郗 歐,劉禹岐,馬 進(jìn),焦富英,阮 林
(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 腦病一科,遼寧 沈陽 110034;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)二科,遼寧 沈陽 110034)
血管內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋于血管表面,是血液和血管組織之間的天然屏障。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障的重要組成部分,其損傷是腦血管疾病發(fā)生的最直接原因[1]。因此,保護(hù)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷對腦血管疾病的治療尤為重要。木通皂苷D 是中藥續(xù)斷的主要活性成分之一,具有多種藥理作用。研究顯示,木通皂苷D 可減輕H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,提高內(nèi)皮細(xì)胞纖溶功能并抑制血小板的聚集,具有治療心腦血管疾病的潛在價(jià)值[2];木通皂苷D 通過提高肝組織中GSH 和SOD 活性及降低MDA 含量減輕CCl4引起的小鼠急性肝損傷[3]。circ_TTC3 是一種環(huán)狀RNA(circRNA),參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等生理或病理過程,其異常表達(dá)可影響多種疾病的發(fā)展進(jìn)程。研究顯示,circ_TTC3在大腦中動脈閉塞/再灌注(MCAO/R)小鼠模型及葡萄糖剝奪(OGD)誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)升高,敲減circ_TTC3 可降低MCAO/R 小鼠腦梗死面積及腦組織含水量,同時(shí)減少OGD 誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制與靶向調(diào)控miR-372-3p/Toll 樣受體4(TLR4)軸有關(guān),circ_TTC3 有可能成為中風(fēng)引起的腦缺血再灌注損傷治療的分子靶點(diǎn)[4]。本研究建立脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)損傷模型,觀察木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激的影響及其能否通過調(diào)控circ_TTC3 發(fā)揮作用,以期為其用于腦血管疾病的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(上海中喬新舟生物科技有限公司);木通皂苷D(純度≥98%,上海純優(yōu)生物科技有限公司);LPS(美國Sigma 公司);CCK-8 試劑盒、Annexin V-FITC/PI 試劑盒和DMEM 培養(yǎng)液(北京索萊寶科技有限公司);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司);LipofectamineTM2000 試劑盒(美國Invitrogen 公司);引物序列、circ_TTC3siRNA (si-circ_TTC)和過表達(dá)載體(pcDNA-circ_TTC3)、siRNA陰性序列(si-NC)和空載體(pcDNA)(上海生工生物工程股份有限公司);SOD 和MDA 試劑盒(南京建成生物工程研究所)。371 型CO2培養(yǎng)箱(美國ThermoForma 公司);Fax-2100 型酶標(biāo)儀(美國Awareness 公司);FACSCalibur 分析型流式細(xì)胞儀(美國BD 公司);T100 型PCR 儀(美國Bio-Rad 公司)。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組處理 復(fù)蘇HBMEC,加含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液(基礎(chǔ)培養(yǎng)液)置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將HBMEC 分為對照組、LPS 組、LPS+木通皂苷D 低、中、高劑量組。對照組細(xì)胞用DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,LPS 組細(xì)胞用含1.0 mg/L[5]LPS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,LPS+木通皂苷D低、中、高劑量組細(xì)胞分別用含12.5、25、50 μmol/L[2]木通皂苷D 和1.0 mg/L LPS 的DMEM 培養(yǎng)液共同培養(yǎng)24 h。
1.2.2 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖抑制率 將對數(shù)期HBMEC(2.5 × 104個(gè)/mL)接種至96 孔板中,每孔0.2 mL,培養(yǎng)4 h 后,棄培養(yǎng)液,分組處理。處理后,每孔加10 μL CCK-8。孵育2 h,用酶標(biāo)儀(450 nm)測吸光度(A)值。增殖抑制率(%) = (A對照組-A實(shí)驗(yàn)組)/A對照組×100%。
1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將對數(shù)期HBMEC(2.5 × 104個(gè)/mL)接種至6 孔板中,每孔2.5 mL。培養(yǎng)4 h 后,棄培養(yǎng)液,分組處理。處理后,收集各組細(xì)胞,用PBS 清洗2 次,并調(diào)整密度為1.0 ×106個(gè)/mL。取1.0 mL 細(xì) 胞 懸 液,1 000 r/min 離 心5 min 后,棄上清,加500 μL 結(jié)合緩沖液,重懸細(xì)胞。加10 μL Annexin V-FITC,避 光 孵 育10 min。再 加5 μL PI,避光孵育5 min后,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。
1.2.4 比色法檢測細(xì)胞中SOD 活性和MDA 含量細(xì)胞接種和分組處理同“1.2.3”。處理后,收集各組細(xì)胞,PBS 清洗2 次,加細(xì)胞裂解液裂解20 min。將裂解液3 500 r/min 離心10 min,取上清液,分別利用SOD 和MDA 試劑盒,采用比色法檢測SOD 活性及MDA 含量。
1.2.5 qRT-PCR 檢測circ_TTC3 表達(dá) 細(xì)胞接種和分組處理同“1.2.3”。處理后,收集各組細(xì)胞,PBS清洗2 次。用RNA 抽屜試劑盒提取各組細(xì)胞中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后,進(jìn)行PCR 反應(yīng)。引物序列:circ_TTC3 上游5′-CCTGTGTAGAAGCCATCC GT-3′,下 游5′-ATCATCAGTG GTAAAGTCAGGA GTA-3′;GADPH 上 游5′-CCAAGGTCATCCATGA CAAC-3′,下游5′-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3′。2-△△Ct法計(jì)算circ_TTC3 相對GADPH 的表達(dá)量。
1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和處理 將對數(shù)期HBMEC(2.5 ×104個(gè)/mL)接種至6 孔板中,每孔2.5 mL。培養(yǎng)24 h 后,棄培養(yǎng)液,用LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染si-circ_TTC3、si-NC、pcDNA-circ_TTC3、pcDNA。轉(zhuǎn)染12 h 后,更換為完全培養(yǎng)液。再培養(yǎng)24 h 后,棄培養(yǎng)液,qRT-PCR 法檢測細(xì)胞中circ_TTC3 表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染si-NC、si-circ_TTC3 的HBMEC 均用含1.0 mg/L LPS 的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,分別記為LPS + si-NC 組、LPS + si-circ_TTC3組。轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-circ_TTC3 的HBMEC 均用含50 μmol/L 木通皂苷D 與1.0 mg/L LPS 的培養(yǎng)液共同培養(yǎng)24 h,分別記為LPS +木通皂苷D + pcDNA組、LPS +木通皂苷D + pcDNA-circ_TTC3 組。分別按照“1.2.2”“1.2.3”“1.2.4”項(xiàng)下方法檢測細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率及細(xì)胞中MDA 含量和SOD 活性。1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
LPS 組HBMEC 增殖抑制率、凋亡率及細(xì)胞中MDA 含量均高于對照組(P< 0.05),細(xì)胞中SOD 活性低于對照組(P< 0.05)。LPS +木通皂苷D 低、中、高劑量組HBMEC 增殖抑制率、凋亡率及細(xì)胞中MDA 含量均低于LPS 組(P< 0.05),細(xì)胞中SOD活性高于LPS 組(P< 0.05),且LPS +木通皂苷D 低、中、高劑量組各檢測指標(biāo)兩兩組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05),見圖1、表1。
表1 木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激的影響(±s,n = 3)Tab. 1 The effect of Akebia saponin D on LPS-induced HBMEC apoptosis and oxidative stress (±s,n = 3)
表1 木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激的影響(±s,n = 3)Tab. 1 The effect of Akebia saponin D on LPS-induced HBMEC apoptosis and oxidative stress (±s,n = 3)
注:與對照組相比,*P < 0.05;與LPS 組相比,#P < 0.05;與LPS+木通皂苷D 低劑量組相比,△P < 0.05;與LPS+木通皂苷D 中劑量組相比,□P < 0.05。
分組 抑制率/% 凋亡率/% SOD/(U/L) MDA/(nmol/L)對照組 0.00 ± 0.00 7.79 ± 0.73 446.71 ± 22.77 165.30 ± 15.99 LPS 組 56.39 ± 1.74* 23.70 ± 1.25* 117.21 ± 12.02* 584.58 ± 35.87*LPS+木通皂苷D 低劑量組 45.01 ± 2.44*# 19.48 ± 0.91*# 170.22 ± 12.89*# 505.88 ± 16.60*#LPS+木通皂苷D 中劑量組 31.98 ± 1.38*#△ 15.96 ± 0.82*#△ 229.10 ± 18.72*#△ 367.99 ± 20.79*#△LPS+木通皂苷D 高劑量組 19.41 ± 0.88*#△□ 10.94 ± 0.66*#△□ 384.79 ± 24.38*#△□ 224.32 ± 16.13*#△□F 622.700 152.086 167.797 190.669 P 0.000 0.000 0.000 0.000
圖1 木通皂苷D 抑制LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡Fig. 1 Akebia saponin D inhibits LPS-induced HBMEC apoptosis
LPS 組HBMEC 中circ_TTC3 表 達(dá) 量 高 于 對 照組(P< 0.05)。LPS+木通皂苷D 低、中、高劑量組HBMEC 中circ_TTC3 表達(dá)量均低于LPS 組(P<0.05),且LPS+木通皂苷D 低、中、高劑量組circ_TTC3 表達(dá)量兩兩組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05),見表2。
表2 木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 中circ_TTC3 表達(dá)的影響(±s,n = 3)Tab. 2 The effect of Akebia saponin D on the expression of circ_TTC3 in HBMEC induced by LPS (±s,n = 3)
表2 木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 中circ_TTC3 表達(dá)的影響(±s,n = 3)Tab. 2 The effect of Akebia saponin D on the expression of circ_TTC3 in HBMEC induced by LPS (±s,n = 3)
注:與對照組相比,*P < 0.05;與LPS 組相比,#P < 0.05;與LPS+木通皂苷D 低劑量組相比,△P < 0.05;與LPS+木通皂苷D 中劑量組相比,□P < 0.05。
分組 circ_TTC3對照組 1.00 ± 0.00 LPS 組 4.27 ± 0.12*LPS+木通皂苷D 低劑量組 3.44 ± 0.09*#LPS+木通皂苷D 中劑量組 2.88 ± 0.10*#△LPS+木通皂苷D 高劑量組 1.73 ± 0.13*#△□F 521.446 P 0.000
si-circ_TTC3 組HBMEC 中circ_TTC3 表 達(dá) 量 為0.41 ± 0.03,明顯低于si-NC 組circ_TTC3 表達(dá)量1.00 ±0.00(t= 34.064,P< 0.05), 說 明 si-circ_TTC3 組HBMEC 中circ_TTC3 表達(dá)較si-NC 組沉默。pcDNAcirc_TTC3 組HBMEC 中circ_TTC3 表達(dá) 量 為1.96 ±0.06,明顯高于pcDNA組circ_TTC3表達(dá)量1.00 ± 0.00(t= 26.847,P< 0.05),說明pcDNA-circ_TTC3 組HBMEC 中circ_TTC3 表達(dá)較pcDNA 組過表達(dá)。
LPS + si-circ_TTC3 組HBMEC 增殖抑制率、凋亡率及細(xì)胞中MDA 含量均低于LPS + si-NC 組(P<0.05),細(xì)胞中SOD 活性高于LPS + si-NC 組(P<0.05),見圖2、表3。
圖2 沉默circ_TTC3 抑制LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡Fig. 2 Silencing circ_TTC3 inhibits LPS-induced HBMEC apoptosis
表3 沉默circ_TTC3 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激的影響(±s,n = 3)Tab. 3 The effect of silencing circ_TTC3 on LPS-induced HBMEC apoptosis and oxidative stress(±s,n = 3)
表3 沉默circ_TTC3 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激的影響(±s,n = 3)Tab. 3 The effect of silencing circ_TTC3 on LPS-induced HBMEC apoptosis and oxidative stress(±s,n = 3)
分組 抑制率/% 凋亡率/% SOD/(U/L) MDA/(nmol/L)LPS+si-NC 組56.41 ± 2.22 23.86 ± 1.30 119.76 ± 12.86 573.16 ± 27.43 LPS+si-circ_TTC3 組24.26 ± 1.46 12.56 ± 0.59 355.54 ± 19.90 252.26 ± 12.63 t 20.957 13.710 17.236 18.406 P 0.000 0.000 0.000 0.000
LPS +木通皂苷D+pcDNA-circ_TTC3組HBMEC增殖抑制率、凋亡率及細(xì)胞中MDA 含量均高于LPS +木通皂苷D + pcDNA 組(P< 0.05),細(xì)胞中SOD 活性低于LPS +木通皂苷D + pcDNA 組(P< 0.05),見圖3、表4。
圖3 過表達(dá)circ_TTC3 逆轉(zhuǎn)木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡的抑制作用Fig. 3 Overexpression of circ_TTC3 reverses the inhibitory effect of Akebia saponins D on LPS-induced HBMEC apoptosis
表4 過表達(dá)circ_TTC3 逆轉(zhuǎn)木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激的作用(±s,n = 3)Tab. 4 Overexpression of circ_TTC3 reverses the effect of Akebia saponin D on LPS-induced HBMEC apoptosis and oxidative stress(±s,n = 3)
表4 過表達(dá)circ_TTC3 逆轉(zhuǎn)木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激的作用(±s,n = 3)Tab. 4 Overexpression of circ_TTC3 reverses the effect of Akebia saponin D on LPS-induced HBMEC apoptosis and oxidative stress(±s,n = 3)
分組 抑制率/% 凋亡率/% SOD/(U/L) MDA/(nmol/L)LPS+木通皂苷D+pcDNA 組19.64 ± 1.08 10.96 ± 0.68 379.52 ± 29.90 228.87 ± 12.75 LPS+木通皂苷D+pcDNAcirc_TTC3 組42.18 ± 1.97 19.12 ± 0.73 193.10 ± 10.31 446.48 ± 19.66 17.377 14.167 10.209 16.085 P 0.000 0.000 0.000 0.000 t
人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)是腦內(nèi)微環(huán)境的主要結(jié)構(gòu),HBMEC 的損傷是常見腦微血管疾病的使動環(huán)節(jié)。腦組織損傷后,腦微血管攣縮、內(nèi)皮細(xì)胞體積變小、細(xì)胞間的間隙增加,逐步形成血栓,加重腦損傷[6]。LPS 是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分,其可激活細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和凋亡途徑,誘導(dǎo)細(xì)胞損傷[7]。LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 損傷模型常被用于體外模擬腦損傷。在LPS 的作用下,內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的多種氧化酶產(chǎn)生大量活性氧(ROS),過量的ROS可引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng),造成細(xì)胞氧化損傷[8]。MDA 是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一,其水平高低可間接反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平[9]。SOD 是一種抗氧化酶,其可清除氧自由基,減輕細(xì)胞氧化損傷[10]。細(xì)胞內(nèi)MDA 含量的增加及SOD 活性的降低可說明細(xì)胞氧化受損。
續(xù)斷是川續(xù)斷科多年生草本植物川續(xù)斷DipsacusasperWall.ex Henry 的干燥根,具有補(bǔ)肝、強(qiáng)筋骨等功效。木通皂苷D 是續(xù)斷的主要活性成分,具有神經(jīng)保護(hù)、心肌保護(hù)、抗骨質(zhì)疏松、保肝降脂等藥理作用[11]。已有研究表明,木通皂苷D 可抑制神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡,具有治療緩解神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的急性肺損傷的潛在價(jià)值[12];木通皂苷D 可通過下調(diào)ECE2 和A2M 基因表達(dá)保護(hù)PC12 細(xì)胞免受Aβ25-35損傷[13]。然而,還未見木通皂苷D 影響人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示,木通皂苷D 抑制LPS 引起的HBMEC 凋亡及氧化應(yīng)激損傷。
circRNA 是一類非編碼RNA,呈閉合環(huán)狀,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且高度保守。近年來,隨著對circRNA研究的深入,發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激等過程中起重要調(diào)控作用[14-16]。研究已表明,circ_0003423[17]、circ_ANRIL[18]等circRNA 參 與 調(diào)控HBMEC 損傷,可作為減輕HBMEC 損傷的分子靶點(diǎn)。作為一種circRNA,circ_TTC3 也參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激等過程[19-20]。本研究結(jié)果顯示,circ_TTC3 也可能成為減輕HBMEC 損傷的分子靶點(diǎn),且木通皂苷D 可能通過下調(diào)circ_TTC3來抑制LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)。
木通皂苷D 可能通過下調(diào)circ_TTC3 表達(dá)在LPS誘導(dǎo)的HBMEC 損傷模型中發(fā)揮保護(hù)作用,其具有治療腦血管疾病的潛在藥用價(jià)值。但本實(shí)驗(yàn)僅利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了研究,后續(xù)將進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證木通皂苷D 對HBMEC 損傷的保護(hù)作用,同時(shí)進(jìn)一步探究circ_TTC3 調(diào)控的下游基因和信號通路。