何 暢，蔣孝峰，張夢(mèng)晨，陸兔林，刁和芳，謝 輝*，趙開(kāi)軍

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2. 江蘇省中醫(yī)院 制劑部，江蘇 南京 210029；3. 江蘇弘典中藥產(chǎn)業(yè)研究院有限公司 研發(fā)部，江蘇 南京 210042；4. 南京中山制藥有限公司 技術(shù)中心，江蘇 南京 210046；5. 江蘇省中藥經(jīng)典名方工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210042）

半夏瀉心湯（Banxia Xiexin Decoction, BXD）源于東漢張仲景《傷寒雜病論》之《傷寒論》[1]，被收錄入《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》[2]，是臨床應(yīng)用廣泛的經(jīng)典湯劑。原方記載：“但滿而不痛者，此為痞，柴胡不中用之，宜半夏瀉心湯。半夏（洗）半升；黃芩、干姜、人參、甘草（炙）各三兩；黃連一兩；大棗（擘）十二枚；上七味，以水一斗，煮取六升，去滓，再煮取三升，溫服一升，日三服?！本园胂纳⒔Y(jié)除痞；臣以干姜溫中散寒，黃連、黃芩苦寒泄熱；佐以人參、大棗補(bǔ)虛益氣；使以甘草健脾和中，則痞硬自散，諸癥自解?，F(xiàn)代研究表明，半夏瀉心湯具有消炎、抑菌、雙向調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力、保護(hù)和修復(fù)胃腸黏膜等作用[3-5]。臨床中本方廣泛用于急慢性胃炎、消化性潰瘍、消化不良等消化系統(tǒng)疾病的治療[6-8]。

湯劑是臨床應(yīng)用最早、最廣泛的劑型之一，具備中醫(yī)辨證施治的特點(diǎn)，其質(zhì)量受到飲片、復(fù)方配伍、制備工藝條件等因素影響。隨著基于經(jīng)典名方的復(fù)方制劑研究開(kāi)發(fā)的深入開(kāi)展，湯劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)越發(fā)受到重視。目前關(guān)于半夏瀉心湯的研究多見(jiàn)于其臨床應(yīng)用及藥理作用[9-10]等方面，故開(kāi)展半夏瀉心湯的質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要的實(shí)踐意義。

半夏瀉心湯中主要含有黃酮類、生物堿類、皂苷類、糖苷類化合物[11]，本研究在前期化學(xué)研究的基礎(chǔ)上，以多批次飲片為原料制備15 批半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品，建立半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜，采用相似度評(píng)價(jià)、主成分分析、正交偏最小二乘判別分析研究15批基準(zhǔn)樣品批次間的相關(guān)性及差異。同時(shí)以小檗堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、黃芩苷、甘草酸、6-姜辣素為指標(biāo)成分，建立指標(biāo)成分含量測(cè)定方法，通過(guò)對(duì)指標(biāo)成分含量及轉(zhuǎn)移率的考察來(lái)表征基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量，以期為半夏瀉心湯復(fù)方制劑的后續(xù)開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

TD10002C 型電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司）；CAV64C 型電子分析天平（上海奧豪斯有限公司）；FA1104N 型電子分析天平 （上海精若實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；AE-1106A 型微電腦電陶爐（中山市愛(ài)米生活有限公司）；KQ-500B 型超聲清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-16C 型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Waters 2695 型高效液相色譜儀（全自動(dòng)進(jìn)樣器，2998 型DAD 檢測(cè)器；Empower 液相色譜工作站，美國(guó)Waters 公司）。

1.2 藥品與試劑

半夏、黃芩、干姜、人參、甘草、黃連、大棗飲片具體信息見(jiàn)表1，以上飲片均由南京中山制藥有限公司提供，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定符合2020 年版《中國(guó)藥典》規(guī)定。鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：201814，純度為86.7%）、黃連堿對(duì)照品（批號(hào)：201601，純度為95.1%）、巴馬汀對(duì)照品（批號(hào)：201506，純度為86.8%）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：201514，純度為98%）、甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)：20120911，純度為93%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。6-姜辣素對(duì)照品（批號(hào)：B21838Z，純度為98%）、表小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：B20108，純度為98%）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。乙腈（德國(guó)默克公司）、甲醇（美國(guó)TEDIA 公司）、磷酸（批號(hào)：H2020219，阿拉丁公司），以上試劑均為色譜純。

表1 半夏瀉心湯藥材、飲片信息Tab. 1 Medicinal materials and pieces information of Banxia Xiexin decoction

2 方法與結(jié)果

2.1 半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品的制備

據(jù)《傷寒論》記載，半夏瀉心湯的處方組成為“半夏半升（洗），黃連一兩，黃芩、干姜、人參、甘草（炙）各三兩，大棗十二枚（擘）”。以一兩折合3 g 進(jìn)行換算，本實(shí)驗(yàn)中半夏瀉心湯處方劑量為：半夏7.5 g、黃芩9 g、干姜9 g、人參9 g、甘草9 g、黃連3 g、大棗12 g。

根據(jù)前期煎煮工藝研究結(jié)果，按處方量稱取半夏瀉心湯7 味飲片共58.5 g，加2 000 mL 水浸泡30 min，以2 000 W 武火加蓋煮沸后，在1 000 W 火力下保持微沸并煮至1 200 mL，趁熱80 目篩過(guò)濾，濾液不加蓋繼續(xù)加熱并保持微沸狀態(tài)直至600 mL，放冷，即得半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品。

以15 批飲片為原料，用Excel 中RANDBETWEEN公式隨機(jī)組合，得到15 批半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品的飲片組合，共制備15 批半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品，編號(hào)分別為S1—S15。各批基準(zhǔn)樣品的飲片組合信息見(jiàn)表2。

表2 半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品的飲片批號(hào)組合信息Tab. 2 Combination pieces information of Banxia Xiexin decoction

2.2 半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品的指紋圖譜

2.2.1 色譜條件 以Waters XTerra C18柱 （4.6 mm ×250 mm，5 μm）為色譜柱，流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～ 6 min，19%→19% A；6 ～ 40 min，19%→26% A；40 ～ 45 min，26%→35% A；45 ～ 58 min，35%→71% A；58 ～ 60 min，71%→19%A）；流速為0.8 mL/min，柱溫為25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm，進(jìn)樣體積為10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、黃芩苷、甘草酸銨、6-姜辣素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為10.65 μg/mL 、2.89 μg/mL、4.02 μg/mL、4.17 μg/mL、150 μg/mL、21.2 μg/mL、4.088 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2.3 基準(zhǔn)樣品供試液 精密量取半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品5 mL，置10 mL 容量瓶中，加水定容至刻度后，過(guò)濾，取續(xù)濾液，以12 000 r/min 離心10 min，取上清液，即得。

2.2.4 單味飲片供試液的制備 按處方量分別稱取單味飲片，按“2.1”項(xiàng)下基準(zhǔn)樣品制備方法制備單味飲片煎液，按“2.2.3”項(xiàng)下的方法制得單味飲片供試液。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取基準(zhǔn)樣品（S11），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備1 份基準(zhǔn)樣品供試液，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以黃芩苷為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其RSD 分別小于0.54%和2.02%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取基準(zhǔn)樣品（S11），按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份基準(zhǔn)樣品供試液，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，以黃芩苷為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其RSD 分別小于0.66%和1.77%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.5”項(xiàng)下的基準(zhǔn)樣品供試液，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別在0、2、4、8、12、18、24 h 進(jìn)樣，以黃芩苷為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其RSD 分別小于0.53%和2.74%，表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的測(cè)定 按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備15 批半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品供試液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，將15 批半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品供試液的色譜圖以.cdf 格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A 版）”軟件，采用平均數(shù)法，進(jìn)行全譜峰的匹配，生成半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品的指紋圖譜，并計(jì)算15 批半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品的相似度，結(jié)果S1—S15 相似度分別為0.991、0.989、0.989、0.997、0.993、0.995、0.997、0.994、0.996、0.996、0.995、0.998、0.996、0.996、0.994，均大于0.989，相似度良好。

通過(guò)對(duì)15 批樣品的比較分析，共標(biāo)記出28 個(gè)共有峰，得到15 批基準(zhǔn)樣品指紋圖譜疊加圖，見(jiàn)圖1。經(jīng)與化學(xué)對(duì)照品的色譜行為進(jìn)行比較，可鑒定出中7個(gè)色譜峰，分別是13 號(hào)峰表小檗堿、14 號(hào)峰黃連堿、15 號(hào)峰巴馬汀、16 號(hào)峰小檗堿、17 號(hào)峰黃芩苷、25號(hào)峰甘草酸、27 號(hào)峰6-姜辣素。本研究建立的指紋圖譜中，17 號(hào)峰黃芩苷峰面積最大，保留時(shí)間適中、峰形良好，故選其作為半夏瀉心湯指紋圖譜中的參照峰。混合對(duì)照品溶液及半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品供試液的指紋圖譜見(jiàn)圖2。將半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品生成的對(duì)照?qǐng)D譜與各單味藥飲片的對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 15 批半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜疊加圖（S1—S15）Fig. 1 Fingerprint map overlay of 15 batches of the reference samples of Banxia Xiexin decoction（S1—S15）

圖2 混合對(duì)照品溶液（A）和半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品供試液（B）指紋圖譜Fig. 2 Fingerprint spectrum of reference substances (A) and Banxia Xiexin decoction (B)

圖3 各藥味飲片對(duì)照?qǐng)D譜與基準(zhǔn)樣品對(duì)照?qǐng)D譜對(duì)比Fig. 3 Comparison of the reference map of each decoction piece with the reference samples

28 個(gè)共有峰中，5 個(gè)色譜峰（17、21、22、27、28 號(hào)峰）歸屬來(lái)源于黃芩；9 個(gè)色譜峰（1、3、9、11、12、13、14、15、16 號(hào)峰）歸屬來(lái)源于黃連；1個(gè)色譜峰（27 號(hào)峰）歸屬來(lái)源于干姜；11 個(gè)色譜峰（1、4、5、8、9、10、18、23、24、25、26 號(hào)峰）歸屬來(lái)源于甘草。表明半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品的主要物質(zhì)群均可清晰地追溯到飲片中。

2.2.9 主成分分析 以15 批半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的28 個(gè)共有峰峰面積為變量，導(dǎo)入SIMCA-P 14.1 軟件進(jìn)行主成分分析。以特征值＞1 為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到5 個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為87.599%，能夠代表樣品的大部分信息，結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)圖4 可以發(fā)現(xiàn)，15 批樣品被分成了2 類，S1—S3、S10、S11、S13—S15 分 為 一 類，S4—S9、S12分為一類，表明不同批次的飲片制備的湯液間存在一定的質(zhì)量差異。

圖4 15 批半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品主成分分析得分圖Fig. 4 PCA scoring of 15 batches of the reference samples of Banxia Xiexin decoction

表3 半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品主成分分析方差總解釋Tab. 3 Principal component analysis variance total interpretation of the reference samples of Banxia Xiexin decoction

2.2.10 正交偏最小二乘判別分析 在主成分分析的基礎(chǔ)上，將15 批半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的28 個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA-P 14.1 軟件，進(jìn)行有監(jiān)督模式的偏最小二乘判別分析，結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。模型主成分回歸系數(shù)：R2X= 0.818，R2Y= 0.984，Q2=0.811，說(shuō)明模型有較好的預(yù)測(cè)能力。由圖5 可知，15 批樣品被分為2 類，與PCA 結(jié)果相同。變量投影重要性（VIP）值見(jiàn)圖6，VIP 值越大，即變量離X軸越遠(yuǎn)，表明該色譜峰對(duì)分離的貢獻(xiàn)越大。以VIP值＞1 為判定標(biāo)準(zhǔn)，篩選出15 個(gè)對(duì)組分分離貢獻(xiàn)度較高的色譜峰，依次為23 號(hào)、10 號(hào)、9 號(hào)、25 號(hào)（甘草酸）、7 號(hào)、26 號(hào)、5 號(hào)、24 號(hào)、6 號(hào)、1 號(hào)、4 號(hào)、18 號(hào)、16 號(hào)（小檗堿）、14 號(hào)（黃連堿）、15 號(hào)（巴馬?。?，表明這15 個(gè)成分可能是將基準(zhǔn)樣品分為2 類的差異性質(zhì)量標(biāo)志物。

圖5 15 批半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品OPLS-DA 得分圖Fig. 5 OPLS-DA scoring of 15 batches of the reference samples of Banxia Xiexin decoction

圖6 15 批半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品OPLS-DA VIP 值圖Fig. 6 VIP values of OPLS-DA of 15 batches of the reference samples of Banxia Xiexin decoction

2.3 指標(biāo)成分含量測(cè)定方法的建立

2.3.1 色譜條件 以Waters XTerra C18柱 （4.6 mm ×250 mm，5 μm）為色譜柱，流動(dòng)相為0.1%磷酸甲醇（A）-0.1% 磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～5 min，10%→30%A；5 ～ 20 min，30%→35%A；20 ～30 min，35%→45%A；30 ～ 60 min，45%→70%A；60 ～ 75 min，70%→90%A；75 ～ 78 min，90%→90%A；78 ～ 80 min，90%→10%A）；流速為1.0 mL/min，柱溫為35℃，小檗堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、黃芩苷、甘草酸檢測(cè)波長(zhǎng)為255 nm，6-姜辣素檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。含量測(cè)定色譜圖見(jiàn)圖7。

圖7 半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品含量測(cè)定色譜圖Fig. 7 Chromatogram of content determination of Banxia Xiexin decoction

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 制備方法同“2.2.2”項(xiàng)下。

2.3.3 基準(zhǔn)樣品供試液的制備 精密量取半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品5 mL，置10 mL 容量瓶中，加水定容至刻度后，從中精密量取2 mL，置25 mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇7 mL、水1 mL，使甲醇濃度為70%，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足失重，混勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，即得。

2.3.4 陰性供試液的制備 按處方量分別稱取除黃連、黃芩、甘草、干姜外的其余飲片，按“2.1”項(xiàng)下的方法制備，即得陰性煎液。按“2.3.3”項(xiàng)下的方法制備，即得陰性供試液。

2.3.5 專屬性試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液、“2.3.4”項(xiàng)下的陰性供試液及“2.3.3”項(xiàng)下的基準(zhǔn)樣品供試液，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，每次10 μL，記錄各次測(cè)定的色譜圖，見(jiàn)圖8、9。結(jié)果表明，在此色譜條件下，方中黃連、黃芩、甘草、干姜中的指標(biāo)成分與其它成分分離度良好，陰性供試液色譜圖表明其它峰對(duì)指標(biāo)成分無(wú)干擾，各指標(biāo)成分色譜峰的專屬性良好。

圖8 黃連特征成分、黃芩苷、甘草酸專屬性圖Fig. 8 Specialty diagram of characteristic components of Coptis chinensis, baicalin, glycyrrhizic acid

圖9 6-姜辣素專屬性圖Fig. 9 Specialty diagram of 6-gingerol

2.3.6 線性關(guān)系考察 取“2.3.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣2、5、10、12、15 μL，每份平行測(cè)定2 次，以測(cè)定結(jié)果的平均峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，小檗堿為0.021 3 ～0.159 8 μg，表小檗堿為0.005 8 ～0.043 4 μg，黃連堿為0.008 0 ～0.060 3 μg，巴馬汀為0.008 3 ～0.062 6 μg，黃 芩 苷 為0.300 ～2.250 μg，甘 草 酸 為0.042 4 ～0.318 0 μg，6-姜辣素為0.008 2 ～0.061 3 μg，線性關(guān)系良好。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次10 μL，計(jì)算各指標(biāo)成分的峰面積的RSD，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取基準(zhǔn)樣品（S10），按“2.3.3”項(xiàng)下的供試液處理方法平行處理6 份樣品，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每次10 μL，計(jì)算各指標(biāo)成分峰面積的RSD，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取基準(zhǔn)樣品（S10），按“2.3.3”項(xiàng)下的供試液處理方法處理，分別在0、3、6、12、18、24 h 時(shí)按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每次10 μL，計(jì)算各指標(biāo)成分的峰面積的RSD，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.10 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取“2.3.8”項(xiàng)下已知含量的基準(zhǔn)樣品，精密量取9 份，每份2 mL，置于5 mL容量瓶中，按照1 ∶0.8、1 ∶1、1 ∶1.2 的比例加入混合對(duì)照品，每個(gè)比例平行3 份，按“2.3.3”項(xiàng)下的供試液處理方法處理，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每次10 μL，計(jì)算各指標(biāo)成分的加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，各指標(biāo)成分的平均加樣回收率為100.16%～103.61%，均符合規(guī)定，表明該方法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度良好。

表4 半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品中指標(biāo)成分含量測(cè)定方法學(xué)考察Tab. 4 Methodological study on multi-components determination of indicator components in the reference samples of Banxia Xiexin decoction

2.4 半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品中指標(biāo)成分含量測(cè)定

按照“2.3.3”項(xiàng)下方法制備15 批半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品供試液，以隨行對(duì)照品溶液作為對(duì)照，采用“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算15 批基準(zhǔn)樣品中7 個(gè)指標(biāo)成分占對(duì)應(yīng)飲片質(zhì)量的百分比含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

計(jì)算飲片-基準(zhǔn)樣品中各指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率，計(jì)算公式如下：

由表5 可知，半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品中小檗堿含量為1.96% ～ 4.12%，表小檗堿、黃連堿、巴馬汀為1.06% ～ 2.40%，黃芩苷為8.48% ～ 10.12%，甘草酸為1.23% ～ 2.05%， 6-姜辣素為0.18% ～ 0.24%。

表5 半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品中指標(biāo)成分的含量與轉(zhuǎn)移率Tab. 5 Transfer rate of indicator components in reference samples of Banxia Xiexin decoction

參照《按古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復(fù)方制劑藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》的規(guī)定[12]，基準(zhǔn)樣品湯劑中指標(biāo)成分的含量波動(dòng)范圍一般不超過(guò)均值±30%。15 批半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品中，指標(biāo)成分小檗堿在S1、S2、S3 批次中含量大于均值的130%；表小檗堿、黃連堿、巴馬汀的含量之和在S1、S2、S14批次中出現(xiàn)離散值，在S14 批次中轉(zhuǎn)移率略低于均值的70%；甘草酸在S1 批次中含量及轉(zhuǎn)移率均大于均值的130%。其余批次成分的含量及轉(zhuǎn)移率均在其均值的70% ～ 130%范圍之內(nèi)，結(jié)果表明多批次飲片制備的半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品質(zhì)量較為穩(wěn)定。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法考察

在指標(biāo)成分含量測(cè)定中，考察了超聲提取的提取溶劑（30%、50%、70%、80%甲醇）及提取時(shí)間（20、30、40 min），從操作便捷性及指標(biāo)成分含量等方面考慮，最終確定供試品溶液制備方法為70%甲醇超聲提取30 min。

3.2 色譜條件考察

在半夏瀉心湯指紋圖譜建立過(guò)程中，考察了不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）及不同柱溫（25、30、35℃），結(jié)果表明流速為0.8 mL/min、柱溫為25℃時(shí)色譜峰分離程度較好。

在半夏瀉心湯指標(biāo)成分的含量測(cè)定研究中，通過(guò)單因素考察的方式對(duì)色譜柱、柱溫、流動(dòng)相、流速進(jìn)行了選擇。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，色譜柱、流動(dòng)相、流速都會(huì)不同程度地影響色譜峰的保留時(shí)間及峰形，但對(duì)分離度的影響比較??；柱溫對(duì)小檗堿與雜峰的分離有影響。

3.3 測(cè)定結(jié)果分析

本研究前期搜集了本方中半夏、黃芩、干姜、人參、黃連、甘草、大棗7 味來(lái)自3 個(gè)不同產(chǎn)地的數(shù)批次藥材，并進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，最終選定優(yōu)質(zhì)藥材產(chǎn)地。

在指紋圖譜研究中，15 批半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜相似度良好（大于0.989）。對(duì)半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的色譜峰歸屬進(jìn)行分析，黃連和甘草對(duì)指紋圖譜的貢獻(xiàn)度最大，其次為黃芩、干姜。有9個(gè)特征峰來(lái)自黃連、5 個(gè)特征峰來(lái)自黃芩、1 個(gè)特征峰來(lái)自干姜、11 個(gè)特征峰來(lái)自甘草。PCA 和OPLSDA 將15 批基準(zhǔn)樣品分為2 類，結(jié)合含量測(cè)定結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，S4—S9、S12 這一類飲片及基準(zhǔn)樣品中黃連的指標(biāo)成分含量大部分低于平均值，甘草酸含量及轉(zhuǎn)移率較低。篩選出導(dǎo)致批次間質(zhì)量差異的15 個(gè)成分，其主要來(lái)源于黃連、甘草2 味飲片，表明黃連、甘草飲片的質(zhì)量?jī)?yōu)劣可能是導(dǎo)致基準(zhǔn)樣品出現(xiàn)差異的主要原因之一。

在不同批次半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品中，指標(biāo)成分含量的差異可能是由于飲片質(zhì)量差異導(dǎo)致，也可能與煎煮過(guò)程湯液復(fù)雜體系中各成分溶出度相互影響有關(guān)。少數(shù)批次的基準(zhǔn)樣品中小檗堿等主要生物堿成分的含量和轉(zhuǎn)移率出現(xiàn)離散情況，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分離散值與黃連飲片本身含量差異較大有關(guān)，飲片含量過(guò)高過(guò)低均會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)離散值。1 批基準(zhǔn)樣品中甘草酸的含量及轉(zhuǎn)移率出現(xiàn)離散情況，研究表明[13]，甘草酸的含量受產(chǎn)地、采收年份、取樣部位等因素影響，在甘草不同組織部位也存在顯著性差異。6-姜辣素轉(zhuǎn)移率較低，主要原因可能與其對(duì)熱不穩(wěn)定、極性較弱且含量較低有關(guān)[14]。從整體上看，轉(zhuǎn)移率高低除了與成分自身溶解度有關(guān)外，還受湯劑煎煮過(guò)程中多成分間復(fù)雜的相互作用影響[15-16]。人參為貴重藥材，人參皂苷類成分提取方法較為復(fù)雜，皂苷類成分的檢測(cè)波長(zhǎng)與其余藥味相差較大，故后續(xù)會(huì)為其單獨(dú)建立含量測(cè)定方法。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)指紋圖譜及多指標(biāo)成分含量測(cè)定，建立了半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品質(zhì)量表征方法，運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)多批基準(zhǔn)樣品質(zhì)量表征結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在飲片制備成半夏瀉心湯基準(zhǔn)樣品的過(guò)程中，主要物質(zhì)群能較為完整地傳遞，為半夏瀉心湯復(fù)方制劑的開(kāi)發(fā)提供了依據(jù)。