王秋祥，劉奕辛，葛昆，張金超，周國強1,,＊

1河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000

2河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002

骨作為一種分層結(jié)構(gòu)的復(fù)合材料，在脊椎動物中發(fā)揮著重要的結(jié)構(gòu)和生理功能。骨骼為關(guān)節(jié)、肌腱和韌帶提供機械支撐，保護重要器官免受損傷，并作為鈣和磷酸鹽的儲備庫發(fā)揮著重要的代謝作用[1]。由于事故、疾病和衰老等原因，骨骼很容易受到損害。受損的骨組織具有自我修復(fù)和再生的潛力，但這種能力是有限的，如嚴(yán)重骨折、關(guān)節(jié)痛、骨質(zhì)疏松、腫瘤、感染等高沖擊創(chuàng)傷或臨界尺寸的骨缺損超出了自我愈合能力，需要手術(shù)干預(yù)和使用人工骨填充劑來進行治療[2,3]。目前，骨修復(fù)的臨床治療方法包括自體移植、異體移植和異種移植，這三種方法都具有各自的局限性，自體移植來源受限，手術(shù)時間長且容易患創(chuàng)傷并發(fā)癥；異體移植面臨免疫排斥，感染的風(fēng)險；異種移植存在吸收率低，塑性差的缺點[4,5]。隨著納米科學(xué)、材料學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織工程與再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展和進步，納米材料和仿生材料已經(jīng)成為骨修復(fù)材料的主要發(fā)展趨勢。近年來，用于骨組織修復(fù)的主要有無機材料、高分子聚合物、納米仿生骨等。其中，無機納米材料因其具有易加工、良好的力學(xué)性能、在體內(nèi)能保持穩(wěn)定數(shù)周等優(yōu)點使其具有廣闊的應(yīng)用前景。納米羥基磷灰石、稀土納米顆粒、金納米顆粒和碳納米管是目前在骨代謝調(diào)控領(lǐng)域研究較多的幾種無機納米材料，這幾種材料可以通過可控的力學(xué)性能、孔徑、孔隙度和良好的生物相容性來模擬天然骨中的羥基磷灰石結(jié)構(gòu)，制備出與天然骨成分、結(jié)構(gòu)和性能類似的新型骨修復(fù)材料[6-9]。文章詳細(xì)介紹了納米羥基磷灰石、稀土納米顆粒、金納米顆粒和碳納米管的性質(zhì)及對骨代謝的調(diào)控機制，為無機納米材料在骨組織工程的應(yīng)用研究提供了理論基礎(chǔ)。

1 納米羥基磷灰石在骨代謝中的應(yīng)用

納米羥基磷灰石，簡稱nHAP，分子結(jié)構(gòu)為Ca10(PO4)6(OH)2，天然的納米羥基磷灰石為六方晶體結(jié)構(gòu)，其中Ca:P的化學(xué)計量比通常為1.67。nHAP因其組成與體內(nèi)骨礦物物質(zhì)相似，生物相容性好，無毒副作用被廣泛應(yīng)用于骨修復(fù)，參與成骨作用和骨微環(huán)境的調(diào)控[6,10]。

1.1 骨細(xì)胞調(diào)控

骨發(fā)育是通過多種事件同步作用形成機體支架，骨及周圍微環(huán)境的修復(fù)潛力貫穿整個成年期，可以維持骨代謝穩(wěn)態(tài)。羥基磷灰石可以通過調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞等的分化來調(diào)控骨微環(huán)境。間充質(zhì)干細(xì)胞是一種多功能的分化細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化的同時會降低成脂分化的比例?？梢酝ㄟ^加入地塞米松、磷酸甘油和維生素C或骨形成蛋白的方法來誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化表現(xiàn)為堿性磷酸酶(ALP)的表達、細(xì)胞內(nèi)礦質(zhì)沉積和COL1、OCN、OPN等基因的表達。Remya等[11]將納米羥基磷灰石與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)顆粒濃度為20 μg·mL-1時，nHAP顆粒能顯著促進細(xì)胞的增殖，但高濃度的nHAP會導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則。納米羥基磷灰石的長徑比越大對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖及分化能力促進作用越強，長徑比較小的nHAP對細(xì)胞的增殖、分化及礦化能力的抑制作用較強[12]。

成骨細(xì)胞由間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來，可促進骨形成，成骨分化的標(biāo)志物為ALP，ALP含量越高，促進骨形成作用越明顯。破骨細(xì)胞可促進骨吸收，破骨分化標(biāo)志物為抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和組織蛋白酶(CTSK)，TRAP和CTSK的含量越高，骨基質(zhì)的吸收能力越強，保持成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞含量的相對穩(wěn)定是維持骨代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。骨缺損時成骨細(xì)胞相對含量降低，破骨細(xì)胞含量相對升高。納米羥基磷灰石可顯著提高成骨細(xì)胞的增殖、黏附、分化和礦化能力。研究表明20 nm的羥基磷灰石骨修復(fù)效果最好，最適濃度為20 μg·mL-1，濃度高于20 μg·mL-1后納米羥基磷灰石開始抑制成骨細(xì)胞增殖并引起細(xì)胞凋亡[13,14]。表面光滑的羥基磷灰石比粗糙的羥基磷灰石更有利于促進成骨細(xì)胞的增殖，與天然羥基磷灰石鈣磷比接近的仿生磷灰石，更易誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的增殖、黏附和分化[15,16]。溫波等[17]將破骨細(xì)胞與納米羥基磷灰石和微米羥基磷灰石共培養(yǎng)檢測骨陷窩形成的數(shù)量及TRAP的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)納米級的材料骨吸收能力更強，與對照組相比骨陷窩的數(shù)量和TRAP的含量顯著降低。

骨微環(huán)境的調(diào)控除調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的平衡之外還需要調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞、雪旺細(xì)胞、炎性因子和生長因子之間的相互作用。內(nèi)皮細(xì)胞參與血管形成，為骨修復(fù)提供代謝所需營養(yǎng)素、可再生自體細(xì)胞和各種生長因子等物質(zhì)，理想的骨替代物應(yīng)具有調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的功能。Shi等[18]以人臍帶血內(nèi)皮細(xì)胞為模型探討了羥基磷灰石納米顆粒對內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響和潛在機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石納米顆粒以劑量依賴性的方式顯著抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力和血管生成能力。雪旺細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進受損神經(jīng)元及其軸突的再生，參與周圍神經(jīng)系統(tǒng)纖維的形成。孟帥岑[19]發(fā)現(xiàn)含有羥基磷灰石涂層的鈦骨表面能夠顯著促進雪旺細(xì)胞的增殖和粘附。此外骨微環(huán)境的調(diào)控涉及表觀遺傳的調(diào)控，如組蛋白乙?；腿旧|(zhì)重塑的改變，體內(nèi)分泌的生長因子和各種炎性因子可以參與骨代謝的調(diào)控并刺激細(xì)胞釋放相關(guān)基因[20]。

1.2 骨礦物相影響

圖1 nHA通過cAMP/PKA信號通路促進BMSCs成骨分化的示意圖[21]

骨肉瘤是一種多發(fā)于青少年的常見惡性腫瘤，患者臨床表現(xiàn)包括間歇性疼痛、跛行、體重下降、器官衰竭等癥狀。羥基磷灰石可促進鈣化，提升堿性磷酸酶等蛋白的水平，有效促進骨愈合，治療骨肉瘤所引起的溶骨性疾病等并發(fā)癥。Zhu等[24]發(fā)現(xiàn)植入羥基磷灰石的動物相比不添加任何材料的動物，傷口明顯縮小，能夠形成新的骨基質(zhì)，骨修復(fù)能力顯著增強。Lambert等[25]將三種形貌的羥基磷灰石植入家兔鼻竇提升模型，植入1、5和12周后采用非脫鈣切片進行組織學(xué)和組織形態(tài)測量，發(fā)現(xiàn)三種不同形貌的羥基磷灰石均會刺激骨再生，但天然羥基磷灰石較人工合成的羥基磷灰石有更好的骨-材料接觸面，具有更好的成骨效果。Wang等[26]構(gòu)建矢狀縫模型評估羥基磷灰石對矢狀縫線的縫間隙面積、骨體積分?jǐn)?shù)和骨密度機械性能及矢狀縫骨形成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外濃度為25 μg·mL-1羥基磷灰石在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白表達明顯高于其他組，縫線間隙面積減小，矢狀縫線的骨體積分?jǐn)?shù)、骨密度、硬度和彈性模量顯著增加。

2 稀土納米顆粒在骨代謝中的應(yīng)用

稀土元素主要由鑭系元素和釔、鈧組成，離子半徑與鈣離子的半徑相似，與鈣有較強競爭配位作用，更易結(jié)合電子形成比鈣穩(wěn)定的化合物，可調(diào)控生命體內(nèi)鈣磷代謝以及鋅的含量，常被應(yīng)用于調(diào)控骨代謝。稀土納米顆粒具有較好的促進組織再生能力，可以通過調(diào)控成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞以及間充質(zhì)干細(xì)胞的分化和礦化來實現(xiàn)骨組織再生。

2.1 骨細(xì)胞調(diào)控

2.2 骨礦物相影響

骨質(zhì)疏松是一種代謝性疾病，多發(fā)于老年人和絕經(jīng)期婦女，其特點是骨質(zhì)變脆，骨密度降低。骨質(zhì)疏松癥患者會出現(xiàn)過度生成破骨細(xì)胞和成骨受損的癥狀。本課題組通過多種給藥方式評價了納米氧化釓(Gd2O3)的急性及慢性毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹腔注射Gd2O3顆粒時，低劑量無明顯毒性，高劑量有一定的肝、腎及心肌的損傷。滴鼻時，高劑量引起了海馬損傷，導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的減退，而灌胃無任何毒性反應(yīng)。灌胃時，Gd2O3顆粒引起小鼠骨密度增大，最大載荷增大，骨小梁變粗，骨沉積線明顯，類骨質(zhì)豐富。并能夠促進成骨細(xì)胞增殖和礦化結(jié)節(jié)的形成，促進成骨相關(guān)基因BMP-2，Runx-2和OCN的表達[31-33]。Chu等[34]構(gòu)建卵巢切除的大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞和骨髓源的巨噬細(xì)胞模型，研究了鑭取代層狀氫氧化物納米支架(La-LDH)的成骨和抗破骨細(xì)胞活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)支架中的La3+通過激活Wnt/β-catenin途徑促進大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖和成骨分化，從而導(dǎo)致ALP、Runx-2、COL-1和OCN基因的高表達。此外，La-LDH支架通過抑制NF-κB信號通路抑制破骨細(xì)胞的生成。與不摻雜La3+的支架相比，La-LDH支架提供了更有利誘導(dǎo)新骨生長的微環(huán)境。

3 金納米顆粒在骨代謝中的應(yīng)用

3.1 骨細(xì)胞調(diào)控

金屬納米粒子(AuNPs)因易于控制的納米級尺寸、容易制備、高比表面積、易于功能化、優(yōu)異的生物相容性等特點在骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注[8]。金納米顆粒的尺寸一般在1-100 nm之間，粒徑不同呈現(xiàn)的顏色也不同。它對骨相關(guān)細(xì)胞如成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等具有重要的調(diào)節(jié)作用。本課題組[35]研究表明不同粒徑的金納米顆粒均能促進MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、分化和礦化功能，呈現(xiàn)出了時間和劑量依賴關(guān)系。但20 nm的AuNPs對MC3T3-E1細(xì)胞的增殖分化的影響要高于40 nm的AuNPs。Li等[36]合成了牛血清白蛋白包覆的Au納米球、Au納米星和Au納米棒，尺寸分別為40、70和110 nm，并研究了它們對人間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。發(fā)現(xiàn)AuNPs的大小和形狀會影響人間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，球體-40、球體-70和棒狀體-70顯著提高細(xì)胞堿性磷酸酶活性和鈣沉積，而棒狀體-40降低堿性磷酸酶活性和鈣沉積。AuNPs的大小和形狀是通過調(diào)節(jié)Yes相關(guān)蛋白(YAP)的激活來影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。另一項研究發(fā)現(xiàn)，不同大小Au NPs均促進人脂肪干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，其中30 nm和50 nm的AuNPs表現(xiàn)出最高的成骨分化率[37]。AuNPs除對成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞有一定的影響外，對人牙周膜祖細(xì)胞有一定的影響。Zhang等[38]評估了不同粒徑的AuNP對人牙周膜祖細(xì)胞成骨分化的影響，發(fā)現(xiàn)5 nm AuNPs降低堿性磷酸酶活性、礦化結(jié)節(jié)形成和成骨基因表達，而13 nm和45 nm AuNPs促進這些成骨標(biāo)記物的表達進而促進成骨分化。AuNPs可以抑制核因子受體激活因子-κB配體(RANKL)誘導(dǎo)骨髓來源巨噬細(xì)胞形成破骨細(xì)胞，同時減少RANKL響應(yīng)產(chǎn)生的活性氧，并上調(diào)了RANKL誘導(dǎo)的谷胱甘肽過氧化物酶-1的表達，表明對破骨細(xì)胞形成的抑制作用可能是由于提高了對氧化應(yīng)激的防御[39]。

3.2 骨礦物相影響

本課題組[40]發(fā)現(xiàn)AuNPs可以顯著促進成骨細(xì)胞的增殖，成骨相關(guān)基因BMP-2、Runx-2、OCN和Col-1的表達會隨著ALP活性、骨結(jié)節(jié)和鈣含量的增加而增強，其機制與激活ERK/mapk通路有關(guān)。AuNPs濃度越高，促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的能力越強。隨著ALP活性和細(xì)胞外基質(zhì)礦化的增加，AuNPs促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化而非向脂肪細(xì)胞方向分化。AuNPs促使Runx2、BMP-2、OCN、ALP等成骨分化相關(guān)基因表達上調(diào)，促使PPARγ2、E/CBPα、E/CBPβ、E/CBP成脂分化相關(guān)基因表達下調(diào)，其分子機制與激活p38 MAPK信號通路有關(guān)(圖2)。Bai等[41]建立脂多糖誘導(dǎo)的骨侵蝕小鼠模型研究了AuNPs對骨吸收的治療作用，發(fā)現(xiàn)AuNPs通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞酸分泌來抑制過度的骨吸收，其中血清中I型膠原交聯(lián)羧基端肽下降，抗酒石酸酸性磷酸酶和組織蛋白酶K下降至正常水平，從而顯著減少骨侵蝕，進而達到修復(fù)骨缺損的作用。Zhang等[42]通過在免疫缺陷小鼠皮下植入AuNPs后，發(fā)現(xiàn)有更多的骨結(jié)構(gòu)和膠原形成，表明AuNPs可通過上調(diào)骨相關(guān)蛋白表達和礦化，促進成骨分化。

圖2 金納米顆粒調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的分子機制[40]

4 碳納米管在骨代謝中的應(yīng)用

碳納米管(CNT)的密度遠(yuǎn)低于其他金屬骨支架材料，包括鋼和鈦。然而，碳納米管是地球上最強的材料，將其植入骨中可以改善受損骨組織的力學(xué)性能。碳納米管不僅可以用來刺激骨再生，還可以起到永久性的機械作用。碳納米管還具有優(yōu)異的柔韌性和彈性，碳納米管基材料及其復(fù)合材料在骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具備巨大的應(yīng)用潛力[9]。

4.1 骨細(xì)胞調(diào)控

CNT能夠維持成骨細(xì)胞生長和促進骨形成，并能調(diào)節(jié)細(xì)胞表型。Usui等[43]研究表明鄰近骨的CNT很少引起局部炎癥反應(yīng)，顯示出良好的骨組織相容性，易于整合到新骨中并加速重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2刺激的骨形成。本課題組[44]發(fā)現(xiàn)CNT在體外短期和長期骨結(jié)合過程中抑制了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、成骨分化、成脂分化和礦化，氧化應(yīng)激實驗結(jié)果表明產(chǎn)生的活性氧與觀察到的細(xì)胞毒性無關(guān)，在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程中，成骨和成脂特異性基因表達明顯減弱。Baik等[45]通過氧等離子體對單壁碳納米管進行表面處理后，增強了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附、增殖甚至成骨分化。Tay等[46]報道了單壁碳納米管薄膜對培養(yǎng)2周的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的相互作用、細(xì)胞行為和基因表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單壁碳納米管膜具有高度的生物相容性，為更好的細(xì)胞粘附提供了良好的平臺，其納米粗糙度促進了絲狀偽足的形成。在沒有誘導(dǎo)培養(yǎng)基的情況下，單壁碳納米管通過增加粗糙度可以有效地改善人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附能力和早期分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)成骨分化基因的表達，而促進成骨分化。Sa等[47]研究表明透明質(zhì)酸鈉功能化的單壁碳納米管可以促進I型和III型膠原、骨鈣素和骨形態(tài)發(fā)生蛋白表達升高，進而增加了礦化結(jié)節(jié)的沉積而促進骨礦化。

4.2 骨礦物相影響

本課題組[44]發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化被抑制與Smad依賴的BMP信號通路有關(guān)。Du等[48]表明多壁碳納米管能促進人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，其機制與多壁碳納米管能通過濃縮更多的蛋白質(zhì)(包括特異性骨誘導(dǎo)蛋白)激活Notch相關(guān)的信號通路有關(guān)。Tanaka等[49]將碳納米管植入小鼠顱骨缺損處，碳納米管明顯吸附蛋白質(zhì)并緩慢釋放，種植在碳納米管上的成骨細(xì)胞充滿了伸展的肌動蛋白細(xì)絲和絲狀足孔，碳納米管表現(xiàn)出良好的骨傳導(dǎo)能力、細(xì)胞粘附和增殖能力以及生長因子保留能力。研究利用多壁碳納米管構(gòu)建具有最大機械強度的三維塊體，評估其作為骨修復(fù)支架材料的有效性。將含人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的多壁碳納米管塊植入小鼠背部肌肉后，小鼠肌肉與多壁碳納米管塊直接接觸形成異位骨，骨髓密度與植入含人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的聚對苯二甲酸乙二醇酯增強膠原蛋白片的小鼠骨髓密度相當(dāng)，同時顯示出與皮質(zhì)骨相當(dāng)?shù)淖畲髩嚎s強度[50]。

5 結(jié)語

文章系統(tǒng)總結(jié)了羥基磷灰石、稀土納米材料、金納米顆粒、碳納米管等幾種無機納米材料在骨代謝調(diào)控中的作用及其機制，但目前仍面臨諸多挑戰(zhàn)：(1)相比較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞而言，無機納米材料對破骨細(xì)胞的研究相對較少；(2)對免疫原性的影響和內(nèi)在機制需要進一步研究；(3)與有機材料復(fù)合成結(jié)構(gòu)可控的材料，也可與溫敏性材料復(fù)合聯(lián)合光熱治療骨肉瘤等多種疾病。單一的無機納米材料脆性大，不宜制成各種形狀的支架材料，無機納米材料可以與殼聚糖等有機或高分子材料復(fù)合增強力學(xué)性質(zhì)以及抗菌特性，從而制成理想的骨修復(fù)材料，以解決目前骨組織工程領(lǐng)域靠單一組分材料無法解決的一些難題。