朱輝權(quán),王曉丹,蘇世燦,王建烽,逄曉陽,張書文,蘆 晶,*,呂加平,*
(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193;2.廈門匯盛生物有限公司,福建 廈門 361000)
二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)是人體必需的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA),對(duì)大腦健康、人體生長(zhǎng)發(fā)育,尤其嬰兒的健康成長(zhǎng)有至關(guān)重要的作用[1-2]。研究表明,向孕婦飲食中添加DHA會(huì)提高嬰兒的認(rèn)知能力[3],如果孕期DHA供給不足,可造成胎兒的腦細(xì)胞生長(zhǎng)與發(fā)育不正常,導(dǎo)致嬰兒智力低下;嚴(yán)重缺乏DHA時(shí)還可能導(dǎo)致胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)控制的代謝異常[4-5]。研究發(fā)現(xiàn),通過持續(xù)喂食富含DHA的配方奶粉,嬰兒在52周后視覺靈敏度顯著提高[6]。母乳中的DHA由飲食中的亞麻酸在去飽和酶的作用下合成,主要以甘油三酯的形式存在,但嬰兒體內(nèi)去飽和酶的活性很低,無法滿足合成需求[7-8],因此越來越多強(qiáng)化DHA的嬰幼兒配方奶粉先后在日本、美國等地問世[9],我國對(duì)DHA在嬰幼兒食品中的添加量規(guī)定為不超過0.5%(以總脂肪酸質(zhì)量計(jì)),目前DHA的允許來源有裂壺藻油、金槍魚油等[10-11]。
微藻是一種優(yōu)質(zhì)生物質(zhì)資源,被廣泛應(yīng)用于生物能源、制藥、食品、水處理、染料和飼料等領(lǐng)域[12]。微藻油脂中富含PUFA,其中DHA和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)是最有價(jià)值的功能成分。微藻被廣泛應(yīng)用于魚類和反芻動(dòng)物飼料中,以生產(chǎn)含有較高含量ω-3脂肪酸的魚、蛋、奶和其他食物[12],目前被應(yīng)用于動(dòng)物飼料成分的微藻有螺旋藻、鈍頂螺旋藻和裂壺藻[13]。
近20 年來,人們對(duì)提高反芻動(dòng)物奶中不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA)含量進(jìn)行了大量的研究[13]。在常規(guī)飼料中添加魚油或微藻粉可以在反芻動(dòng)物乳中富集UFA,且微藻比魚油富集效果更好[14]。微藻中富含的ω-3脂肪酸能有效地轉(zhuǎn)移到反芻動(dòng)物乳中,研究表明,向奶牛瘤胃中注射藻油,牛乳中ω-3脂肪酸的增加量為161%[15],而在日糧中添加微藻粉,牛乳中ω-3脂肪酸增量最高可達(dá)131%[16],羊乳中的ω-3含量可增加32%[17]。DHA在牛乳中的增加量范圍為100%~1 000%或者更多[16-18],在山羊乳和綿羊乳中增加量分別為100%和660%[17,19]。此外,研究發(fā)現(xiàn)飼喂微藻后所產(chǎn)牛乳的感官評(píng)分與未飼喂組無明顯區(qū)別[20],且飼喂魚油后所產(chǎn)牛乳制作的巴氏殺菌乳、黃油等乳制品也無腥味[21-22]。
直接向牛奶中添加藻類油會(huì)引起一些問題。DHA含有碳碳雙鍵,不飽和程度較高,容易與氧化劑發(fā)生氧化還原反應(yīng),同時(shí)更容易受到外界因素(氧氣、溫度、光照及金屬離子等)影響,導(dǎo)致含量降低;雷媛媛等[23]還發(fā)現(xiàn)隨著乳粉中DHA添加量的增加,乳粉感官評(píng)分明顯降低,這是由于DHA添加劑本身帶有一定腥味,添加到配方乳粉中會(huì)對(duì)原本乳粉體系的滋味和氣味產(chǎn)生不利影響。因此,尋找一種DHA含量高的天然奶制品尤為重要。本實(shí)驗(yàn)通過向奶山羊飼料中添加微藻粉獲得原生態(tài)DHA羊乳,并設(shè)立人工添加DHA組進(jìn)行比較,探究DHA及其他脂肪酸在室溫和高溫環(huán)境下的貯藏穩(wěn)定性,以期為制備富含DHA的天然奶制品提供理論參考。
嶗山奶山羊(40只)飼養(yǎng)于山東濰坊優(yōu)佳牧場(chǎng)。
裂壺藻粉 廈門匯盛生物有限公司;DHA微膠囊粉(DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于10%) 青島海智源生命科技有限公司。
鹽酸、硫代硫酸鈉、乙醚、異丙醇(均為分析純),正己烷(色譜純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇(色譜純) 美國Fisher Scientific公司;37種脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品 上海安普實(shí)驗(yàn)科技有限公司。
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵+DL10-2000循環(huán)冷卻器+R-1010旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀) 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;MOILE MINORTM-2000噴霧干燥塔 德國GEA公司;中試超高溫瞬時(shí)滅菌(ultrahigh temperature instantaneous sterilization,UHT)生產(chǎn)線(APV1000均質(zhì)機(jī) 丹麥APV公司;PT-20TS LAB TIT UHT Sterilization殺菌機(jī) 日本Powerpoint International公司;無菌填充室 上海沃迪智能裝備股份有限公司);8890B氣相色譜儀 美國Agilent公司;AH100D高壓均質(zhì)機(jī)加拿大ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司;MVS-1渦旋振蕩器 北京金北德工貿(mào)有限公司;ZDJ-4A自動(dòng)電位滴定儀 上海雷磁股份有限公司。
1.3.1 樣品的制作與貯藏
1.3.1.1 奶山羊飼喂與原料奶收集
挑選胎次、產(chǎn)奶量等相似的嶗山奶山羊40只,將其隨機(jī)均分為空白組和實(shí)驗(yàn)組,每組20只奶山羊。各組奶山羊飼喂相同的濃縮飼料及牧草,同時(shí)每天向每只實(shí)驗(yàn)組奶山羊飼料中添加25 g裂壺藻粉,飼喂40 d,并使羊乳的DHA含量達(dá)到30 mg/100 g,擠奶機(jī)采集羊乳后將空白組與實(shí)驗(yàn)組的羊乳于低溫(0~4 ℃)條件下冷藏,全程低溫運(yùn)送至北京及時(shí)加工處理。
1.3.1.2 UHT乳的制作
在空白組原料乳中添加DHA微膠囊粉(人工添加組),使其DHA含量與實(shí)驗(yàn)組(原生態(tài)組)山羊乳DHA含量相近,并對(duì)其進(jìn)行均勻攪拌。將人工添加組及原生態(tài)組的山羊乳進(jìn)行UHT處理:羊乳經(jīng)預(yù)熱至70~80 ℃后,采用二級(jí)均質(zhì)(一級(jí)均質(zhì)壓力20 MPa+二級(jí)均質(zhì)壓力5 MPa)處理,然后進(jìn)行(127±1)℃、7 s熱處理,滅菌后的羊乳無菌冷灌裝。將制得的UHT乳分別在25 ℃和37 ℃條件下進(jìn)行保存。UHT乳各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定從制樣當(dāng)天開始進(jìn)行,記為0 d,此后在貯藏第7、14、21、28天時(shí)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。
1.3.1.3 全脂乳粉的制作
將空白組及實(shí)驗(yàn)組羊乳進(jìn)行噴霧干燥處理,處理過程為:羊乳經(jīng)預(yù)熱殺菌(93 ℃、3 min)后進(jìn)行蒸發(fā)濃縮,待羊乳中固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到(45±2)%時(shí)進(jìn)行均質(zhì)處理(20 MPa),之后再升溫至72 ℃,進(jìn)行噴霧干燥(進(jìn)口溫度180 ℃、出口溫度80 ℃,壓力噴嘴霧化)后,取空白組乳粉,向其中添加DHA微膠囊粉(人工添加組),使其DHA含量與實(shí)驗(yàn)組(原生態(tài)組)相近。將制得的兩組羊乳粉樣品分別在25 ℃和37 ℃條件下儲(chǔ)存,進(jìn)行各指標(biāo)的檢測(cè),檢測(cè)取樣時(shí)間與UHT乳一致。
1.3.2 指標(biāo)的測(cè)定
1.3.2.1 脂肪酸含量的測(cè)定
參考Cruz-Hernandez等[24]的方法和GB 5009.168—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測(cè)定》[25],將31 mg十三碳酸甘油三酯放入10 mL容量瓶中,用正己烷溶解定容至10 mL,作為內(nèi)標(biāo)液。以HCl-甲醇混合液(1∶3,V/V)為催化劑制備脂肪酸甲酯。具體步驟如下:取250 μL樣品、300 μL內(nèi)標(biāo)液、2 mL甲醇、2 mL HCL-甲醇混合液、1 mL正己烷加入到15 mL的旋蓋玻璃試管中,渦旋振蕩1 min。然后將試管在100 ℃的水浴中加熱1 h。冷卻至室溫后,在試管中加入2 mL水,劇烈搖晃試管30 s后再1 200×g離心5 min,取上層清液(正己烷)過0.22 μm濾膜注入到氣相色譜瓶中。
色譜條件:進(jìn)樣口和檢測(cè)器的溫度均為250 ℃,載氣為氮?dú)猓魉贋?.8 mL/min,分流比為1∶20。柱溫箱升溫程序:初始溫度為50 ℃,保持1 min,然后加熱到175 ℃,升溫速率為20 ℃/min,最后加熱到230 ℃后保持5 min,升溫速率為1.3 ℃/min。
使用內(nèi)標(biāo)法對(duì)DHA進(jìn)行定量,其余脂肪酸使用面積歸一法進(jìn)行相對(duì)含量的計(jì)算。
1.3.2.2 過氧化值的測(cè)定
采用GB 5009.227—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測(cè)定》[26]中電位滴定法測(cè)定樣品中過氧化值(peroxide value,POV)。
1.3.2.3 酸價(jià)的測(cè)定
采用GB 5009.229—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價(jià)的測(cè)定》[27]中冷溶劑自動(dòng)電位滴定法測(cè)定樣品中酸價(jià)(acid value,AV)。
采用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;采用Excel軟件進(jìn)行作圖;采用SPSS軟件通過單因素方差分析方法進(jìn)行顯著性分析,以P<0.05表示差異顯著。
由表1和表2可見,人工添加DHA組UHT乳及全脂乳粉在不同溫度條件下貯藏0、7、14 d與21、28 d時(shí)DHA含量總體有顯著差異(P<0.05),原生態(tài)組乳制品與人工添加組變化趨勢(shì)相似,但原生態(tài)全脂乳粉在37 ℃條件下貯藏期內(nèi)無顯著性差異。貯藏第0天時(shí)原生態(tài)組UHT乳和全脂乳粉中DHA含量分別達(dá)到31.82、215.03 mg/100 g。同時(shí),隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),人工添加與原生態(tài)組乳制品DHA含量均降低,但原生態(tài)組的DHA含量下降速率明顯低于人工添加組,與室溫(25 ℃)貯藏條件相比,高溫(37 ℃)下各組乳制品中DHA含量降低更明顯,這表明溫度會(huì)加速DHA的氧化速率。DHA是一種PUFA,極易受到外界因素(如氧氣、光照、溫度及金屬離子)的影響而發(fā)生氧化反應(yīng),造成DHA含量的下降[28]。
表1 UHT乳貯藏期DHA含量變化Table 1 Changes in content of DHA in UHT-sterilized goat milk during storage mg/100 g
表2 全脂乳粉貯藏期DHA含量變化Table 2 Changes in content of DHA in goat milk powder during storage mg/100 g
由圖1可見,在UHT乳中,人工添加組和原生態(tài)組DHA含量的降低率在第28天時(shí)均可達(dá)到30%以上,其中37 ℃下人工添加組UHT乳DHA含量降低率(與0 d相比,下同)最高,為(40.92±3.52)%,原生態(tài)組UHT乳DHA含量降低率為(36.70±4.84)%;同時(shí),在37 ℃條件下貯藏第14天時(shí),原生態(tài)組DHA含量降低率最高,而貯藏14 d后,原生態(tài)組降低速率減緩,人工添加組降低速率增加,這說明與人工添加組相比,在貯藏前期原生態(tài)組中DHA更容易受到高溫條件的影響,但隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),DHA含量降低速率會(huì)低于人工添加組,這可能是由于前期人工添加組DHA受到微膠囊保護(hù)氧化速率較慢,隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng),包埋壁材被破壞,DHA暴露于空氣中,加速了氧化。相比于UHT乳,貯藏前期全脂乳粉人工添加組與原生態(tài)組DHA降低率均較低,在常溫(25 ℃)貯藏第14天時(shí),人工添加組與原生態(tài)組DHA含量降低率分別為6.64%和5.55%。而在14 d后,人工添加組與原生態(tài)組DHA含量降低率呈現(xiàn)急劇上升趨勢(shì),在貯藏結(jié)束時(shí)(第28天),人工添加組和原生態(tài)組在37 ℃條件下的DHA含量降低率則分別為36.37%和29.34%,DHA含量降低率小于UHT乳。張鵬等[1]選擇不同添加量的DHA含量嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行為期48 d的貯藏實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示樣品中DHA含量降低速率隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)有所變化,最高可達(dá)14.3%;李佳梅等[29]發(fā)現(xiàn)45 ℃條件下貯藏6個(gè)月后嬰幼兒配方奶粉中DHA含量的降低率僅為1.94%,本實(shí)驗(yàn)中人工添加組全脂羊乳粉在37 ℃下貯藏28 d后,DHA含量的降低率為36.37%,這與之前文獻(xiàn)報(bào)道有所不同,可能與所選的外添加粉DHA包埋方式及乳原料品種及用量不同有關(guān)。
圖1 UHT乳及全脂乳粉中DHA含量降低率Fig. 1 Change in percentage decrease of DHA content in UHT-sterilized goat milk and milk powder during storage
由表3和表5可知,貯藏時(shí)間及貯藏溫度對(duì)人工添加DHA的全脂乳粉及UHT乳的脂肪酸相對(duì)含量均有明顯影響。在貯藏期間,人工添加DHA的UHT乳中中短鏈飽和脂肪酸如丁酸(C4:0)、己酸(C6:0)、辛酸(C8:0)、癸酸(C10:0)相對(duì)含量在所有溫度下基本均呈現(xiàn)先增加后降低再增加,而全脂乳粉中的中短鏈飽和脂肪酸相對(duì)含量呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)。人工添加DHA的UHT乳中長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸如十五碳烯酸(C15:1)、十六碳烯酸(C16:1)在所有溫度下相對(duì)含量均增加,且在高溫下增加速率更高,油酸(C18:1n9c)含量則一直降低。人工添加DHA的全脂乳粉中十四碳烯酸(C14:1)、十六碳烯酸(C16:1)、油酸(C18:1n9c)的相對(duì)含量則呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。棕櫚酸(C16:0)、十七烷酸(C17:0)在人工添加DHA的UHT乳和全脂乳粉中相對(duì)含量保持穩(wěn)定。牛乳中的脂質(zhì)在貯藏期間會(huì)發(fā)生自動(dòng)氧化,其中不飽和脂肪酸自動(dòng)氧化加氫斷裂形成飽和脂肪酸及更短的脂肪酸[30],在人工添加DHA的UHT乳及全脂乳粉中,隨貯藏期的延長(zhǎng),不同脂肪酸表現(xiàn)出不一樣的變化規(guī)律,中短鏈飽和脂肪酸相對(duì)含量整體增加,UHT乳中長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸相對(duì)含量增加,全脂乳粉中長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸相對(duì)含量則降低。
由表4和表6可見,貯藏時(shí)間及貯藏溫度對(duì)原生態(tài)DHA組全脂乳粉及UHT乳的脂肪酸含量有明顯影響。隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),原生態(tài)DHA組UHT乳中飽和脂肪酸如C4:0、C6:0相對(duì)含量上升,而在全脂乳粉中,C4:0、C6:0相對(duì)含量減少。此外,原生態(tài)DHA組UHT乳和全脂乳粉中C8:0和C10:0相對(duì)含量在貯藏期間呈基本穩(wěn)定狀態(tài)。這可能是由于全脂乳粉中C4:0、C6:0進(jìn)一步氧化生成碳鏈更短的脂肪酸如乙酸、丙酸等。原生態(tài)DHA組UHT乳中不飽和脂肪酸C15:1相對(duì)含量增加,C16:1、C18:2n6c相對(duì)含量減少,C18:3n3相對(duì)含量保持穩(wěn)定。全脂乳粉中C14:1、C15:1、C18:1n9c、C18:2n6c相對(duì)含量均降低。長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸C16:0相對(duì)含量在UHT乳和全脂乳粉中含量均保持穩(wěn)定。與人工添加組相比,原生態(tài)DHA乳制品的PUFA含量降低速率會(huì)更高,這可能是由于飼喂微藻會(huì)增加羊乳中PUFA的含量[17],因此原生態(tài)羊乳制品中在貯藏開始時(shí)(第0天)PUFA含量就明顯高于人工添加組,而PUFA在貯藏過程中會(huì)受到空氣、光照水分等因素的影響被氧化成碳鏈更短的脂肪酸,進(jìn)而導(dǎo)致PUFA相對(duì)含量降低。
表3 人工添加組UHT乳貯藏期脂肪酸相對(duì)含量變化Table 3 Changes in fatty acid contents in UHT-sterilized milk artificially added with DHA during storage %
續(xù)表3 %
表4 原生態(tài)組UHT乳貯藏期脂肪酸相對(duì)含量變化Table 4 Changes in fatty acid contents in UHT-sterilized milk naturally enriched with DHA during storage %
續(xù)表4 %
表5 人工添加DHA全脂乳粉貯藏期脂肪酸相對(duì)含量變化Table 5 Changes in fatty acid contents in milk powder artificially added with DHA during storage %
續(xù)表5 %
表6 原生態(tài)DHA全脂乳粉貯藏期脂肪酸相對(duì)含量變化Table 6 Changes in fatty acid contents of milk powder naturally rich in DHA during storage %
續(xù)表6 %
POV和AV是衡量貯藏期食品中油脂氧化程度的重要指標(biāo)。由圖2可知,各組UHT乳及全脂乳粉在常溫(25 ℃)及高溫條件(37 ℃)下POV總體均呈現(xiàn)上升趨勢(shì),且高溫會(huì)加速乳制品POV的升高。UHT乳中人工添加組在37 ℃條件貯藏末期POV可達(dá)8.35 meq/kg,同期原生態(tài)組中POV為3.71 meq/kg;與UHT乳相比,乳粉POV上升趨勢(shì)較緩,且原生態(tài)組乳粉在25 ℃貯藏期內(nèi)無明顯變化,說明與人工添加DHA乳制品相比,原生態(tài)DHA乳制品抗氧化能力更強(qiáng)。乳制品在貯藏期間脂質(zhì)會(huì)發(fā)生自動(dòng)氧化產(chǎn)生過氧化物[30],引起POV升高,同時(shí),高溫會(huì)加速脂肪的共價(jià)鍵發(fā)生斷裂,生成自由基,引起脂肪的氧化,因而降低貯藏溫度可減緩脂質(zhì)的氧化速度[31]。
圖2 UHT乳及全脂乳粉貯藏期POV的變化Fig. 2 Variation in POV of UHT-sterilized milk and milk powder during storage
由圖3可知,UHT乳及全脂乳粉貯藏期間AV均上升,說明貯藏期間樣品中脂肪發(fā)生了一定程度的水解。37 ℃下人工添加DHA組UHT乳與其他組相比,AV上升明顯,且在第21天后急速增加,在貯藏第28天時(shí)達(dá)到最高(4.48 mg/g);與UHT乳相比,全脂乳粉AV則相對(duì)上升緩慢,這可能是與全脂乳粉中水分活度低有關(guān)。同時(shí),與POV相似,原生態(tài)組AV上升速率較人工添加組緩慢,在37 ℃貯藏28 d時(shí),人工添加組UHT乳和全脂乳粉中AV分別可達(dá)原生態(tài)組的503%和142%。此外,對(duì)于全脂乳粉來說,在貯藏第28天時(shí),原生態(tài)DHA組全脂乳粉在高溫條件下POV和AV分別為1.16 meq/kg和1.11 mg/g,此時(shí)人工添加DHA組全脂乳粉中POV和AV分別是原生態(tài)組的179%和142%。Celestino等[32]研究發(fā)現(xiàn),鮮乳中含有微生物產(chǎn)生的耐熱性脂肪酶,這些酶可耐受高溫而殘留在乳粉中,在貯藏過程中可分解乳脂中的甘油三酯,生成游離脂肪酸和甘油等物質(zhì),造成全脂羊乳粉脂肪AV上升,而高溫可加速水解反應(yīng),游離脂肪酸生成積累速度加快,AV上升速度較快,同時(shí)游離脂肪酸含量的增加對(duì)全脂羊乳粉脂肪的氧化有一定的促進(jìn)作用。
圖3 UHT乳及全脂乳粉貯藏期AV的變化Fig. 3 Variation in AV of UHT-sterilized milk and milk powder during storage
本研究通過向奶山羊飼料中添加DHA微藻粉獲得天然原生態(tài)DHA羊乳,將其制作成UHT乳及全脂乳粉,同時(shí)設(shè)立人工添加DHA微膠囊粉的UHT乳及全脂乳粉作為對(duì)照組,在常溫(25 ℃)與高溫(37 ℃)下進(jìn)行為期28 d的貯藏實(shí)驗(yàn),并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。結(jié)果表明,隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),原生態(tài)組UHT乳和全脂乳粉中的DHA含量降低率低于人工添加組,且在貯藏前期,原生態(tài)組UHT乳中DHA含量更易受到高溫影響。POV和AV是評(píng)定貯藏期油脂氧化程度的重要指標(biāo),在貯藏期間,原生態(tài)DHA組UHT乳及全脂乳粉POV和AV上升速率明顯低于人工添加DHA組,在貯藏第28天時(shí),原生態(tài)DHA組全脂乳粉在高溫條件下POV和AV分別為1.16 meq/kg和1.11 mg/g,此時(shí)人工添加DHA組全脂乳粉中POV和AV分別是原生態(tài)的179%和142%。通過UHT乳和全脂乳粉貯藏期間脂肪酸含量變化研究可知,原生態(tài)與人工添加DHA的UHT乳和全脂乳粉中PUFA含量下降,且與人工添加DHA的全脂乳粉相比,原生態(tài)組乳制品中多不飽和脂肪酸含量更高,更易氧化生成碳鏈更短的脂肪酸,這與脂肪酸的自動(dòng)氧化緊密相關(guān)。