張雨函 范熠 李婷婷 龐爽 劉為 白可喻 張西美

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京100081；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 國(guó)際生物多樣性中心東亞辦事處，北京 100081）

葉表生境廣闊，總表面積估計(jì)超過(guò)4×108km2，植被模型估計(jì)的葉子總表面積大約是陸地表面積的兩倍［1］，是陸生微生物的一個(gè)巨大且極其多樣化的棲息地，也是地球上最大的微生物棲息地之一。葉表面的環(huán)境是復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的，葉表微生物在這樣極端、緊張和變化的環(huán)境中仍有著豐富的多樣性［2］，葉表面的微生物相互作用可以影響植物種群在自然生態(tài)系統(tǒng)中的適應(yīng)性。葉表微生物不僅促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，還可以抑制病原菌的入侵和定殖，對(duì)植物有著重要的保護(hù)作用［3］。由于植物的空中部分是不適宜微生物生存的開(kāi)放系統(tǒng)，這些微生物極易受到各種環(huán)境條件和營(yíng)養(yǎng)缺乏的影響，不同分類(lèi)群的微生物在植物葉表面的數(shù)量波動(dòng)變化很大［4］，導(dǎo)致對(duì)葉表微生物群落的組成和功能等基本問(wèn)題仍然沒(méi)有清晰的認(rèn)知。研究表明葉表微生物群落較為復(fù)雜［5］，特別是通過(guò)與植物的相互作用進(jìn)而影響整個(gè)生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)，葉表微生物群落及其對(duì)植物生長(zhǎng)、發(fā)育和保護(hù)的重要作用已經(jīng)受到了人們的廣泛關(guān)注［6］。因此盡可能多地保留微生物多樣性可以更好地理解生物多樣性的結(jié)構(gòu)、功能和生態(tài)多樣性［7］。

由于葉表微生物基因組DNA的提取難度較大，葉表微生物在推動(dòng)生態(tài)系統(tǒng)功能和植物群落動(dòng)態(tài)方面作用的研究較少。一直以來(lái)，人們對(duì)葉表微生物的認(rèn)識(shí)是建立在純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，對(duì)葉表微生物多樣性的認(rèn)識(shí)不夠深入。Yang等［5］采用培養(yǎng)和非培養(yǎng)方法對(duì)7種不同植物的葉表微生物群落進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果表明與不依賴(lài)培養(yǎng)的方法相比，傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法無(wú)法檢測(cè)到大多數(shù)優(yōu)勢(shì)的葉表微生物。測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展為微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域帶來(lái)革命性的影響，以擴(kuò)增子測(cè)序和宏基因組測(cè)序?yàn)榇淼姆桥囵B(yǎng)測(cè)序技術(shù)極大地增強(qiáng)了對(duì)葉表微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)的評(píng)估。擴(kuò)增子測(cè)序局限于研究物種的群落組成、物種間的進(jìn)化關(guān)系和群落多樣性［8］，無(wú)法對(duì)微生物的功能做出解釋?zhuān)昊蚪M測(cè)序通過(guò)環(huán)境DNA構(gòu)建克隆文庫(kù)，可以得到生態(tài)環(huán)境中的全部微生物基因的總和，包括可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的微生物基因的總和［9］，提供葉表微生物分類(lèi)群和功能更為準(zhǔn)確的描述［7，10］，幫助我們理解微生物與宿主和環(huán)境的聯(lián)系和微生物組的整體功能［11］，進(jìn)而可以開(kāi)發(fā)新的葉表微生物資源。宏基因測(cè)序同樣為微生物物種鑒定開(kāi)辟了新的研究途徑，它能夠?qū)?fù)雜環(huán)境背景下的基因組異質(zhì)性和進(jìn)化進(jìn)行分析，并提供了遠(yuǎn)比在培養(yǎng)皿中觀察到的微生物多樣性更多的途徑［12-13］。目前，宏基因組學(xué)作為迄今為止最全面地了解微生物群落特征、最大限度地挖掘微生物資源的一種方法，已經(jīng)成為了國(guó)際上微生物生態(tài)學(xué)主要的研究手段。到目前為止，宏基因組學(xué)研究已經(jīng)開(kāi)展了多種常見(jiàn)環(huán)境（如土壤、水等）和極端環(huán)境（如冰川、間歇泉等）的研究［14］，但是對(duì)自然生態(tài)中的各種植物的葉表微生物在生態(tài)系統(tǒng)中的功能和作用尚不清楚。

宏基因組學(xué)研究的第一步是直接從生活在特定環(huán)境中的所有微生物中提取出高質(zhì)量、完整的微生物基因組DNA［15-16］。宏基因組數(shù)據(jù)的質(zhì)量和準(zhǔn)確性依賴(lài)于可靠的取樣和DNA提取程序［17］。取樣的關(guān)鍵是收集到足夠的微生物進(jìn)行測(cè)序，為了保證獲取足夠的葉表微生物基因組DNA，需要對(duì)葉表微生物進(jìn)行有效的分離。已有的研究在改進(jìn)DNA提取過(guò)程中，一般只涉及DNA的提取過(guò)程［18］，很少重視對(duì)葉表微生物的富集和前處理，對(duì)此本研究將目標(biāo)集中在收集葉表微生物細(xì)胞的過(guò)程，尤其是對(duì)洗脫液的選擇。對(duì)于洗脫液的選擇，主要有磷酸緩沖液和無(wú)菌水［19］等，不同洗脫液對(duì)于不同植物葉表微生物的洗脫效果沒(méi)有統(tǒng)一的結(jié)論。由于微生物細(xì)胞通常附著在表面上，并可能被整合成生物膜［20］，使用磷酸緩沖液或無(wú)菌水作為洗脫液的方法無(wú)法洗脫形成生物膜的細(xì)胞，可能會(huì)導(dǎo)致樣本微生物DNA的質(zhì)量不佳，葉表微生物DNA 總量不夠。為了解決葉表微生物多樣性豐富但可獲取的數(shù)量少這一難點(diǎn)，本研究通過(guò)改良洗脫液成分，通過(guò)洗脫并收集更多的葉表微生物，以提高對(duì)葉表微生物DNA的提取質(zhì)量。通過(guò)此方法能夠提高葉表微生物DNA的提取效率，進(jìn)而提高宏基因組文庫(kù)構(gòu)建的成功率，促進(jìn)葉表微生物宏基因組學(xué)研究的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選取內(nèi)蒙古呼倫貝爾草原常見(jiàn)的6種草本植物，分別為羊草（Leymus chinensis（Trin.）Tzvel.）、叉分蓼（Polygonum divaricatum L.）、冷蒿（Artemisia frigida Willd.）、馬藺（Iris lactea Pall. var.chinensis（Fisch.）Koidz.）、披針葉黃華（Thermopsis lanceolata R. Br.）、野韭（Allium ramosum L.）。分別取其植物葉片，放于滅菌的封口袋，每袋大約180 g，每種10袋。迅速將樣品轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室，存放于-20℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 植物葉表微生物的分離和收集 （1）實(shí)驗(yàn)以無(wú)菌水作為對(duì)照，添加表面活性劑Silwet L-77的PBS緩沖液（PBS+ Silwet L-77）為處理。配置PBS磷酸緩沖鹽溶液（1×PBS：137 mmol/L NaCl，10 mmol/L phosphate，2.7 mmol/L KCl，pH 7.4）， 在 每1 000 mL的PBS緩沖液中加入200 μL 表面活性劑Silwet L-77（GE Bayer Silicones），分別稱(chēng)取大約30 g葉片置于2個(gè)500 mL無(wú)菌玻璃瓶中，分別加入一定量的可以淹沒(méi)葉片的無(wú)菌水和PBS+ Silwet L-77，200 r/min振蕩20 min，將微生物細(xì)胞從葉上清洗掉，取出葉片，留下含有菌泥的洗脫液，每組處理重復(fù)2次。（2）將余下的植物樣品采用的同樣的方法，循環(huán)利用洗脫液進(jìn)行振蕩，以此循環(huán)，直至將葉片全部洗完。這樣可以保證葉表微生物更好的富集在一起。（3）將洗脫液通過(guò)100 μm大小的細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾到50 mL離心管中，5 000×g離心10 min，棄去上清液，所得沉淀存于-80℃冰箱，用于DNA的提取。

1.2.2 植物葉表微生物DNA的提取與檢測(cè) 使用MoBio PowerLyzer PowerSoil DNA Isolation Kit按照說(shuō)明進(jìn)行葉表基因組DNA的提取。為了獲得足夠量的DNA用于宏基因組測(cè)序，將洗脫下來(lái)的沉淀全部用于DNA的提?。總€(gè)重復(fù)0.25 g沉淀物）。每個(gè)重復(fù)最終得到的DNA即為用100 μL純水洗脫下來(lái)的DNA。用Thermo NanoDrop2000分光光度計(jì)測(cè)定各樣本DNA的濃度及A260/A280值。將使用不同洗脫液進(jìn)行前處理收集得到的菌泥提取到的葉表微生物宏基因組DNA送到上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，經(jīng)1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，判斷哪一種分離和收集葉表微生物的方法提取得到的基因組DNA可以滿(mǎn)足宏基因組建庫(kù)的要求。

1.2.3 宏基因組測(cè)序 選取滿(mǎn)足宏基因組建庫(kù)的葉表微生物基因組DNA樣品進(jìn)行鳥(niǎo)槍法宏基因組測(cè)序。準(zhǔn)備用于測(cè)序的DNA庫(kù)，根據(jù)Illumina配對(duì)端準(zhǔn)備試劑盒的描述對(duì)DNA提取液進(jìn)行處理。機(jī)械剪切DNA，大小選擇至～180 bp，純化凝膠。測(cè)序是在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的Illumina Hiseq 2000平臺(tái)上進(jìn)行的。

1.2.4 數(shù)據(jù)質(zhì)控 為了提高后續(xù)分析的可靠性和質(zhì)量，對(duì)原始序列數(shù)據(jù)進(jìn)行了以下兩步處理。首先， 使 用 fastp（https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0） 對(duì) reads 3′端 和 5′端 的 adapter序列進(jìn)行質(zhì)量剪切。其次使用fastp（https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0）去除剪切后長(zhǎng)度小于50 bp、平均堿基質(zhì)量值低于20以及含N堿基的reads，保留高質(zhì)量的pair-end reads和singleend reads。

1.2.5 葉表微生物COG功能注釋 使用FLASH對(duì)宏基因組的配對(duì)序列進(jìn)行拼接，將拼接序列上傳到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，并使用MBLASTX（E-value cutoff 1e-6）對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行直系同源聚類(lèi)（clusters of orthologous groups of proteins，COG）功能注釋?zhuān)⒆⑨尳Y(jié)果進(jìn)行分類(lèi)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 植物葉表微生物總DNA質(zhì)量評(píng)估

宏基因組一次建庫(kù)濃度/總量標(biāo)準(zhǔn)：濃度 ≥10 ng/μL，文庫(kù)構(gòu)建需要總量5-10 μg的環(huán)境DNA。由表1可知以PBS+ Silwet L-77為洗脫液分離收集得到的植物葉表微生物DNA的濃度都大于20 ng/μL且總量都大于5 μg，能夠滿(mǎn)足宏基因組建庫(kù)的要求。以無(wú)菌水作為洗脫液得到的葉表微生物最終獲得的DNA濃度較低且總量不滿(mǎn)足宏基因組文庫(kù)構(gòu)建所需的環(huán)境DNA總量。通常用A260/A280檢測(cè)DNA的純度，通過(guò)兩種方法得到的每種植物葉表微生物DNA的OD260/280在1.8-2.0之間，說(shuō)明DNA純度都滿(mǎn)足建庫(kù)要求（表1）。對(duì)植物種類(lèi)和提取方法對(duì)葉表微生物DNA濃度的方差分析結(jié)果表明，植物種類(lèi)對(duì)微生物DNA濃度無(wú)影響，提取方法顯著影響葉表微生物DNA濃度（表2），以PBS+ Silwet L-77為洗脫液分離收集得到的植物葉表微生物DNA的濃度明顯大于以無(wú)菌水為洗脫液分離收集得到的DNA的濃度（圖1）。瓊脂糖凝膠電泳圖（圖2）顯示，以PBS+Silwet L-77為洗脫液分離和收集得到的葉表微生物最終得到的DNA質(zhì)量，DNA主帶 ≥5 kb，DNA溶液無(wú)嚴(yán)重RNA、蛋白、糖類(lèi)等雜質(zhì)污染，而以無(wú)菌水作為洗脫液最后提取出來(lái)的DNA質(zhì)量；膠圖條帶彌散，DNA溶液無(wú)嚴(yán)重RNA、蛋白、糖類(lèi)等雜質(zhì)污染，DNA濃度和總量較低，不滿(mǎn)足宏基因組建庫(kù)需求。綜上所述，用無(wú)菌水洗脫得到微生物較少，提取效率不高，提取得到植物葉表微生物DNA濃度和質(zhì)量不滿(mǎn)足宏基因組建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)，以PBS+ Silwet L-77作為洗脫液所提取微生物相對(duì)較多，提取效率高，提取得到植物葉表微生物DNA都相對(duì)完整且DNA總量滿(mǎn)足宏基因組標(biāo)準(zhǔn)建庫(kù)需求。

圖1 不同洗脫液提取不同植物種類(lèi)葉表微生物的DNA濃度Fig. 1 DNA concentration of leaf surface microorganism extracted from different plant species by different eluents

圖2 六種植物葉表微生物DNA電泳圖Fig. 2 Microbial DNA electrophoresis patterns on the leaf surfaces of 6 plants

表1 無(wú)菌水和PBS緩沖液+Silwet L-77表面活性劑對(duì)葉表微生物基因組DNA的提取效果Table 1 Extraction effect of sterile water and PBS buffer solution +Silwet L-77 surfactant on microbial genomic DNA from leaf surface

表2 植物種類(lèi)與不同富集方法對(duì)DNA濃度的影響Table 2 Effects of plant species and different enrichment methods on DNA concentration

2.2 宏基因組測(cè)序結(jié)果

以PBS+ Silwet L-77為提取葉表微生物的洗脫液獲取的DNA作為最終樣品進(jìn)行宏基因組測(cè)序。通過(guò)數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，過(guò)濾掉低質(zhì)量序列、接頭序列等雜質(zhì)，得到的Clean reads占比在98%以上（表3），表明原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量較高。綜合各項(xiàng)指標(biāo)確定在這6種植物的葉表提取得到用于宏基因組測(cè)序的DNA質(zhì)量合格，滿(mǎn)足建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)，可以進(jìn)行下游的生物信息學(xué)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。經(jīng)過(guò)宏基因組測(cè)序，最終得到葉表微生物的各個(gè)分類(lèi)群占葉表微生物群的相對(duì)比例（圖3）。結(jié)果顯示這6種植物的葉表微生物中的細(xì)菌在全基因組測(cè)序中占比達(dá)到了一半以上，說(shuō)明葉表微生物群落主體由細(xì)菌組成，其次為真菌，古菌最少，幾乎沒(méi)有，其他的非微生物的比例說(shuō)明可能存在植物DNA污染。

圖3 六種植物葉表微生物不同分類(lèi)群的百分比Fig. 3 Percentages of different taxa microorganism on the leaf surfaces of 6 plants

表3 宏基因組測(cè)序統(tǒng)計(jì)Table 3 Metagenomics sequencing statistics

與擴(kuò)增子測(cè)序分析相比，宏基因組學(xué)分析不僅能夠進(jìn)行物種注釋?zhuān)€能夠通過(guò)比對(duì)多個(gè)功能數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行功能注釋?zhuān)沂疚⑸锶郝涞墓δ芏鄻有院凸δ軡摿?。為了揭示?yōu)化方法后提取建庫(kù)得到的葉表DNA宏基因測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，在物種注釋的基礎(chǔ)上，宏基因組分析通過(guò)比對(duì)直系同源聚類(lèi)（COG）進(jìn)行功能注釋分析。通過(guò)BLAST將宏基因組拼接組裝序列與COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，COG功能分類(lèi)富集結(jié)果如圖4所示，說(shuō)明宏基因組建庫(kù)可以滿(mǎn)足物種注釋和功能注釋的需求，達(dá)到揭示微生物群落功能多樣性的研究目的，進(jìn)而表明以PBS+ Silwet L-77為洗脫液收集得到DNA可以通過(guò)宏基因組測(cè)序?qū)χ参锏娜~表微生物進(jìn)行功能研究。

圖4 六種植物葉表微生物COG功能注釋Fig. 4 Functional annotation of microorganism COG on the leaf surfaces of 6 plants

3 討論

本研究以提高葉表微生物的收集和分離為目的，只有獲取足夠多的葉表微生物，才可能進(jìn)一步提高DNA的獲得量。進(jìn)行DNA提取工作的第一步是將微生物從葉片中分離出來(lái)，超聲和震蕩技術(shù)已用于這一目的，但由于操作較為劇烈往往不容易得到大片段的DNA［21］。穩(wěn)定的大片段基因組文庫(kù)能保證基因簇的完整性，更利于目的基因的結(jié)構(gòu)和功能分析［22］，因此大片段DNA的提取是建立高質(zhì)量宏基因組文庫(kù)的關(guān)鍵。超聲波利用聲波產(chǎn)生高速、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌作用會(huì)破壞植物細(xì)胞［22］，為此本研究只采用恒溫?fù)u床震蕩，而沒(méi)有選擇超聲波震蕩。

由于葉片形態(tài)差異，葉片的結(jié)構(gòu)和表面化學(xué)構(gòu)成了一個(gè)特殊的微環(huán)境［6］，各種葉片表面特征，如表皮細(xì)胞連接處形成的凹陷處、沿靜脈和毛狀體基部都被確定為微生物的優(yōu)先附著位置［2］，導(dǎo)致微生物在葉片表面的分布不均勻。之前研究表明無(wú)菌水和磷酸緩沖液這兩種洗脫液對(duì)葉表微生物基因組DNA提取效果基本沒(méi)有差別［19］，目前多采用的是使用磷酸緩沖鹽溶液作為洗脫液來(lái)獲取葉表微生物［23］。相較于無(wú)菌水，PBS磷酸鹽緩沖液具有鹽平衡、可調(diào)整的適宜pH緩沖作用，可以使完整的、具有活性的微生物細(xì)胞保持其特性，面對(duì)復(fù)雜的葉表環(huán)境，微生物需要形成聚集體以及分泌生物活性化合物來(lái)克服這一困難［2］。只使用PBS磷酸鹽緩沖液不足以使我們獲得足夠多的葉表微生物。葉片最外側(cè)的蠟質(zhì)層具有疏水性，普通緩沖液的很難使葉面濕潤(rùn)，而表面活性劑可以降低溶液與葉表蠟質(zhì)層之間的界面張力［24］，使葉片更易被潤(rùn)濕，從而能更有效的收集葉表微生物。已有研究采用含有0.01% Tween-80的PBS緩沖液富集黃瓜（Cucumis sativus L.）葉片表面的微生物［25］，由于水的表面張力為72.4 mN/m，0.1%的Silwet-L77系列有機(jī)硅溶液的表面張力約為21 mN/m［26］，0.1%的Tween 80水溶液的表面張力約為 48.21 mN/m［27］，相比 Tween-80，Silwet L-77 更能降低水的表面張力。Silwet L-77是一種高效有機(jī)硅表面活性劑，具有很強(qiáng)的表面活性，可以在難以濕化的表面迅速擴(kuò)散，幾乎可輕易濕潤(rùn)所有種類(lèi)的葉面，增加葉子濕潤(rùn)性，產(chǎn)生的水膜可以讓微生物在葉子表面活動(dòng)起來(lái)［26，28］，促進(jìn)微生物在葉平面上的運(yùn)動(dòng)，在震蕩的過(guò)程中更容易將微生物從葉表面洗脫下來(lái)。PBS磷酸緩沖液結(jié)合表面活性劑Silwet L-77作為洗脫液被成功應(yīng)用到根際微生物的提取中［29］，但在葉表微生物上的應(yīng)用幾乎沒(méi)有，因此選擇在PBS磷酸緩沖液中加入表面活性劑Silwet L-77提高對(duì)葉表微生物的富集。由于根系上會(huì)附著很多的土壤顆粒，很容易就可以得到足夠的菌泥來(lái)獲得足夠量的根際微生物基因組DNA，而植物葉片表面極小量的微生物以及形態(tài)各異的葉表皮環(huán)境增加了分離和收集葉表微生物的難度，需要大量的植物葉片才可富集得到足夠的菌泥進(jìn)行DNA提取［30］。因此植物葉片樣品的采集量也是獲取足夠葉表微生物基因組DNA的關(guān)鍵因素，由于采樣量的限制，本研究每組處理做了兩次重復(fù)，在以后的方法改進(jìn)中需要注意。

目前，鳥(niǎo)槍法宏基因測(cè)序仍然是適合研究葉表微生物的非培養(yǎng)方法，不僅可以對(duì)環(huán)境樣本中存在的微生物進(jìn)行分類(lèi)［31］，而且可以更深入地了解測(cè)序數(shù)據(jù)中識(shí)別出的微生物的結(jié)構(gòu)、功能和代謝途徑。對(duì)于葉表微生物，宏基因組測(cè)序可以實(shí)現(xiàn)物種注釋和功能描述，通過(guò)增加測(cè)序深度和數(shù)據(jù)量，可以深度揭示植物葉表微生物群落，甚至是低豐度的但可能在生態(tài)系統(tǒng)功能中發(fā)揮重要作用的微生物也可以被發(fā)掘［32］。宏基因組測(cè)序可以得到環(huán)境微生物的全基因組序列［10］，能夠全面顯示樣品中微生物群落的實(shí)際豐度和多樣性。植物的葉表存在各種各樣的微生物，包括細(xì)菌、古生菌、原生生物和真菌［33］，具有高度的多樣性和重要的生態(tài)學(xué)意義。本研究最終得到的每種植物葉表微生物的分類(lèi)群在葉表微生物群中占比各不相同，可能是由于植物種類(lèi)會(huì)影響葉片的微生物攜帶能力。一直以來(lái)，大多數(shù)關(guān)于葉表微生物的研究大部分集中在細(xì)菌上，對(duì)葉表真菌的研究目前也有所增多，但葉表真菌和細(xì)菌很少被同時(shí)研究［12］，葉表很少有古菌，對(duì)葉表古菌的研究幾乎沒(méi)有。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，宏基因組測(cè)序可以對(duì)同一環(huán)境的所有微生物進(jìn)行研究，打破迄今為止大多數(shù)與植物葉表微生物相關(guān)的研究只集中在單個(gè)微生物分類(lèi)群（即細(xì)菌）的界限。通過(guò)COG功能注釋?zhuān)梢詫?duì)基因功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)掘微生物群落功能，對(duì)進(jìn)一步揭示葉表微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究得到了一種可以更高效的分離和收集葉表微生物的方法，Silwet L-77表面活性劑緩沖液的使用提高了葉表微生物的收集量，在震蕩清洗的過(guò)程中，選擇循環(huán)利用洗脫液，一方面可以節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本，另一方面可以更好的富集葉表微生物。通過(guò)商業(yè)試劑盒提取得到的高純度和高質(zhì)量的DNA，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，宏基因組測(cè)序、數(shù)據(jù)質(zhì)控和功能注釋的驗(yàn)證，此方法滿(mǎn)足宏基因組建庫(kù)的要求，并成功進(jìn)行了宏基因組測(cè)序和建庫(kù)。