劉曉玫 王東鑫 張春 魏雙施

（中國科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)重點實驗室 中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，蘇州 215163）

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引發(fā)了2019冠狀病毒?。–OVID-19）全球大流行疫情。目前，該病毒已在全球范圍內(nèi)導(dǎo)致上億人感染，當(dāng)前疫情仍在蔓延中，給人類健康帶來了巨大的威脅。SARS-CoV-2屬于冠狀病毒科，與SARSCoV、MERS-CoV、Bat-SL-CoV同屬于β冠狀病毒屬［1］。基因組為線性單股正鏈的RNA，主要編碼三類病毒蛋白：結(jié)構(gòu)蛋白（structural protein）、非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structure protein），以及附屬蛋白（accessory protein）。S蛋白構(gòu)成病毒表面的刺突，通過（receptor-binding domain，RBD）與宿主細胞表面的受體結(jié)合，使病毒得以吸附、侵入細胞［2］。隨著全球范圍內(nèi)的傳播，SARS-CoV-2還在不斷地發(fā)生變異，這無疑會加大藥物的研發(fā)難度和時間。因此，需要一種快速、靈活性高的抗新冠病毒治療方案。

RNA干擾（RNAi）是最早在植物中發(fā)現(xiàn)的一種抗病毒自然免疫機制，為序列特異性的，轉(zhuǎn)錄后的基因沉默［3］。RNAi的生物學(xué)機制是由小的雙鏈RNA靶向同源mRNA，誘導(dǎo)其發(fā)生降解。RNAi技術(shù)的抗病毒潛力首先是在抗呼吸道合胞病毒感染中被證明的［4］，隨后應(yīng)用于多種病毒性傳染病的治療研究中，包括人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）、丙型肝炎病毒（HCV）、乙肝病毒（HBV）、埃博拉病毒（Ebolavirus）、甲型流感病毒（Influenza A virus）等［5］。此外，研究發(fā)現(xiàn)利用RNAi能夠有效地抗SARS-CoV感染，且無毒性效應(yīng)［6-8］。相對于傳統(tǒng)的病毒性傳染病治療藥物，RNAi治療有其獨特的優(yōu)勢，如，高度序列特異性的基因沉默，對治療目標(biāo)無選擇，易于設(shè)計、構(gòu)建和驗證。而主要挑戰(zhàn)在于，如何以有效、安全的方式將siRNA精確地遞送至靶細胞和器官，并保持其穩(wěn)定性。

重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）載體是目前公認的最有前景的基因治療遞送載體。rAAV具有安全性高、免疫原性和細胞毒性低、宿主范圍廣等優(yōu)勢。目前尚未見利用AAV介導(dǎo)的RNAi在抗SARS-CoV-2感染中的報道。本研究以SARS-CoV-2 S基因為靶標(biāo)設(shè)計shRNA，利用rAAV載體高效遞送，旨在探索抗SARS-CoV-2感染的可能方法。

1 材料與方法

1.1 材料

pFastBacDual-ITR-CMV-EGFP質(zhì) 粒、pFastBac-Dual-scITR-CMV-EGFP質(zhì)粒、pFastBacDual-inCap6質(zhì)粒、pAAV-U6質(zhì)粒、pFastBacDual-ITR-PRDX6-T2AEGFP質(zhì)粒、pFastBacDual-inRep質(zhì)粒、大腸桿菌SURE2感受態(tài)細胞、DH10Bac均由中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所細胞和基因治療研究中心構(gòu)建或保存；pcDNA6B-nCoV-S-FLAG 由山東大學(xué)高等醫(yī)學(xué)研究院王培會教授惠贈；siRNA DNA序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。293T細胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。6周齡C57BL/6小鼠由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物實驗經(jīng)中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所實驗動物倫理委員會審查批準，符合動物福利倫理要求。

限制性內(nèi)切酶購自NEB公司，T4 DNA 連接酶購自Thermo Fisher公司，KOD-Plus高保真聚合酶購自TOYOBO公司，質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Axygen公司，無縫克隆試劑盒、RNA抽提試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白電泳試劑、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗、actin抗體等購自碧云天生物技術(shù)公司、cDNA合成試劑、qPCR Mix購自翌圣生物科技（上海）有限公司，抗S單克隆抗體為中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所血液免疫學(xué)研究中心制備。DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司、胎牛血清購自四季青公司。PEI轉(zhuǎn)染試劑購自Polyscience公司。

1.2 方法

1.2.1 SARS-CoV-2 S基因克隆 以pcDNA6B-nCoVS-FLAG質(zhì)粒為模板PCR擴增S基因，引物為：上游 引 物 5′-CGAACATCGATTGAATTCGCCACCATGG TCTCTAGTCAGTGTGTTAATCT-3′，下游引物 5′-AGG TGATGGTGATGGTGATGTGTGTAATGTAATTTGACT CC-3′。以 pFastBacDual-ITR-PRDX6-T2A-EGFP 質(zhì)粒為模板擴增T2A-EGFP序列，引物為：上游引物5′-CAAGGATGACGACGATAAGGGAAGCGGAGAGGGC AGAGG-3′，下游引物為 5′-GATGAGTTTTTGTTCGA ACCGCGGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′。通過EcoR I和Xho I雙酶切去掉pFastBacDual-ITR-CMVEGFP質(zhì)粒中的EGFP基因，保留其余骨架，通過無縫克隆將S基因和T2A-EGFP PCR產(chǎn)物一步連接到骨架中，獲得重組質(zhì)粒pFastBacDual-ITR-S-T2AEGFP。

1.2.2 shRNA設(shè)計與克隆 通過在線 RNAi 設(shè)計網(wǎng)站（BLOCK-iTTMRNAi Designer）靶向 SARS-CoV-2（MN908947.3）S基因設(shè)計若干 shRNA 序列，NCBI blast 驗證其特異性。shRNA 序列從 5′到 3′的順序依次為過客鏈、loop 環(huán)和引導(dǎo)鏈。shRNA 寡核苷酸序列如表1所示。頂鏈和底鏈退火形成雙鏈，具體方法為：100 μmol/L濃度的寡核苷酸頂鏈和底鏈各2 μL中加入5×退火緩沖液，用水補充至10 μL，在PCR儀中95℃ 孵育4 min，自然冷卻到室溫，此過程可產(chǎn)生互補的雙鏈DNA。pAAV-U6質(zhì)粒用Bsa I酶切純化后，與退火的雙鏈DNA連接，得到pAAV-U6- shRNA/S質(zhì)粒，測序鑒定連接的正確性。

表1 shRNA 寡核苷酸序列Table 1 Oligonucleotide sequence of shRNA

1.2.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 293T細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM完全培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染前一天，細胞以1.5×105個/孔的密度接種于24孔板中。0.5 μg的pFastBacDual-ITR-S-T2A-EGFP 和 0.5 μg的 pAAV-U6-shRNA/S質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細胞，未插入shRNA寡核苷酸序列的pAAV-U6空質(zhì)粒作為陰性對照，轉(zhuǎn)染試劑為聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）。具體轉(zhuǎn)染方法為：1.2 μL 50 mmol/L PEI 用HBS緩沖液稀釋到15 μL，兩種質(zhì)粒同時加到HBS緩沖液中至總體積15 μL，分別于室溫作用10 min，再將PEI溶液加入到質(zhì)粒溶液中，混勻，室溫作用10 min，然后將轉(zhuǎn)染試劑輕輕滴加到細胞上。用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，48 h后收集細胞進行檢測。

1.2.4 重組腺相關(guān)病毒（rAAV）包裝和純化 pAAV-shRNA/S質(zhì)粒通過Mlu I和BstE II酶切，連接到pFastBacDual-scITR-CMV-EGFP質(zhì)粒骨架中，獲得pFastBacDual-scITR-shRNA/S。將pFastBacDual-scITR-shRNA/S質(zhì) 粒、pFastBacDual-inCap6質(zhì) 粒、pFast-BacDual-inRep質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞中，經(jīng)過藍白斑篩選獲得相應(yīng)的桿粒Bacmid。Bacmid轉(zhuǎn)入Sf9細胞中包裝產(chǎn)生桿狀病毒Baculovirus，將桿狀病毒擴增至P3代。3種桿狀病毒共同感染昆蟲細胞Sf9，包裝獲得rAAV，經(jīng)過CsCl密度梯度離心的方法純化rAAV病毒；熒光定量PCR標(biāo)準曲線法檢測rAAV病毒的滴度，pAAV-U6質(zhì)粒測定濃度后，系列稀釋至1010-106/μL作為標(biāo)準品，病毒溶液稀釋10倍取1 μL作為目標(biāo)模板，U6序列上游引物 ：5′-CGATACAAGGCTGTTAGAG-3′，下游引物 ：5′- TTCAAGTTACGGTAAGCATAT -3′。

1.2.5 rAAV感染體外培養(yǎng)細胞 轉(zhuǎn)染前1 d，細胞1.5×105個/孔的密度接種于24孔板中。按照1.2.3方法所述，配制含0.5 μg pFastBacDual-ITR-S-T2AEGFP的轉(zhuǎn)染溶液，用500 μL完全培養(yǎng)基稀釋MOI為105的rAAV-shRNA，替換原來的細胞培養(yǎng)基，然后把質(zhì)粒轉(zhuǎn)染溶液滴加在細胞上，72 h后收集細胞進行檢測，rAAV-shRNA/vEGF（靶向無關(guān)序列）作為陰性對照。

1.2.6 rAAV-shRNA和S基因表達質(zhì)粒共同注射小鼠 按照1.2.3方法所述，配制15 μg的pFastBacDual-ITR-S-T2A-EGFP轉(zhuǎn)染溶液，與含有 Mg2+和 Ca2+的 HBSS中稀釋的1011MOI的rAAV-shRNA混合至總體積90 μL，用移液器取45 μL（總劑量的 1/2）用于鼻內(nèi)滴注，分兩次完成滴注；或?qū)⑸鲜龌旌弦鹤⑸涞叫∈笸鹊拿劰乔凹≈小? d后犧牲小鼠，收集肺或肌肉組織進行qRT-PCR分析。rAAV-shRNA/vEGF作為陰性對照。

1.2.7 RT-PCR和Western blot鑒定 按照組織總RNA提取試劑盒的說明書所述，提取液氮研磨的組織或細胞中的總RNA，以oligo dT為引物反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA，具體步驟為 ：7 μL RNA+2 μL 緩沖液+1 μL DNA酶，于 42℃ 孵育2 min，以消化溶液中存在的基因組DNA，然后加入10 μL 2×反轉(zhuǎn)錄Mix，37℃反轉(zhuǎn)錄1 h，85℃酶失活5 min。以大約100 ng cDNA為模板進行qPCR檢測，SYBR Green染料法。qPCR引物為：S上游引物5′-CCGTGATCCACAGACACTTGA-3′，S 下游引物 5′- AACAGGGACTTCTGTGCAGT-3′；人 源 actin 上 游 引 物 5′-CGAGAAGATGACCCAGAT -3′，人源actin下游引物5′- GATAGCACAGCCTGGATA -3′；鼠源 actin 上游引物 5′- TTCCAGCCTTCCTTCTTG -3′；鼠源 actin 下游引物 5′- ATAGAGGTCTTTACGGATGTC -3′。

將細胞消化離心后用含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰上裂解30 min，15 000×g 4℃條件下離心5 min，取上清，采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白溶液加入上樣緩沖液，100℃煮沸5 min。取30 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，一抗為抗S單克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。用強堿性一抗二抗去除液洗去結(jié)合的一抗和二抗，再用內(nèi)參抗體（抗actin單克隆抗體）孵育，其余步驟同上。

1.2.8 統(tǒng)計分析 每組數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次。使用 GraphPad Prism 8.0軟 件（GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA）非對稱t檢驗進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 293T細胞中不同shRNA對S基因表達的抑制

本實驗共設(shè)計表達了7條shRNA，為了驗證它們對S基因表達的抑制效應(yīng)，首先將shRNA的寡核苷酸DNA克隆至U6啟動子下游的表達質(zhì)粒中，用其與S基因表達質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細胞。qRT-PCR結(jié)果顯示，除shRNA3對S基因表達無明顯抑制作用外，其余均有顯著的抑制作用，其中shRNA1抑制效應(yīng)最明顯（圖1-A）。隨后用Western blot進一步驗證，得出的結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致（圖1-B）。

圖1 不同shRNA對S基因表達的抑制作用分析比較Fig. 1 Analysis and comparison of the inhibitory effects of different shRNAs on the expression of S gene

2.2 rAAV介導(dǎo)shRNA在體外培養(yǎng)細胞中對S基因表達的抑制

根據(jù)2.1結(jié)果，篩選出抑制效應(yīng)最強的shRNA1，將其寡核苷酸序列克隆至AAV包裝質(zhì)粒中，用于包裝rAAV-shRNA1/S，另外一個對照病毒為實驗室現(xiàn)存的靶向vEGF基因shRNA作為對照。病毒與pFastBacDual-ITR-S-T2A-EGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞分析其對S基因表達的抑制作用。qRTPCR（抑制率為65.6%）和Western blot結(jié)果皆顯示其具有顯著抑制S基因表達的作用（圖2）。

圖2 rAAV介導(dǎo)shRNA對S基因表達的體外抑制作用分析Fig. 2 Inhibition analysis of rAAV-mediated shRNA on S gene expression in vitro

2.3 rAAV介導(dǎo)shRNA在小鼠體內(nèi)對S基因表達的抑制

分別采用滴鼻和肌注方式感染肺臟和肌肉組織，驗證體內(nèi)對S基因表達的抑制效應(yīng)。結(jié)果皆顯示rAAV介導(dǎo)shRNA在肺臟和肌肉組織中均具有顯著抑制S基因表達的作用，抑制率分別為36.8%和90.3%（圖 3）。

圖3 rAAV介導(dǎo)shRNA對S基因表達的體內(nèi)抑制作用檢測Fig. 3 Detection of the in vivo inhibitory effect of rAAV-mediated shRNA on S gene expression

3 討論

冠狀病毒（Coronavirus）是一類重要的人畜共患病原體，可引起人、家畜、蝙蝠及其他野生動物的呼吸、胃腸、肝和中樞系統(tǒng)疾病。2003年嚴重急性呼吸綜合征SARS疫情的爆發(fā)，在全球共導(dǎo)致8 098例感染，致死率約為10%。2012年，中東呼吸綜合征MERS感染者2 494人，致死率高達34.4%［9-10］。2019年 12月，SARS-CoV-2引 發(fā) 的2019冠狀病毒病仍在全球范圍內(nèi)大流行。至今，冠狀病毒引發(fā)的3次重大疫情給人類生命健康造成了巨大的威脅。RNA病毒基因組的易突變特性，加大常規(guī)藥物研究的難度。RNAi技術(shù)抑制病毒特定基因表達進而影響病毒復(fù)制、感染，可能成為一種靈活性高的RNA病毒治療策略。

然而，RNA遞送和穩(wěn)定性問題是目前有效治療的主要障礙。RNAi治療有兩種遞送系統(tǒng)：第一種，利用脂質(zhì)體、納米粒子、穿膜肽等非病毒載體直接將體外合成的短干擾RNA（siRNA）遞送至靶細胞。第二種，通過病毒載體遞送siRNA、shRNA和miRNA?；诓《镜奶烊磺秩胄?，基因工程化的重組病毒系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于核酸的跨膜遞送［11］。常用的病毒載體主要包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒等［12］。與其他病毒載體相比，AAV不會引起任何人類疾病，安全性更高［13］。AAV作為載體的其中一個缺陷是機體預(yù)先存在的抗AAV免疫，抑制轉(zhuǎn)基因的有效穩(wěn)定表達。為了解決這一問題，可以采用不同血清型連續(xù)給藥［14］，或工程化衣殼來解決［15］。

本研究選擇了對肺組織有高親和性的6型AAV作為遞送載體，研究了其介導(dǎo)的shRNA在體外和體內(nèi)對S基因表達的抑制效率。結(jié)果顯示，AAV介導(dǎo)的shRNA能夠顯著地抑制S基因表達。在體內(nèi)實驗中，shRNA在肺臟和肌肉組織中的抑制率分別為36.8%和90.3%。分析差異比較大的原因可能在于，AAV對不同組織細胞的侵染性不同造成的，也就是說即使相同MOI的rAAV，由于其對肺臟和肌肉的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率差異而導(dǎo)致它在抑制S基因表達時表現(xiàn)出差異性。在本研究中，由于條件限制，我們并沒有涉及活病毒的感染抑制檢測，因此，rAAV介導(dǎo)的shRNA是否能夠高效抑制SARS-CoV-2感染還需要進一步驗證，但根據(jù)目前結(jié)果我們有理由推測此方法的有效性。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了rAAV6載體表達靶向SARS-CoV-2 S的shRNA，能夠在體外培養(yǎng)細胞和小鼠體內(nèi)有效地抑制SARS-CoV-2 S基因的表達。

致謝

感謝山東大學(xué)高等醫(yī)學(xué)研究院王培會教授轉(zhuǎn)贈SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒和序列。