張 山，秦欣欣，于會勇，王成祥

（北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院 呼吸科，北京 100029）

慢性阻塞性肺疾?。–hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以持續(xù)性呼吸道癥狀和氣流受限為特征的常見疾病[1]。COPD 常因感染等因素而誘發(fā)加重，且常合并肺外疾病[2]，使得病情復(fù)雜反復(fù)，因此慢性阻塞性肺疾病全球倡議（GOLD）[1]強調(diào)加強COPD 穩(wěn)定期的管理，減少未來急性加重的風(fēng)險，是COPD 治療的長期目標(biāo)。目前該病的發(fā)病機制尚未完全闡明，其中炎癥-免疫反應(yīng)、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、氧化應(yīng)激損傷等是公認(rèn)的參與COPD 發(fā)病的重要機制[3]。COPD 的藥物療法多以支氣管擴張劑、吸入用糖皮質(zhì)激素、抗菌藥物等對癥治療為主[4]，存在療效不佳、副作用大等弊端[5]，中醫(yī)藥治療COPD則有顯著的優(yōu)勢，因此迫切需要尋求針對COPD 更加有效的治療方藥。

都?xì)馔璩鲎悦鞔鼐懊魉栋Y因脈治》，由六味地黃丸合五味子組成，是治療腎虛喘嗽的名方。近年來，多項臨床研究表明都?xì)馔枘軌蛴行Ц纳艭OPD 患者臨床癥狀及肺功能，減少急性加重發(fā)作次數(shù)，提高患者生活質(zhì)量[6-8]，發(fā)揮“既病防變”的作用，是治療COPD 的有效方劑?；A(chǔ)實驗已證實都?xì)馔杈哂幸种苹驕p輕細(xì)胞抗氧化過程，增強機體的免疫作用[9-10]。然而該復(fù)方治療COPD 的潛在靶點和作用機制鮮見報道，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的系統(tǒng)性、整體性特點，突破傳統(tǒng)分子生物學(xué)單靶點研究模式的束縛，與中醫(yī)整體觀、辨證論治思想更為契合[11]，通過構(gòu)建多成分-多靶點的復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系及分子對接，預(yù)測都?xì)馔柚委烠OPD 的分子作用機制，為實驗研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 都?xì)馔璩煞旨鞍悬c的篩選

依據(jù)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php） 獲 取 都 氣 丸 中 熟地、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、牡丹皮、五味子的所有活性成分，設(shè)定口服生物利用度（Oral bioavailability, OB）≥30%且類藥性（Drug-likeness,DL）≥0.18，初步篩選都?xì)馔璧幕钚曰衔锛捌渥饔冒悬c，并運用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）將藥物靶點轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)化基因名稱。

1.2 都?xì)馔杌钚猿煞?靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運用CytoScape 3.7.1 軟件構(gòu)建都?xì)馔杌钚猿煞?靶點網(wǎng)絡(luò)，進行可視化展示。并利用其內(nèi)置插件CytoNCA 分析活性成分及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，包括點度中心性（Degree centrality, DC）、中介中心性（Betweenness centrality, BC）及接近中心性（Closeness centrality, CC），參數(shù)值越大，說明節(jié)點越接近網(wǎng)絡(luò)的中心[12]，從而判斷都?xì)馔璧闹饕钚猿煞帧?/p>

1.3 COPD 相關(guān)靶點的篩選

利用Pubmed 平臺獲得“慢性阻塞性肺疾病”病名主題詞“Pulmonary Disease, Chronic Obstructive”為關(guān)鍵詞，挖掘GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）、TTD 數(shù) 據(jù) 庫（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、DRUGBANK 數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.ca/）中COPD 的潛在靶點，并根據(jù)數(shù)據(jù)庫靶點的相關(guān)系數(shù)對COPD 相關(guān)靶點進行篩選，將得到的靶點匯總并去除重復(fù)值，得到COPD 相關(guān)疾病靶點。

1.4 都?xì)馔杌钚猿煞?COPD靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運用線上作圖工具Draw Venn Diagram 將都?xì)馔杌钚苑肿影悬c與COPD 疾病靶點做映射取交集，繪制韋恩圖，得到都?xì)馔枧cCOPD 的共同靶點基因。進而將共同靶點基因?qū)隨TRING 11.0 平臺（https://string-db.org/），物種設(shè)定為“Homo sapiens”，參數(shù)采用默認(rèn)設(shè)置，構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)[13]模型，并下載“.tsv”文件，導(dǎo)入CytoScape 3.7.1 軟件進行可視化，同樣利用內(nèi)置插件CytoNCA 分析相關(guān)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，得出核心蛋白靶點。

1.5 GO 及KEGG 富集分析

通過Bioconductor 下載clusterProfiler 程序包，運用R 軟件對都?xì)馔杌钚猿煞旨癈OPD 的共同靶點進行GO（Gene ontology）分析及KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）信號通路富集分析，GO 富集分析包括生物過程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function，MF）和細(xì)胞組成（Cellular component，CC）三個模塊。設(shè)定P＜0.05，并根據(jù)基因靶點數(shù)目，選擇BP/MF/CC 的前10 個條目以及KEGG 的前20 個信號通路，繪制氣泡圖。

1.6 活性成分-靶點分子對接

借助PubChem平臺下載都?xì)馔杌钚猿煞值摹癝DF”格式文件，運用Open Babel GUI 軟件將其轉(zhuǎn)化為“mol2”格式，導(dǎo)入PyRx 軟件進行能量最小化處理，隨后導(dǎo)入Auto Dock Tools 1.5.6 軟件轉(zhuǎn)化為“PDBQT”格式，作為對接配體。將“1.4”篩選出的排名前5 的主要蛋白靶點，從PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）中查找其PDB ID，并下載其三維蛋白結(jié)構(gòu)（PDB 格式），采用PyMol 軟件去水，去除小分子及配體，并導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.6 軟件，加氫，計算電荷，添加原子類型，導(dǎo)出為“PDBQT”格式文件。運行 AutoDock Vina 1.1.2 軟件[14]進行對接，采用PyMol 軟件處理可視化對接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 都?xì)馔杌钚猿煞值陌悬c獲取

結(jié)合TCMSP 數(shù)據(jù)庫，經(jīng)OB 及DL 篩選后獲得都?xì)馔杌钚猿煞?，其中，熟? 種，山藥16 種，山茱萸20 種，茯苓15 種，澤瀉10 種，牡丹皮11 種，五味子8 種。剔除無相關(guān)靶點的成分27 種，合并重復(fù)成分5 種，得到都?xì)馔杌钚猿煞?0 種，見表1。同時篩選獲得489 個藥物靶點，合并后刪除重復(fù)值共得到靶點203 個。

表1 都?xì)馔柚饕钚猿煞諸ab. 1 The main active ingredient of Duqi pill

2.2 都?xì)馔杌钚猿煞?靶點網(wǎng)絡(luò)

將都?xì)馔璧?0 種活性成分以及203 個藥物靶點導(dǎo)入CytoScape 3.7.1 軟件，構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，共獲得260 個節(jié)點，544 條邊，見圖1。其中每個節(jié)點代表化合物分子或作用靶點，節(jié)點與節(jié)點之間的邊代表生物分子間的相互作用，圖中可見節(jié)點越大，相互作用的Degree 值越高，且一個活性分子可作用于多個靶點，多個活性分子可作用于一個靶點，體現(xiàn)了都?xì)馔瓒喑煞?、多靶點協(xié)同作用的特點。利用CytoNCA 插件計算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，結(jié)果表明槲皮素DC 為145，BC 為43 138.527，CC 為0.560 606 06，均為所有活性分子中的最高值，預(yù)測槲皮素為都?xì)馔璧闹饕钚猿煞?。其次為山柰酚（DC 為58，BC為8 994.256，CC 為0.411 111）、β-谷甾醇（DC 為36，BC 為5 805.335，CC 為0.382 006）、豆甾醇（DC為31，BC 為6 336.957，CC 為0.379 765）、海風(fēng)藤酮（DC 為27，BC 為2 998.726，CC 為0.371 06），前10 位核心化合物見表2。

圖1 都?xì)馔杌钚猿煞?靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 1 Active component-target network diagram of Duqi pill

表2 前10 位主要活性分子網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)Tab. 2 Characteristic parameters of the top 10 main active molecular network nodes

2.3 COPD 相關(guān)靶點的獲取

從GeneCards、OMIM、TTD、DRUGBANK 數(shù)據(jù)庫檢索“Pulmonary Disease, Chronic Obstructive”，其中在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中共獲得6 060 個COPD 相關(guān)靶點，Relevance score 值越高則代表該靶點與疾病聯(lián)系越密切，節(jié)選Score ＞30 的靶點為COPD 的潛在靶點478 個。將以上4 個數(shù)據(jù)庫疾病靶點合并后刪除重復(fù)值，最終得到1 053 個COPD 相關(guān)靶點。

2.4 都?xì)馔杌钚猿煞?COPD 靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

對篩選的都?xì)馔?03 個活性成分靶點與COPD的1 053 個疾病靶點取交集，繪制韋恩圖，得到都?xì)馔璩煞?COPD 共同靶點91 個，見圖2。將靶點提交至STRING 11.0 平臺，下載“.tsv”文件，導(dǎo)入CytoScape 3.7.1 軟件，得到都?xì)馔杌钚猿煞?COPD靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖3。同樣利用CytoNCA 插件計算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，結(jié)果表明IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、MMP9 等拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)值DC、BC、CC 最高，可作為都?xì)馔柚委烠OPD 的潛在靶點，節(jié)選網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)排名前10 位的靶點，見表3。

圖2 藥物與疾病靶點韋恩圖Fig. 2 Venn diagram of drug and disease targets

圖3 活性成分-疾病靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 3 Active ingredient - disease target PPI network diagram

表3 前10 位主要蛋白靶點網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)Tab. 3 Characteristic parameters of the top 10 protein target network nodes

2.5 GO 及KEGG 富集分析

使用 R 軟件對活性分子與疾病的91 個共同靶點進行GO 及KEGG 富集分析，氣泡顏色由紅到藍表示P值由小到大，P值越小顯著性越強，氣泡越大代表該通路的基因計數(shù)count 值越大，橫軸代表該功能富集基因占總體輸入基因的比率。

GO 富集結(jié)果共富集2 332 條 GO 功能條目（P＜0.05），其中富集最顯著的 BP、CC、MF 前 10 名結(jié)果見圖4。提示都?xì)馔杌钚猿煞挚赡芡ㄟ^以上生物學(xué)反應(yīng)在治療COPD 過程中發(fā)揮作用。

圖4 GO 分析氣泡圖Fig. 4 GO analyzes bubble graphs

KEGG 富集結(jié)果顯示共富集到151 條信號通路，其中排名前20 的富集通路見圖5。靶點通路富集結(jié)果（前20 位），見表4。

圖5 KEGG 分析氣泡圖Fig. 5 KEGG analyzes bubble graphs

表4 都?xì)馔柚委烠OPD 靶點通路富集結(jié)果（前20 位）Tab. 4 Enrichment results of Duqi pill in treatment of COPD target pathway（top 20）

2.6 分子對接驗證

將“2.2”中得到的都?xì)馔璧那? 個關(guān)鍵活性成分與“2.4”中得到的前5 位核心蛋白靶點進行分子對接，受體蛋白（IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、MMP9）相對應(yīng)的PDB ID 分別為1ALU、1UNQ、5UUI、3QTK、6ESM。配體與受體結(jié)合時能量越低，構(gòu)象越穩(wěn)定，兩者發(fā)生作用的可能性越大。結(jié)合能小于0 說明配體與受體可自發(fā)結(jié)合，本研究選取結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)[15]。分子對接結(jié)果見表5，可以看出都?xì)馔桕P(guān)鍵活性成分與核心蛋白靶點之間均具有較好的結(jié)合活性，其中，槲皮素、山柰酚與5 個核心靶點的結(jié)合能均明顯低于β-谷甾醇、豆甾醇、海風(fēng)藤酮，表明槲皮素、山柰酚與受體蛋白形成構(gòu)象能量更低。選取槲皮素與山柰酚部分活性成分對接模式見圖6，均有氫鍵作用，說明關(guān)鍵分子與靶點蛋白作用結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，結(jié)合活性較高。

圖6 都?xì)馔桕P(guān)鍵活性化合物與核心蛋白靶點分子對接模式Fig. 6 Docking mode between key active compounds and core protein target molecules of Duqi pill

表5 關(guān)鍵活性成分與核心蛋白靶點分子對接的結(jié)合能Tab. 5 Binding energy of key active ingredients and core protein target molecules

3 討論

本研究首先采用TCMSP 平臺篩選，共獲得都?xì)馔杌钚猿煞?0 種，進一步通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析得出都?xì)馔柚委烠OPD 的關(guān)鍵活性分子為槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、海風(fēng)藤酮等。其中，槲皮素、山柰酚為植物黃酮類化合物，β-谷甾醇、豆甾醇為植物甾醇類化合物，均具有明確的抗氧化、抗炎、抗腫瘤等藥理特性[16-19]。COPD 相關(guān)基礎(chǔ)研究表明，槲皮素可通過降低經(jīng)彈性蛋白酶/脂多糖處理的COPD 小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，抑制促炎細(xì)胞因子表達以及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9、MMP12 的表達，改善肺彈性、減輕肺部炎癥以及杯狀細(xì)胞上皮化生，從而阻止肺氣腫的進展[20]，同樣可以減弱鼻病毒誘導(dǎo)的COPD 表型小鼠的肺部疾病進展[21]，并且具有松弛支氣管平滑肌的作用[22]，有望成為治療COPD的新型治療藥物[23]。山柰酚可通過調(diào)節(jié)促炎相關(guān)通路NF-κB 的激活[24]，以及LPS 刺激的J774.2 巨噬細(xì)胞中IL-1 和TNF -α 合成[25]，發(fā)揮重要的抗炎作用。分子對接驗證結(jié)果亦證實槲皮素和山柰酚兩者與COPD 核心蛋白靶點作用結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，具有較高的結(jié)合活性。β-谷甾醇、谷甾醇的抗炎機制可通過降低NO的合成, 抑制巨噬細(xì)胞分泌炎性因子來實現(xiàn)[26-27]，且β-谷甾醇具有較強的抑菌活性，能夠抑制枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等細(xì)菌的生長[28]。海風(fēng)藤酮亦具有抗氧化活性[29]，然而尚無與COPD 相關(guān)的報道，這就為COPD 相關(guān)治療藥物的研究提供一定借鑒。

PPI 網(wǎng)絡(luò)圖顯示，都?xì)馔柚委烠OPD 的潛在靶點有多個，靶點之間也具有復(fù)雜的相互作用關(guān)系，體現(xiàn)了中藥復(fù)方治療COPD 多靶點、多突破點、多成分的特征。進一步根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)結(jié)果，證明IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、MMP9 是主要靶標(biāo)。IL-6 主要是由單核巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞產(chǎn)生的全身性促炎細(xì)胞因子，參與COPD 急性加重過程，是反映COPD 嚴(yán)重程度與預(yù)后的重要生物標(biāo)記物[30]；同時IL-6 在穩(wěn)定期患者中也高表達[31]，長期IL-6 參與的炎癥刺激導(dǎo)致氣道阻塞、氣道及血管重塑，進一步繼發(fā)肺氣腫和肺動脈高壓的形成[32]。AKT1 是一類進化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶最具特征的家族成員之一，與細(xì)胞存活、凋亡、炎癥等過程密切相關(guān)，其上游負(fù)性調(diào)節(jié)基因PTEN 的突變可導(dǎo)致AKT的持續(xù)激活，使得COPD 患者即使戒煙后仍存在持續(xù)性炎癥狀態(tài)[33]，同時AKT 也參與COPD 患者的骨骼肌萎縮機制，加速骨骼肌肌纖維蛋白的消耗[34]。TNF 尤其TNF-α 是在COPD 疾病中研究最多的細(xì)胞因子之一，TNF-α 是較為公認(rèn)的COPD 易感基因[35]，可激活巨噬細(xì)胞，增加細(xì)胞毒性，同時也能刺激IL-6 分泌，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞的積累，進一步引起氧化應(yīng)激、組織重構(gòu)等，促進COPD 的發(fā)生發(fā)展[36]。MMP-9 是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族中分子量最大的多功能酶，由中性粒細(xì)胞合成，是評估COPD的重要標(biāo)志物[37]。MMP-9 可破壞肺實質(zhì)中細(xì)胞外基質(zhì)成分，亦可激活和釋放生長因子如血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA），誘導(dǎo)肺部血管新生與血管重塑[38]，是COPD 并發(fā)肺癌的重要機制之一[39]。 以上5 個潛在靶點與COPD 的發(fā)病機制密切相關(guān)，并且與GO分析生物學(xué)功能富集程度較高的對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、活性氧代謝過程、抗氧化反應(yīng)、細(xì)胞因子的活性等存在一致性，因此可作為都?xì)馔柚委烠OPD 的核心靶點，指導(dǎo)下一步的實驗驗證。

結(jié)合KEGG 通路富集及文獻分析，富集程度最高的通路中，涉及病毒在內(nèi)的病原體感染以及炎癥相關(guān)的通路最多，與COPD 急性加重機制或炎癥發(fā)病機制類似。其中，腫瘤壞死因子TNF、細(xì)胞因子IL-17 信號通路均可介導(dǎo)NF-κB、MAPKs 信號通路發(fā)揮抗炎作用[40-41]；COPD 缺氧狀態(tài)下，引發(fā)肺組織細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號通路的激活，進而增加VEGF 的表達，在COPD 血管生成和氣道重構(gòu)中發(fā)揮重要作用[42]。

4 結(jié)論

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，都?xì)馔柚委烠OPD 的活性分子主要為槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇等，并與核心靶點IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、MMP9 有較好的對接活性，作用于多條感染及炎癥相關(guān)通路，體現(xiàn)了都?xì)馔柚委烠OPD 的多成分、多靶點、多通路聯(lián)合作用的特點，這將為后續(xù)進一步開展相關(guān)基礎(chǔ)實驗研究提供理論依據(jù)。