熊凱，陳禹，計亮年，巢暉

中山大學化學學院，生物無機與合成化學教育部重點實驗室，廣州 510006

1 引言

癌癥已經(jīng)成為嚴重威脅人類健康的主要病因。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球112個國家中，癌癥是70歲之前死亡的第一或第二大原因；在另外23個國家中，癌癥居死亡原因的第三或第四位。國際癌癥研究機構最新的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球癌癥病例呈現(xiàn)迅猛增長態(tài)勢。2018年約有1810萬例癌癥新增病例和960萬死亡病例[1]，這一數(shù)值在2020年分別上漲至1930萬和1000萬[2]。中國也面臨著癌癥的嚴重威脅，我國惡性腫瘤發(fā)病占全球的23.9%，惡性腫瘤死亡占我國居民死亡的23.9%[3]。

盡管靶向治療和免疫治療發(fā)展迅猛，但是化療仍然是目前臨床癌癥治療的最主要手段之一，其中鉑類化療藥物占據(jù)很大比例，是多種癌癥化療臨床方案的主要選擇。2019年，中國鉑類化療市場銷售收入高達人民幣40億元。鉑類化療藥物的研究最早興起于20世紀60年代。1969年美國密歇根州立大學教授Barnett Rosenberg等首次報道順鉑具有抗腫瘤活性[4]。自此，鉑類藥物獲得了全球眾多科學家的青睞。目前已經(jīng)形成以順鉑、卡鉑和奧沙利鉑分別為代表的第一、第二、第三代鉑類化療藥物[5]。然而在長期臨床實踐中，患者對鉑類化療藥物表現(xiàn)出先天性或后天獲得性的耐藥性，極大地限制了這類藥物的療效[6]。

線粒體科學是當今化學、生命科學及分子醫(yī)學最為活躍的交叉前沿研究領域之一。線粒體是生物細胞中負責能量供給、調(diào)控細胞存亡的重要細胞器。腫瘤細胞與正常細胞的線粒體無論在結構上還是功能上都存在較大差異，腫瘤細胞由于發(fā)生較為廣泛的變異，如更加脆弱的氧化還原平衡、基因組不穩(wěn)定而更容易受線粒體損傷的影響。此外，代謝重編程是癌癥細胞的一個核心特征，它與線粒體錯綜復雜地聯(lián)系在一起，為開發(fā)針對癌癥的藥物提供了獨特的機會。從細胞代謝的全局來看，癌細胞線粒體的能量代謝途徑由氧化磷酸化的有氧呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)橐蕴墙徒鉃橹鞯臒o氧呼吸(Warburg effect)，其中間產(chǎn)物通常用于合成代謝反應中的氧化磷酸化[7,8]；氧化磷酸化過程中產(chǎn)生的活性氧自由基還可導致線粒體蛋白、DNA和RNA分子的氧化[9,10]。

金屬藥物在藥物發(fā)展的舞臺上扮演著不可或缺的重要角色。2019年中國科學院主辦了“金屬化學生物學前沿論壇”“金屬藥物及金屬材料應用于疾病診療及生物安全性評價”作為論壇三個討論主題之一，是金屬化學生物學的一個重要研究方向。在此背景下，以結構穩(wěn)定、具有獨特三維立體構型的釕、銥等非鉑類金屬配合物為構筑單元，可以有效跳出傳統(tǒng)鉑類化療藥物的局限。此外，相比于正常細胞，腫瘤細胞通常具有較高的線粒體膜電位，有利于帶正電荷的金屬基抗腫瘤藥物實現(xiàn)在線粒體中的靶向累積，將有助于實現(xiàn)選擇性地殺傷腫瘤細胞。在本文中，我們將簡要介紹鉑類化療藥物耐藥機制和線粒體靶向的環(huán)金屬銥(III)配合物克服腫瘤耐藥研究進展。

2 鉑類化療藥物耐藥機制

鉑類化療藥物的耐藥性原因眾多。以順鉑為例，其屬于細胞周期非特異性藥物，主要通過進入腫瘤細胞后與DNA形成Pt-DNA加合物，從而介導腫瘤細胞壞死或凋亡，進而產(chǎn)生抗癌效果。如圖1所示，順鉑發(fā)揮作用包括三個過程：通過自由擴散以及跨膜主動運轉(zhuǎn)進入細胞(過程1)；在細胞內(nèi)發(fā)生離解反應生成水合配離子(過程2)；向靶DNA遷移，與DNA配位形成Pt-DNA加合物，使DNA的合成受阻(過程3)。在這三個過程中，腫瘤細胞均可能應激導致順鉑耐藥[11]。

(1)攝取過程：順鉑通過主動運輸協(xié)同自由擴散被細胞攝取。在此應激下，一些癌細胞高表達三磷酸腺苷結合轉(zhuǎn)運蛋白(ABC)超家族酶，如P糖蛋白(ABCB1，又名P-gp或MRP1)、ABCG2(又名MRP2)、ABCG3(又名MRP3)等，這些蛋白作為分子泵會將細胞內(nèi)順鉑外排至細胞外，降低細胞內(nèi)藥物分子有效濃度，從而引起耐藥[12]。

(2)水解過程(一系列水分子取代一個或兩個氯原子過程)：細胞內(nèi)氯離子濃度(約2-10 mmol·L-1)低于細胞外環(huán)境(約110 mmol·L-1)，順鉑在細胞內(nèi)更易發(fā)生這一水解反應。但由于這一水解過程主要在細胞質(zhì)中發(fā)生，而細胞質(zhì)中富含還原性谷胱甘肽(GSH)、RNA以及金屬硫蛋白等含半胱氨酸/蛋氨酸蛋白質(zhì)，水解產(chǎn)物易與這些內(nèi)源性親核試劑相互作用(圖1，過程4)，阻止順鉑進入細胞核與DNA結合，從而引起順鉑失活[13]。

(3)DNA損傷過程：順鉑水解產(chǎn)物與DNA上鳥嘌呤共價結合致使DNA損傷，最終殺傷癌細胞。然而細胞核中存在多種DNA損傷修復機制，如光修復、錯配修復、切除修復、重組修復、烷基轉(zhuǎn)移修復等，其中核苷酸切除修復、堿基錯配修復、DNA雙鏈斷裂損傷修復及跨損傷修復與順鉑耐藥密切相關。腫瘤細胞通過上調(diào)這些特定DNA修復酶抵抗順鉑誘導的DNA損傷[14]。

上述順鉑耐藥機制集中于藥物作用靶點或者藥物代謝、藥物運輸?shù)劝悬c上游活動。而近些年來，隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展機制研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)除了上述因素之外，細胞對于藥物作用的反應也會累積耐藥結果，其表現(xiàn)為凋亡機制的失調(diào)。作為細胞程序性死亡模式，凋亡涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控，由幾十種抗凋亡和促凋亡蛋白組成，同時也受多種致癌信號的影響，調(diào)控難度大[15]。

3 線粒體靶向銥(III)配合物克服腫瘤耐藥

作為可預見的治療靶點，線粒體靶向抗腫瘤試劑在克服腫瘤耐藥、治療腫瘤中具有十分突出的優(yōu)勢。相比于正常細胞，腫瘤細胞通常具有較高的線粒體膜電位，有利于帶正電荷的金屬基抗腫瘤藥物實現(xiàn)在線粒體中的累積，有可能實現(xiàn)選擇性地殺傷腫瘤細胞[16,17]。針對上述順鉑耐藥關鍵機制，中山大學巢暉課題組開展了系列研究。

3.1 靶向線粒體DNA

人體細胞內(nèi)僅有線粒體和細胞核這兩種細胞器具有DNA。與細胞核強大的DNA損傷修復機制不同，線粒體DNA損傷機制較為匱乏、單一，因此誘導線粒體DNA損傷可以規(guī)避細胞核DNA損傷修復機制所引起的耐藥。

在前期實現(xiàn)銥(III)配合物線粒體靶向性的基礎上，通過將順鉑與銥(III)配合物有機結合，構建了異雙核金屬配合物Ir-Pt，并應用于線粒體靶向抗腫瘤(圖2)[18]。電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)等實驗結果證實，被細胞攝取的Ir-Pt中有80%富集于線粒體。有趣的是，這一設計策略不僅有效改變順鉑的細胞內(nèi)靶向性，還提高了順鉑的細胞攝取量并減少耐藥腫瘤細胞對順鉑的外排，顯著提高細胞內(nèi)順鉑有效濃度。Ir-Pt孵育12小時后，順鉑耐藥的人非小細胞肺癌細胞A549R中Pt元素含量為41.2±2.5 ng/106細胞；作為對照，同等條件下，順鉑在該細胞中的攝取僅為5.1±1.3 ng/106細胞。體外抗腫瘤活性篩選實驗結果表明，48小時Ir-Pt對A549R細胞的半抑制濃度(IC50)為2.46±0.28 μmol，與順鉑的半抑制濃度(78.8±8.9 μmol)相比提高了32.8倍，表明Ir-Pt可有效克服順鉑耐藥。后續(xù)的細胞生物學實驗結果表明，Ir-Pt高效損傷線粒體DNA、改變腫瘤細胞能量代謝途徑、誘導線粒體去極化。值得注意的是，Ir-Pt誘導A549R細胞的死亡方式是壞死而非傳統(tǒng)的凋亡。半胱氨酸蛋白酶(caspase)級聯(lián)反應檢測、不同死亡方式抑制劑篩選以及壞死關鍵信號蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)均證實了這一結論。

圖2 具有線粒體靶向的異雙核配合物Ir-Pt克服腫瘤耐藥示意圖[18]

Ir-Pt雖然取得顯著的克服腫瘤耐藥效果，但其結構中順鉑衍生物的水解過程與順鉑類似，屬于不可控的自發(fā)過程，在到達作用靶點前有可能與細胞中的內(nèi)源性親核試劑相互作用，引發(fā)毒副作用。因此，巢暉等利用配位不飽和的釕(II)多吡啶結構取代Ir-Pt中順鉑衍生物，構建了另一例異雙核金屬配合物Ir-Ru(圖3)。與Ir-Pt不同，Ir-Ru具有生理穩(wěn)定性，確保其可更高效地富集于作用靶點。當?shù)竭_作用位點后，利用可見光(450 nm，藍光)照射可使Ir-Ru光解離，實現(xiàn)時空可控的特異激活。解離后的釕(II)多吡啶部分與線粒體DNA共價結合，損傷線粒體DNA，實現(xiàn)光激活化療(PACT)；而銥(III)配合物部分作為光敏劑，在405 nm光照下產(chǎn)生具有強氧化性的單線態(tài)氧，協(xié)同損傷線粒體DNA，實現(xiàn)光動力治療(PDT)。體外抗腫瘤活性篩選實驗結果表明，PACT和PDT協(xié)同顯著提高了Ir-Ru對A549R細胞的抗腫瘤活性(IC50=0.45±0.1 μmol)，與順鉑活性相比提高了205.6倍。該策略為后續(xù)金屬前藥的開發(fā)提供了新思路[19]。

圖3 具有線粒體靶向的異雙核配合物Ir-Ru通過PACT和PDT協(xié)同克服腫瘤耐藥示意圖[19]

3.2 靶向線粒體拓撲異構酶I

拓撲異構酶是催化DNA鏈斷裂和結合，從而調(diào)控DNA拓撲狀態(tài)的一類酶。由于腫瘤細胞的快速增殖，拓撲異構酶在腫瘤細胞中表現(xiàn)出不受其他因素影響的高水平表達，成為腫瘤化療藥物的一個重要靶標。拓撲異構酶存在于細胞核及線粒體中，但現(xiàn)有的臨床藥物及相關研究均集中于細胞核拓撲異構酶抑制。巢暉課題組前期構建了系列基于金屬配合物的拓撲異構酶抑制劑，展現(xiàn)優(yōu)異的抗腫瘤活性，但這些配合物的細胞核靶向性以及克服腫瘤耐藥的能力尚不明確。2020年，在前期工作基礎上，通過輔助配體改變配合物的電荷和脂溶性，從而調(diào)控配合物的細胞攝取量和細胞器靶向性，開發(fā)了具有細胞核靶向性的釕(II)基拓撲異構酶I/II雙重催化抑制。首次揭示了釕(II)配合物通過抑制拓撲異構酶，誘導腫瘤細胞壞死性凋亡之間的內(nèi)在聯(lián)系；同時首次在活體模式動物上系統(tǒng)評估誘導腫瘤細胞壞死性凋亡的金屬配合物克服腫瘤耐藥效果[20]。

上述工作中，拓撲異構酶抑制介導的DNA損傷是激活腫瘤細胞壞死性凋亡的上游事件，耐藥腫瘤可能上調(diào)特定的DNA修復酶從而削弱藥效。而線粒體DNA損傷修復機制較為單一，因此巢暉等進一步發(fā)展線粒體拓撲異構酶抑制劑。將已報道的拓撲異構酶抑制劑茚并異喹啉酮，通過柔性烷基鏈嫁接至銥(III)配合物，構筑了首例基于金屬配合物的線粒體拓撲異構酶抑制劑Ir1和Ir2(圖4)。拓撲異構酶介導的DNA解旋凝膠電泳實驗證實，Ir1和Ir2可高效抑制線粒體拓撲異構酶I活性，其效果優(yōu)于喜樹堿(臨床使用的拓撲異構酶抑制劑)。抑制機理實驗表明Ir1和Ir2是線粒體拓撲異構酶I毒劑，通過形成穩(wěn)定的拓撲異構酶-DNA-抑制劑三元復合物，抑制拓撲異構酶活性。進一步的研究表明，Ir1和Ir2誘發(fā)拓撲異構酶抑制介導的線粒體DNA損傷、破壞線粒體氧化還原平衡、誘導線粒體去極化，最終誘導細胞凋亡。值得一提的是，Ir1和Ir2對A549R細胞的抗腫瘤活性比順鉑提高約30倍，有效克服腫瘤耐藥，具有良好的應用前景[21]。

圖4 基于銥(III)配合物的線粒體拓撲異構酶抑制劑克服腫瘤耐藥示意圖[21]

3.3 誘導非凋亡性死亡

如上文所述，許多腫瘤細胞通過凋亡機制的失調(diào)表現(xiàn)出耐藥性。非凋亡性死亡通常包括壞死(Necrosis)、壞死性凋亡(Necroptosis)、自噬(Autophagy)、副凋亡(Paraptosis)、脹亡(Oncosis)、鐵死亡(Ferroptosis)、焦亡(Pyroptosis)、失巢凋亡(Anoikis)、有絲分裂災難(Mitotic Catastrophe)等。除不受控制的壞死之外，其余死亡方式都受到細胞信號通路控制，為程序性死亡。這些死亡方式在細胞超微結構形態(tài)、信號通路調(diào)控蛋白、執(zhí)行死亡的關鍵蛋白上均與凋亡不同，為規(guī)避凋亡抗性耐藥提供了理論基礎。

金屬配合物誘導腫瘤非凋亡性死亡的研究尚處于起步階段，而其中具有線粒體靶向性的更是罕見。前文提到的Ir-Pt可誘導腫瘤耐藥細胞壞死，但由于壞死是不受控的死亡方式，人們更希望能夠發(fā)展可誘導腫瘤耐藥細胞程序性死亡的藥物。2018年，巢暉課題組開發(fā)了系列靶向線粒體的診療試劑Ir3–Ir6(圖5)[22]。該系列配合物具有良好的廣譜抗腫瘤活性，并對正常細胞具有良好的選擇性。體外抗腫瘤活性篩選實驗結果表明，Ir3–Ir6可有效殺傷來自不同組織器官的共計21個腫瘤細胞系，其中包括7種耐藥細胞，展現(xiàn)優(yōu)異的克服腫瘤耐藥能力。Ir3–Ir6還具有高度選擇性，其對腫瘤細胞和正常細胞的IC50值相差30倍以上，為后續(xù)臨床應用奠定堅實基礎。值得注意的是，在研究過程中發(fā)現(xiàn)Ir3–Ir6殺傷腫瘤細胞時，細胞的死亡形態(tài)與傳統(tǒng)的凋亡顯著不同。Ir3–Ir6孵育后的腫瘤細胞出現(xiàn)大量空泡；隨著孵育時間增長，還可以觀察到細胞鼓泡等現(xiàn)象(圖5)。進一步的機理研究表明，Ir3–Ir6誘導線粒體去極化及細胞內(nèi)ATP含量驟降，隨后激活前脹亡受體Porimin并誘導細胞骨架(α-Tubulin和β-Actin)坍塌，改變細胞膜通透性改變(乳酸脫氫酶釋放)，最終誘導細胞脹亡。

圖5 誘導耐藥腫瘤細胞脹亡的銥(III)配合物結構及細胞脹亡形態(tài)變化[22]

壞死性凋亡是另一種非凋亡性細胞死亡方式，具有壞死和細胞凋亡的共同特征。壞死性凋亡雖然與凋亡共享著一些上游的信號元件，但壞死性凋亡不依賴于caspase的酶聯(lián)激活，且每個過程的細胞形態(tài)有明顯差異，特別是壞死性凋亡最終會導致細胞膜破裂，釋放內(nèi)容物。前文提到，巢暉課題組在2020年開發(fā)了具有細胞核靶向性的釕(II)基拓撲異構酶I/II雙重催化抑制。首次揭示了釕(II)配合物通過抑制拓撲異構酶，誘導腫瘤細胞壞死性凋亡之間的內(nèi)在聯(lián)系；同時首次在活體模式動物上系統(tǒng)評估誘導腫瘤細胞壞死性凋亡的金屬配合物克服腫瘤耐藥效果[20]。

在此基礎上，該課題組進一步構建了銥(III)配合物Ir7和Ir8(圖6)[23]。ICP-MS結果證實Ir7和Ir8選擇性富集于A549R細胞線粒體中。Ir7和Ir8誘導線粒體氧化應激、引起線粒體膜電位喪失，隨后激活絲氨酸酸酸激酶3(RIPK3)及下游混合系激酶結構域樣偽激酶(MLKL)。激活后的MLKL發(fā)生四聚，在細胞膜形成通道，破裂細胞膜通透性，釋放細胞質(zhì)中的乳酸脫氫酶(LDH)，最終引發(fā)細胞壞死性凋亡。有趣的是，Ir7和Ir8還通過下調(diào)細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK1、CDK2、CDK4與CDK6)和細胞周期蛋白(A2與D2)，阻滯細胞周期停留于G0/G1期，展現(xiàn)多途徑的抗腫瘤能力。體外抗腫瘤活性篩選實驗結果表明，Ir7和Ir8展現(xiàn)出良好的克服腫瘤耐藥能力。

圖6 線粒體靶向Ir7和Ir8多途徑克服腫瘤耐藥機理示意圖[23]

3.4 其他

除上述工作之外，中山大學巢暉等還利用銥(III)配合物豐富的光物理性能和長壽命，制備了系列線粒體靶向光敏劑用于克服腫瘤耐藥[24]；針對實體腫瘤乏氧微環(huán)境，通過引入具有可逆氧化還原性質(zhì)的蒽醌基團，構筑線粒體靶向、腫瘤微環(huán)境激活的銥(III)-蒽醌配合物，實現(xiàn)高選擇性地殺傷腫瘤耐藥細胞[25]。通過利用線粒體靶向銥(III)配合物與納米材料有機雜合，發(fā)展系列無機納米雜合材料實現(xiàn)高抗腫瘤活性[26]。由于篇幅限制，在此僅列出參考文獻，供有興趣的讀者查閱。

4 結語

腫瘤的耐藥性仍然是實現(xiàn)癌癥患者治愈的主要限制因素。近些年，針對鉑類化療藥物的缺陷，特別是針對其耐藥機制，巢暉等嘗試以非鉑類金屬配合物為構建單元，通過結構裁剪調(diào)控配合物生物活性及細胞器靶向性，成功開發(fā)了系列線粒體靶向的銥(III)基抗腫瘤試劑。在作用機制方面，通過改變作用靶點規(guī)避細胞核DNA損傷修復機制、通過誘導非凋亡性死亡途徑規(guī)避凋亡抗性機制，同時結合化療、光動力治療、光熱治療、聲動力治療等實現(xiàn)多模式、多途徑克服腫瘤耐藥。相關工作以表格形式進行了總結(表1)。但是，目前這一領域的研究尚處于起步階段，仍有大量科學問題待解決。金屬配合物結構與其克服腫瘤耐藥之間的關系尚不明確，特別是金屬配合物抗腫瘤的作用靶標、作用途徑以及作用機制的研究仍是具有挑戰(zhàn)性的前沿科學問題，還有待于化學、生物、醫(yī)學等多學科科研人員進行交叉的深入探索。我們也希望通過這篇介紹，能夠讓學生、教師等讀者更好地理解了腫瘤耐藥性治療領域，同時為相關科研工作者提供了設計研究思路，為實現(xiàn)耐藥腫瘤治療、全面推進健康中國建設貢獻力量。

表1 線粒體靶向Ir配合物主要性質(zhì)及優(yōu)缺點