guò)測(cè)定大劑量刺激后30 min血漿中組胺的水平可以反映小鼠過(guò)敏反應(yīng)，結(jié)果如圖6所示。與陰性對(duì)照組相比，OVA陽(yáng)性組、牛乳配方乳粉組和山羊乳配方乳粉組小鼠血漿中組胺水平均顯著增加（P＜0.05），而山羊乳配方乳粉組小鼠血漿組胺水平顯著低于牛乳配方乳粉組（P＜0.05）。此外，CT佐劑組小鼠血漿中組胺水平與陰性對(duì)照組相比也顯著增加，這可能與CT佐劑增強(qiáng)非特異性免疫作用有關(guān)。

圖6 小鼠血漿組胺水平Fig. 6 Plasma histamine levels in vivo

2.5.3 小鼠血清中特異性抗體水平比較

過(guò)敏反應(yīng)屬于TH2型免疫反應(yīng)，因此本研究測(cè)定了小鼠血漿中2種TH2型特異性抗體IgE和IgG1的水平，通過(guò)光密度表征比較兩組特異性抗體的水平，結(jié)果如圖7所示。與陰性對(duì)照組和CT佐劑組相比，OVA陽(yáng)性組、牛乳配方乳粉組和山羊乳配方乳粉組小鼠血清中IgE和IgG1水平均顯著增加（P＜0.05），而山羊乳配方乳粉組小鼠的2種抗體水平均顯著低于牛乳配方乳粉組（P＜0.05）。

圖7 小鼠血清特異性抗體水平Fig. 7 Serum specific antibody levels in vivo

2.5.4 兩種配方乳粉對(duì)血管滲透性增加水平的影響

食物過(guò)敏會(huì)誘發(fā)血管滲透性的增加，在對(duì)BALB/c小鼠注射伊文思藍(lán)并進(jìn)行經(jīng)口大劑量刺激后，如圖8所示，OVA陽(yáng)性組、牛乳配方乳粉組和山羊乳配方乳粉組的腳掌產(chǎn)生了藍(lán)色，而陰性對(duì)照組、CT佐劑組未出現(xiàn)藍(lán)色，其中牛乳配方乳粉組小鼠腳掌藍(lán)色比山羊乳配方乳粉組更明顯，說(shuō)明其誘發(fā)的血管滲透性增加水平更高，過(guò)敏癥狀更嚴(yán)重。

圖8 小鼠血管滲透性結(jié)果Fig. 8 Vascular permeability results in vivo

2.5.5組織病理學(xué)分析兩種乳粉的致敏情況

為了研究受試蛋白在組織水平上產(chǎn)生的致敏效應(yīng)，經(jīng)口大劑量刺激BALB/c小鼠后取脾臟、肺、肝臟和空腸組織通過(guò)HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)。如圖9A所示，陰性對(duì)照組和CT佐劑組小鼠脾臟、肺、肝臟和空腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯炎癥。OVA陽(yáng)性組、牛乳配方乳粉組和山羊乳配方乳粉組小鼠脾紅髓出現(xiàn)淋巴細(xì)胞聚集，肺組織局部有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)灶。其中山羊乳配方乳粉組小鼠肺組織局部?jī)H有炎性細(xì)胞分布；牛乳配方乳粉組小鼠小腸絨毛腫脹、脫落。

此外，本研究還對(duì)各組織中的肥大細(xì)胞進(jìn)行了甲苯胺藍(lán)染色，直觀地觀察了各組肥大細(xì)胞脫顆粒水平。圖9B甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示，OVA陽(yáng)性組、牛乳配方乳粉組和山羊乳配方乳粉組中顯示出多數(shù)肥大細(xì)胞胞膜破裂，輪廓不清，并已排出顆粒，而陰性對(duì)照組和CT佐劑組多數(shù)肥大細(xì)胞膜完整，輪廓清晰，大部分未脫顆粒。牛乳配方乳粉組脫顆粒肥大細(xì)胞的數(shù)量高于山羊乳配方乳粉組。

2.6 兩種配方乳粉與牛乳過(guò)敏患者血清反應(yīng)性比較

為了研究山羊乳配方乳粉是否會(huì)與牛乳過(guò)敏患者血清發(fā)生反應(yīng)，本研究通過(guò)Western blotting測(cè)定比較山羊乳配方乳粉和牛乳配方乳粉與牛乳過(guò)敏患者血清的反應(yīng)性。如圖10所示，山羊乳配方乳粉能與牛乳過(guò)敏患者血清結(jié)合，但結(jié)合能力明顯低于牛乳配方乳粉。

圖10 山羊乳配方乳粉與牛乳過(guò)敏患者血清反應(yīng)性結(jié)果Fig. 10 Cross-reactivity of goat milk formula powder with serum from cow’s milk allergy patients

3 討 論

本研究利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體血清學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)山羊乳配方乳粉的致敏性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與牛乳配方乳粉相比，山羊乳配方乳粉更易被胃液消化，與牛乳過(guò)敏患者的IgE結(jié)合能力更低，并且在BALB/c小鼠食物過(guò)敏模型中，山羊乳配方乳粉致敏的小鼠從臨床癥狀、血液指標(biāo)等方面表現(xiàn)出更低的致敏水平。山羊乳配方乳粉與牛乳過(guò)敏患者血清存在一定的交叉反應(yīng)性，但其與過(guò)敏患者血清的結(jié)合能力明顯低于牛乳配方乳粉。由于過(guò)敏患者血清中的抗體主要是針對(duì)某一特定過(guò)敏蛋白產(chǎn)生的，而牛乳和山羊乳中主要的過(guò)敏原蛋白的種類，尤其是β-乳球蛋白、α-乳球蛋白以及酪蛋白是一致的，兩者只存在不同種類間含量上的細(xì)微差異，且山羊和牛的同源性高[18]，因此牛乳過(guò)敏患者血清與過(guò)敏蛋白的結(jié)合能力能夠反映山羊乳的致敏性。加之牛乳過(guò)敏人群大多是2月齡～2歲以內(nèi)的兒童，其主要食物為牛乳，臨床上難以獲得山羊乳過(guò)敏血清，后續(xù)研究可以采用山羊乳過(guò)敏患者血清進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。Anggraini[19]、段翠翠[20]等通過(guò)ELISA及組織病理學(xué)等發(fā)現(xiàn)羊乳的致敏性低于牛乳，本研究也與其結(jié)果相符。

羊和牛均屬于哺乳綱、偶蹄目、牛科，兩者在亞科水平開始存在差異，兩者在生物學(xué)上即存在較強(qiáng)的同源性。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也表明，從蛋白質(zhì)組成的角度，山羊乳配方乳粉和牛乳配方乳粉中的主要蛋白質(zhì)種類極其類似，差異主要存在于含量不同。牛羊乳具有高同源性，但羊乳的致敏性卻顯著低于牛乳，這可能是因?yàn)椴煌N類的蛋白在過(guò)敏中的作用及其致敏性不同。牛乳中主要過(guò)敏原有酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白[21]，其中，酪蛋白約占78.5%，αs1-酪蛋白是主要的致敏性蛋白[22]，有文獻(xiàn)報(bào)道，大約有65%的牛乳過(guò)敏患者對(duì)酪蛋白過(guò)敏[23]；β-乳球蛋白在牛乳中以36 kDa的二聚體形式存在，許多動(dòng)物源性過(guò)敏原，如馬主要過(guò)敏原Equ C1、主要的鼠源性尿蛋白等都屬于該類蛋白[24]；α-乳白蛋白具有調(diào)節(jié)乳糖合成的功能，并且具有較高的鈣親和力[25]，大約51%的牛乳過(guò)敏患者對(duì)該蛋白過(guò)敏[26]。而相比于牛乳，羊乳中的αs1-酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量均較低，β-酪蛋白和αs2-酪蛋白含量相對(duì)較高。有研究發(fā)現(xiàn)，牛乳和羊乳中的β-酪蛋白均會(huì)誘導(dǎo)高水平的TNF-α分泌，而αs2-酪蛋白會(huì)誘導(dǎo)IL-1β分泌[27-29]，兩者均為TH1型細(xì)胞因子，由于牛乳過(guò)敏多是TH2型免疫反應(yīng)，因此推測(cè)羊乳具有更低致敏性的原因一方面可能是由于調(diào)節(jié)TH2型反應(yīng)向TH1方向偏移所致；另一方面能是由于抗原表面位點(diǎn)差異帶來(lái)的致敏性的不同。有研究通過(guò)SOPMA、the BepiPred 1.0網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器和DNASTAR 3種生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)出了牛羊乳兩者分別所含的αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白抗原表位肽段[30]，發(fā)現(xiàn)二者抗原表位存在少部分的重疊信息，并且在腸Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)中的結(jié)果也有區(qū)別。此外，牛羊乳的酪蛋白抗原性受到胃腸消化液的影響，這有可能是因?yàn)樽冃詫?dǎo)致天然結(jié)構(gòu)破壞，內(nèi)部隱藏的抗原表位暴露。圓二色譜和紅外光譜檢測(cè)結(jié)果表明，與牛乳β-酪蛋白相比，羊乳β-酪蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的含量更低，無(wú)規(guī)則卷曲含量更高，其分子結(jié)構(gòu)更傾向于無(wú)序性，并且在pH 2～4和6～10 時(shí)，羊乳的β-酪蛋白溶解性高于牛乳β-酪蛋白，這也加強(qiáng)了羊乳中致敏蛋白的消化性，進(jìn)而表現(xiàn)出更低的致敏性[31]，本研究中模擬胃液消化的結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)蛋白質(zhì)潛在致敏性樹狀評(píng)估策略，利用生物信息學(xué)、消化穩(wěn)定性、人體血清學(xué)、動(dòng)物模型對(duì)山羊乳配方乳粉的致敏性進(jìn)行評(píng)價(jià)，利用牛乳過(guò)敏患者血清對(duì)山羊乳配方乳粉與血清中IgE之間存在的交叉反應(yīng)性進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山羊乳配方乳粉更易消化，與過(guò)敏患者血清的結(jié)合能力更弱，并且在動(dòng)物模型中表現(xiàn)出更低水平的過(guò)敏癥狀和指標(biāo)變化，交叉反應(yīng)性結(jié)果表明山羊乳配方乳粉能與牛乳過(guò)敏患者血清結(jié)合，但結(jié)合能力明顯低于牛乳配方乳粉。綜上所述，山羊乳配方乳粉與牛乳配方乳粉相比致敏性較弱，可作為一種潛在并有前景的牛乳過(guò)敏患者替代乳制品。本實(shí)驗(yàn)所采用的系統(tǒng)的致敏性評(píng)估方法，完善了目前山羊乳食物過(guò)敏研究的數(shù)據(jù)，并為其作為牛乳過(guò)敏患者的替代乳源提供了進(jìn)一步科學(xué)數(shù)據(jù)。