張連軍，莫 鳴，李 博，張啟春

（1.江蘇省榮軍醫(yī)院 藥劑科，江蘇 無錫 214035；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省植物藥深加工工程研究中心，江蘇 南京 210023）

中藥組合篩選思路是借鑒組合化學(xué)的方法，將中藥復(fù)方藥效物質(zhì)的基本構(gòu)造單元，在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，通過配伍比例的優(yōu)化整合，篩選藥效物質(zhì)的最優(yōu)化，探討中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)和機(jī)制；其理念與組合藥物的思路有交叉，也和中藥方劑的配伍密切相關(guān)[1-2]。引入組合篩選的研究思路，能夠逆向思維、化繁為簡，通過中藥復(fù)方中不同藥物組合以及藥效物質(zhì)單元（含有效部位、組分、成分）[3]組成的簡單組合體系研究，逐步過渡到復(fù)方的復(fù)雜體系，不斷挖掘各組分間更深層次的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。在對中藥及其復(fù)方?jīng)]有完全認(rèn)知的前提下，可為中藥復(fù)方研究提供更多的探索方法。

近年來，黃連解毒湯在血脂代謝方面的研究逐步受到關(guān)注，通過加減方、拆方等研究證實(shí)了黃連解毒湯對高血脂模型小鼠膽固醇和甘油三酯均有明顯的降低作用。臨床研究的結(jié)果也表明黃連解毒湯對高血脂的調(diào)節(jié)效果不亞于辛伐他汀，且安全性較高，對肝腎功能無明顯損害[4-5]。生物堿類、黃酮類、環(huán)烯醚萜苷類是黃連解毒湯中主要的三大類成分，而三大類成分中含量較高的分別為小檗堿、黃芩苷和梔子苷。有觀點(diǎn)認(rèn)為小檗堿本身具有良好的血脂代謝調(diào)節(jié)作用[6]，那么黃連解毒湯復(fù)方中增加小檗堿含量是否有利于提高顯著療效，同時對復(fù)方中其它組分的溶出與吸收有何影響？黃芩苷含量變化對復(fù)方中的小檗堿會產(chǎn)生怎樣的影響？梔子苷在復(fù)方中對調(diào)節(jié)血脂有何作用？本研究參考黃連解毒湯及其成分模擬組合對腦缺血大鼠藥動學(xué)研究的配制方法[7-8]，通過小檗堿、黃芩苷和梔子苷組成的黃連解毒湯模擬體系，探討小檗堿、黃芩苷和梔子苷含量變化對黃連解毒湯調(diào)節(jié)模型小鼠血脂代謝的影響。

1 材料

1.1 藥品與試劑

黃連（批號：2019120581）、黃芩（批號：191201）、黃柏（批號：2000101）、梔子（批號：191223）均購于江蘇同濟(jì)中藥飲片有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定均符合2020 年版《中國藥典》規(guī)定；小檗堿（含量：98%，批號：KJ20200718）、黃芩苷（含量：95%，批號：KJ20200804）、梔子苷（含量：95%，批號：KJ20200904）均購于武漢凱杰藥業(yè)有限責(zé)任公司；辛伐他?。ê浚?7%，批號：026M4002V，Sigma-Aldrich）；甘油三酯（TG）試劑盒、總膽固醇（TC）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、卵磷脂膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶（LCAT）試劑盒，均購于南京建成生物工程公司；小鼠低密度脂蛋白（LDL）ELISA試劑盒（上海篤瑪生物科技有限公司）；脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（Lp-PLA2）試劑盒（Cayman Chemical）。

1.2 儀器

BS224 型 電 子 天 平（德 國Sartorius）；Agilent 1100 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；TGL-16C 型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器制造廠）；YXQ-LS-50S Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠）；Direct-Q with pump型超純水儀（德國Merck Millipore 公司）；LB941 型微孔板式多功能酶標(biāo)儀（德國Berthold 公司）；YC-300L 型藥品儲存柜（中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司）；FORMA700型超低溫冰箱（美國Thermo 公司）；ZORBAXSB-C18色譜柱（美國安捷倫科技公司，4.6 mm × 250 mm，5 μm）。

1.3 動物與飼料

SPF 級C57BL/6J 小鼠，6 周齡，雄性，體質(zhì)量為（21±2）g，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，許可證號：SCXK（蘇）2015-0001。標(biāo)準(zhǔn)飼料（PicoLab Rodent Diet 20，5053，14% from fat）；高脂飼料（Harlan Teklad TD.88137，42% from fat）。

2 方法

2.1 高血脂模型小鼠制備

C57BL/6J 小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性藥物組、黃連解毒湯組、黃連解毒湯模擬藥物組、小檗堿高劑量模擬藥物組、黃芩苷高劑量模擬藥物組和缺梔子苷模擬藥物組，每組8 只，共8 組。正常組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，其它組給予高脂飼料，室內(nèi)溫度為（23 ±2）℃，自由飲食和攝水。造模12 周后取血測總膽固醇（12 周期間各組給予相對應(yīng)飼料和水，未給藥）。

2.2 藥物制備

黃連、黃芩、黃柏、梔子按質(zhì)量3 ∶2 ∶2 ∶3分別稱取黃連45 g、黃芩30 g、黃柏30 g、梔子45 g，加10 倍量水煎煮1.5 h，收集濾液；再加8 倍量水煎煮1.5 h，收集濾液；合并兩次濾液，濃縮至1 g 生藥/mL。并采用HPLC 測定復(fù)方中小檗堿、黃芩苷、梔子苷的含量。色譜條件：流動相為乙腈和0.1%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL，檢測波長：238、280、345 nm[9]。

模擬藥物配制：按復(fù)方中小檗堿、黃芩苷、梔子苷的成分含量和比例進(jìn)行模擬，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)對黃連解毒湯HPLC 含量測定的結(jié)果（小檗堿：14.85 mg/mL、黃芩苷：10.59 mg/mL、梔子苷：13.46 mg/mL），分別稱取適量小檗堿、黃芩苷、梔子苷配制模擬藥物，得到黃連解毒湯原方模擬藥物（小檗堿：14.85 mg/mL、黃芩苷：10.59 mg/mL、梔子苷：13.46 mg/mL）、黃連解毒湯小檗堿高劑量模擬藥物 （小檗堿：29.70 mg/mL、黃芩苷：10.59 mg/mL、梔子苷：13.46 mg/mL）、黃連解毒湯黃芩苷高劑量模擬藥物（小檗堿：14.85 mg/mL、黃芩苷：21.18 mg/mL、梔子苷：13.46 mg/mL）、黃連解毒湯缺梔子苷模擬藥物（小檗堿：14.85 mg/mL、黃芩苷：10.59 mg/mL）。

2.3 給藥與血樣采集

正常組和模型組灌胃相同體積生理鹽水，陽性藥物組灌胃辛伐他?。?.007 g/kg），其它組參考《中藥藥理研究方法學(xué)》[10]實(shí)驗(yàn)動物劑量換算，分別灌胃相應(yīng)中藥或模擬藥物，給藥劑量為6.53 g/kg。連續(xù)給藥四周后眼眶采血，血液于離心機(jī)2 000 r/min 離心20 min，收集血清待用。采用GPO-PAP 酶法試劑盒測總膽固醇、甘油三酯，采用SOD 試劑盒（WST-1 法）測SOD，采 用ELISA 試 劑 盒 測LDL、Lp-PLA2、LCAT 等指標(biāo)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Graphpad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組血脂指標(biāo)比較

造模12 周后取血測總膽固醇，與正常組相比，模型組和給藥組小鼠膽固醇明顯升高（P＜ 0.05），提示高血脂癥小鼠造模成功。給藥后，與模型組相比，陽性藥物組、黃連解毒湯組、黃連解毒湯模擬藥物組和小檗堿高劑量模擬藥物組TC、TG 和LDL 水平均明顯下降（P＜ 0.05），其中，小檗堿高劑量模擬藥物組與陽性藥物組作用基本相當(dāng)。與陽性藥物組相比，黃芩苷高劑量模擬藥物組和缺梔子苷模擬藥物組各項(xiàng)指標(biāo)明顯上升（P＜ 0.05），見表1。

表1 各組給藥后血脂指標(biāo)比較 （±s, n = 8）Tab. 1 Comparison of blood lipid indexes after administration in each group （±s, n = 8）

表1 各組給藥后血脂指標(biāo)比較 （±s, n = 8）Tab. 1 Comparison of blood lipid indexes after administration in each group （±s, n = 8）

注：模型組與正常組比較，*P ＜0.05；各給藥組與模型組比較， #P ＜0.05；黃連解毒湯及其模擬組與陽性藥物組比較，△P ＜0.05。

組別 TC /（mmol/L） TG /（mmol/L） LDL-C /（mmol/L）正常組 2.04 ± 0.20 0.83 ± 0.15 3.18 ± 0.54模型組 4.32 ± 0.73* 1.90 ± 0.15* 7.67 ± 1.45*陽性藥物組 2.07 ± 0.25# 0.86 ± 0.07# 3.23 ± 0.44#黃連解毒湯組 3.16 ± 0.18# 1.34 ± 0.17# 5.57 ± 0.71#△黃連解毒湯模擬藥物組 2.74 ± 0.22# 1.17 ± 0.16# 4.74 ± 0.50#小檗堿高劑量模擬藥物組 2.29 ± 0.08# 0.95 ± 0.13# 3.91 ± 0.73#黃芩苷高劑量模擬藥物組 3.68 ± 0.71△ 1.78 ± 0.22△ 6.58 ± 0.57△缺梔子苷模擬藥物組 3.42 ± 0.26△ 1.69 ± 0.23△ 6.37 ± 0.85△F 16.753 25.882 17.945 P 0.000 0.000 0.000

3.2 各組模擬藥物對Lp-PLA2 的影響

與正常組相比，模型組Lp-PLA2 升高（P＜0.05），達(dá)到（190.05±17.68）nmol/mL。與模型組相比，各給藥組Lp-PLA2 均有不同程度下降，其中，陽性藥物組和小檗堿高劑量模擬藥物組明顯降低（P＜ 0.05），分別為（124.08±10.66）nmol/mL、（137.17±10.13）nmol/mL。與陽性藥物組相比，黃芩苷高劑量模擬藥物組和缺梔子苷模擬藥物組則明顯升高（P＜ 0.05），分別為（171.46±11.16）nmol/mL和（161.04±12.37）nmol/mL，見圖1。

圖1 各組藥物對Lp-PLA2 的影響（n = 8）Fig. 1 The effect of different drugs on Lp-PLA2（n = 8）

3.3 各組模擬藥物對SOD 的影響

與正常組相比，模型組SOD 表達(dá)明顯下降（P＜0.05），為（11.28±1.16）U/mL。與模型組相比，各給藥組SOD 表達(dá)均有上升，其中，陽性藥物組、黃連解毒湯組、黃連解毒湯模擬藥物組和小檗堿高劑量模擬藥物組表達(dá)均明顯升高（P＜ 0.05），分別為（18.87±0.91）U/mL、（15.06±1.41）U/mL、（16.26±0.98）U/mL 和（17.03±1.36）U/mL。與陽性藥物組相比，黃芩苷高劑量模擬藥物組和缺梔子苷模擬藥物組SOD 表達(dá)明顯降低（P＜ 0.05），分別為（12.49±1.20）U/mL、（14.04±1.02）U/mL，見圖2。

圖2 各組藥物對SOD 的影響（n = 8）Fig. 2 The effect of different drugs on SOD（n = 8）

3.4 各組模擬藥物對LCAT 的影響

與正常組相比，模型組LCAT 表達(dá)明顯下降（P＜0.05），為（14.93±1.88）ng/mL。與模型組相比，各給藥組LCAT 表達(dá)均有上升，其中，陽性藥物組、黃連解毒湯組、黃連解毒湯模擬藥物組和小檗堿高劑量模擬藥物組表達(dá)均明顯升高（P＜ 0.05），分別為（34.41±3.24）ng/mL、（22.85±3.46）ng/mL、（27.98±2.52）ng/mL 和（33.46±2.35）ng/mL。與陽性藥物組相比，黃芩苷高劑量模擬藥物組和缺梔子苷模擬藥物組LCAT 表達(dá)明顯下降（P＜ 0.05），分別為（20.66±4.60）ng/mL、（17.21±3.77）ng/mL，見圖3。

圖3 各組藥物對LCAT 的影響（n = 8）Fig. 3 The effect of different drugs on LCAT（n = 8）

4 討論

黃連解毒湯及其模擬藥物對膽固醇作用效果基本相近，為模擬組合篩選進(jìn)一步研究提供了相關(guān)基礎(chǔ)。小檗堿能通過抑制炎癥因子、延緩血管內(nèi)皮損傷、促進(jìn)脂質(zhì)逆轉(zhuǎn)運(yùn)與清除等方式促進(jìn)脂代謝平衡。增加復(fù)方黃連解毒湯模擬藥物中小檗堿的含量有利于降低TC、TG、LDL 等指標(biāo)，同時能明顯抑制Lp-PLA2 等炎癥因子的表達(dá)；而高劑量的黃芩苷則使復(fù)方抗炎作用明顯弱化，且不利于發(fā)揮復(fù)方整體的降脂作用，此結(jié)果可能與黃芩苷與小檗堿形成共沉淀而影響小檗堿吸收有關(guān)；相關(guān)研究也表明二者可以通過配比優(yōu)化分別作用于不同靶點(diǎn)，從而在復(fù)方中對炎癥反應(yīng)發(fā)揮互補(bǔ)作用[11]，兩者間針對降脂作用的最佳比例有待后續(xù)研究。通過本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可以推測，以小檗堿為代表的生物堿類是黃連解毒湯調(diào)節(jié)血脂代謝的關(guān)鍵組分。

黃連解毒湯中黃芩苷等黃酮類組分、黃連提取物和梔子提取物均有抗氧化活性，但與梔子黃色素相比，梔子苷的抗氧化作用稍弱[12-13]。本研究結(jié)果表明，不同比例的模擬組合藥物都能提高高血脂小鼠的SOD 活性，增強(qiáng)抗氧化能力；但黃芩苷高劑量組SOD 表達(dá)明顯弱于黃連解毒湯模擬藥物組和小檗堿高劑量組，也從側(cè)面表明高劑量的黃芩苷有可能削弱復(fù)方中以小檗堿為代表的生物堿類成分的抗氧化作用，而降低復(fù)方中黃酮類成分對抗氧化能力的影響還有待于進(jìn)一步研究。

LCAT 是膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)（RCT）過程中催化膽固醇生成膽固醇酯的關(guān)鍵酶，是血脂代謝的重要環(huán)節(jié)。在黃連解毒湯模擬藥物中小檗堿比例的增加能明顯提高LCAT 的表達(dá)，從而有利于外周膽固醇通過RCT 途徑加速代謝，而缺梔子苷模擬藥物組和黃芩苷高劑量模擬藥物組的LCAT 表達(dá)明顯低于其它給藥組，此結(jié)果也表明小檗堿和梔子苷在復(fù)方降脂過程中具有協(xié)同作用。

小檗堿+黃芩苷+梔子苷和黃連解毒湯全方在大鼠各個腸段的有效滲透系數(shù)、吸收速率參數(shù)均明顯優(yōu)于小檗堿單體[14]。小檗堿、小檗堿+黃芩苷、小檗堿+梔子苷以及小檗堿+黃芩苷+梔子苷的藥動學(xué)研究也表明，梔子苷對小檗堿吸收有明顯促進(jìn)作用，而黃芩苷則相反，但三者組合則又能降低黃芩苷對小檗堿吸收的影響[15]。由于梔子苷的吸收和分布均較快，血藥濃度達(dá)峰時間為三者中最快，且消除相對緩慢[16]，也為梔子苷促進(jìn)復(fù)方中其它成分的吸收和代謝提供了可能。綜上所述，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推斷，在復(fù)方中促進(jìn)小檗堿的吸收和代謝，以及弱化黃芩苷對復(fù)方整體的影響是梔子苷發(fā)揮降脂作用的一個重要方面，而梔子苷與其它成分的優(yōu)化配比也有待深入研究。

5 結(jié)論

通過黃連解毒湯組合模擬體系的研究，從簡化的角度認(rèn)識了以小檗堿為代表的生物堿類成分在復(fù)方黃連解毒湯中的主導(dǎo)作用，同時為其它中藥復(fù)方的作用機(jī)制研究提供了更多的探索方法，也有利于臨床根據(jù)患者的治療側(cè)重點(diǎn)通過加減方充分發(fā)揮中藥復(fù)方辨證論治、用藥配伍與綜合調(diào)理的作用。黃連解毒湯中各組分的配比優(yōu)化有利于實(shí)現(xiàn)復(fù)方作用的最大化。模擬組合藥物中各成分的比例需要在后續(xù)研究中更加細(xì)化，逐步探索多種組分的最優(yōu)組合，而含量變化對肝腎等功能的影響也需要進(jìn)一步考察。