孫曼鑾 葛賽 卜佳 朱壯彥

（1. 山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，大同 037009；2. 山西大同大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，大同 037009）

核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）廣泛存在于生物體內(nèi)，可對(duì)核糖核酸（RNA）中的磷酸二酯鍵進(jìn)行催化水解。RNase在RNA代謝的各方面都發(fā)揮著重要的作用，參與轉(zhuǎn)錄后的剪切、加工、修飾及降解等過程［1-3］。RNase 對(duì)細(xì)菌體內(nèi)RNA的降解過程主要包括降解mRNA，更新mRNA種類以滿足細(xì)胞對(duì)不同蛋白質(zhì)的需求；降解錯(cuò)誤裝配或有缺陷的RNA，保證基因的正常表達(dá)以行使相應(yīng)功能；極端環(huán)境或應(yīng)激狀態(tài)下降解穩(wěn)定的rRNA或tRNA為細(xì)菌提供核苷酸；降解sRNA，調(diào)控基因表達(dá)。RNase還參與rRNA與tRNA前體分子的修飾，將前體分子加工成為成熟的分子，使其能夠進(jìn)一步行使功能。當(dāng)細(xì)菌遇到特定的環(huán)境壓力（如饑餓、高溫等）時(shí)，RNase能降解不必要的RNA以促使細(xì)胞適應(yīng)極端環(huán)境［4］。此外，RNase可裂解入侵細(xì)菌的病毒RNA分子，是細(xì)胞防御系統(tǒng)的重要組成部分之一［5］。

根據(jù)RNA多核苷酸鏈水解的位置，可將RNase分為兩類：一類為核糖核酸外切酶，其可以水解多核苷酸鏈中末端核苷酸殘基間的磷酸二酯鍵；另一類可以剪切RNA分子內(nèi)部的磷酸二酯鍵，稱為核糖核酸內(nèi)切酶。在體內(nèi)，RNase內(nèi)切酶和外切酶往往聯(lián)合作用，完成重要的生理功能。例如，核糖核酸內(nèi)/外切酶共同參與的RNA剪接［6］：通過大腸桿菌核糖核酸內(nèi)、外切酶的共同作用完成體內(nèi)部分mRNA、sRNA、tRNA和rRNA的剪接過程。RNA剪接的順序取決于前體RNA的結(jié)構(gòu)及其與相應(yīng)酶特異性位點(diǎn)的結(jié)合順序。前體RNA與內(nèi)切酶結(jié)合并進(jìn)行剪切后，暴露出新的與內(nèi)、外切酶相應(yīng)結(jié)合的位點(diǎn)，逐步完成RNA的剪接過程（圖1-A所示）；當(dāng)處于應(yīng)激狀態(tài)或者遭遇環(huán)境壓力時(shí)，通常細(xì)菌體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生sRNA。這些sRNA能夠與Hfq結(jié)合形成sRNA-Hfq復(fù)合體，通過與靶mRNA配對(duì)調(diào)控其降解過程［7］。sRNA介導(dǎo)的mRNA降解有兩種機(jī)制：第一，sRNA-Hfq復(fù)合體能夠識(shí)別并結(jié)合翻譯起始區(qū)域附近的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ribosome-binding site，RBS），阻止核糖體30S亞基與mRNA結(jié)合進(jìn)而抑制翻譯進(jìn)行。未能與核糖體進(jìn)行配對(duì)的mRNA成裸露狀態(tài)，被核糖核酸內(nèi)切酶和外切酶迅速識(shí)別、剪切和降解，以實(shí)現(xiàn)核苷酸的更新循環(huán)利用（圖1-B左分支所示）；第二，通過sRNA與mRNA編碼區(qū)直接堿基配對(duì)，使sRNA-Hfq復(fù)合體與mRNA結(jié)合，這一結(jié)合信號(hào)能夠促使包含RNase E在內(nèi)的多種內(nèi)切酶對(duì)mRNA進(jìn)行切割，隨后含RNase II在內(nèi)多種外切酶將mRNA徹底降解為核苷酸（圖1-B右分支）；同樣，核糖核酸內(nèi)/外切酶能共同參與RNA的降解（圖1-C）：大腸桿菌mRNA的降解途徑中，初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的焦磷酸鹽首先被移除，5′三磷酸RNA轉(zhuǎn)化為單磷酸RNA，隨后以RNase E為主的核糖核酸內(nèi)切酶將RNA 切割成為單磷酸RNA片段，這些片段的產(chǎn)生能夠進(jìn)一步促進(jìn)RNase E進(jìn)行內(nèi)切，同時(shí)也成為外切酶PNPase、RNase II或者RNase R的產(chǎn)物［2］。隨后，被外切酶切割后產(chǎn)生的RNA碎片（短鏈核苷酸）被Oligo RNase降解成為核苷酸，被機(jī)體重復(fù)利用。

圖1 大腸桿菌體內(nèi)RNase參與的RNA剪接與降解過程Fig.1 RNase-dependent RNA processing and degradation in Escherichia coli

RNase不僅對(duì)于體內(nèi)RNA的種類、數(shù)量及分布起著重要的調(diào)節(jié)作用，也可以非特異性地降解RNA。因此，如果不對(duì)RNase的活性及數(shù)量加以正確調(diào)控，有可能對(duì)具有重要功能的RNA分子進(jìn)行不必要的降解，進(jìn)而影響細(xì)菌代謝平衡，甚至造成死亡。所以，細(xì)菌進(jìn)化出多種方式對(duì)其進(jìn)行精確的修飾與調(diào)控。通過調(diào)節(jié)，不僅可以使細(xì)菌快速適應(yīng)不同的外界環(huán)境，還可避免其對(duì)正常RNA分子進(jìn)行錯(cuò)誤降解。目前已知對(duì)RNase的調(diào)控機(jī)制包括轉(zhuǎn)錄后修飾、酶蛋白翻譯后修飾（post-translational modification，PTM）、反式作用因子及小RNA調(diào)節(jié)等（表1）。RNase在體內(nèi)參與眾多重要生理活動(dòng)，目前對(duì)其研究多集中于RNase在基因工程等領(lǐng)域的運(yùn)用，但對(duì)大腸桿菌體內(nèi)自身調(diào)控機(jī)制的系統(tǒng)性的研究并不多見，本文將對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）內(nèi)已知RNase的生理功能及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)性總結(jié)，對(duì)已知調(diào)控方式中出現(xiàn)的爭(zhēng)議模型進(jìn)行探討。

表1 大腸桿菌RNase種類及其調(diào)控機(jī)制Table 1 Properties and regulations of RNases in Escherichia coli

1 核糖核酸內(nèi)切酶

1.1 核糖核酸酶E

核糖核酸酶E（RNase E）是廣泛存在于細(xì)菌體內(nèi)的RNA降解酶［40］。E. coli中，RNase E參與多種代謝：參與16S與5S rRNA的成熟、tRNA和sRNA的剪接加工及mRNA降解的起始階段［23-41］。RNase E可在饑餓等極端條件下參與rRNA的降解［42］；同時(shí)，在錯(cuò)誤組裝或有缺陷rRNA的降解過程中參與其質(zhì)控（RNA quality control）［43］。在體內(nèi)，RNase E過量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致具有正常功能的RNA發(fā)生過度降解，而表達(dá)量不足則會(huì)導(dǎo)致大量未加工的RNA前體蓄積［16］，無法進(jìn)行下游生理過程。

RNase E目前已知多種調(diào)控機(jī)制。首先，RNase E可通過調(diào)節(jié)其自身信使RNA rne（rne mRNA）的量以實(shí)現(xiàn)自我調(diào)控（圖2-A）。當(dāng)體內(nèi)RNase E表達(dá)量超過所需水平時(shí)，此酶可降解自身mRNA（rne mRNA）從而抑制蛋白過表達(dá)［44］。這種對(duì)自身mRNA降解的調(diào)節(jié)機(jī)制可有效地減少RNase E的超表達(dá)，從而避免對(duì)體內(nèi)其它重要RNA分子進(jìn)行無端地降解。與此相反，若體內(nèi)RNase E含量低于正常水平的10%-20%，細(xì)菌生長也受到嚴(yán)重影響［45］。rne mRNA的多聚腺苷酸化（polyadenylation）可避免其被過度降解［46］，從而確保體內(nèi)RNase E維持正常水平。但多聚腺苷酸化對(duì)RNase E調(diào)節(jié)的發(fā)生機(jī)制仍有待研究。其次，蛋白質(zhì)的PTM也可參與E. coli RNase E酶活性的調(diào)控（圖2-B）。E. coli感染T7噬菌體后表達(dá)的相關(guān)蛋白激酶能夠?qū)Nase E蛋白的C′末端磷酸化，抑制酶活性，從而保護(hù)T7噬菌體的mRNA不被降解［44］。第三，RNase E對(duì)不同mRNA的降解過程也可以受sRNA調(diào)控（圖2-C），sRNA對(duì)RNase E活性的調(diào)節(jié)往往存在于環(huán)境營養(yǎng)缺乏的條件下［47］，其機(jī)制目前有兩種模型：一種是sRNA與RNA伴侶蛋白Hfq形成復(fù)合物調(diào)節(jié)RNase E的活性；另一種則是sRNA-Hfq復(fù)合物與目的mRNA結(jié)合，使目的mRNA更易被以RNase E為主的降解體（degradsome）降解［40］。例如，在長期缺乏氮源的E. coli中，sRNA介導(dǎo)的Hfq與以RNase E為主體的降解體結(jié)合，共同調(diào)控RNA的降解過程［48］。第四，RraA、RraB和核糖體蛋白L4均可在C末端與RNase E結(jié)合，調(diào)節(jié)其活性［49-50］（圖2-D）。在細(xì)菌遭遇饑餓、氧化應(yīng)激等極端環(huán)境時(shí)，調(diào)節(jié)蛋白可迅速調(diào)節(jié)RNase E的活性以使細(xì)胞快速響應(yīng)環(huán)境變化［17］。但RraA和RraB對(duì)其調(diào)控的研究還停留在體外階段，在體內(nèi)是否也能發(fā)揮作用目前暫無報(bào)道；核糖體蛋白L4則能與RNase E蛋白C末端催化結(jié)構(gòu)域之外的位點(diǎn)結(jié)合，在體外抑制RNase E的活性［49］。第五，作為細(xì)菌體內(nèi)降解體的核心組成部分，RNase E的胞內(nèi)定位也對(duì)活性有一定影響［40］（圖2-E）。RNase E在細(xì)菌內(nèi)膜上處于游離或附著狀態(tài)對(duì)其蛋白的穩(wěn)定性及功能都有影響；如果將RNase E內(nèi)膜附著位點(diǎn)進(jìn)行突變移除，不僅會(huì)導(dǎo)致其在體內(nèi)不穩(wěn)定，也會(huì)降低體內(nèi)mRNA的整體降解速度［18］。此外，細(xì)菌體內(nèi)的一些酶及小分子代謝產(chǎn)物也能夠調(diào)節(jié)RNase E（圖2-F）。例如，細(xì)菌細(xì)胞膜肽聚糖和脂多糖的前體化合物——氨基葡萄糖-6-磷酸能夠有效抑制RNase E的活性［19］；肽聚糖水解酶家族中的酰胺酶C（Amidase C）通過增強(qiáng)酶蛋白結(jié)構(gòu)的多聚化從而影響RNase E的活性［20］。同樣，環(huán)境中添加抗生素如利福平能夠通過調(diào)節(jié)RNase E、PNPase及RNase R的活性影響體內(nèi)rRNA的含量，但其調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究［21］。

圖2 大腸桿菌RNase E調(diào)控機(jī)制Fig.2 Regulation mechanisms of RNase E in E. coli

1.2 核糖核酸酶 III

核糖核酸酶 III（RNase III）是廣泛存在于生物體內(nèi)的雙鏈RNA特異性內(nèi)切酶［51］。RNase III在17S和23S前體rRNA分別成熟為16S、23S rRNA的加工過程中起重要作用。由于RNase III對(duì)底物選擇有雙鏈特異性，它能夠?qū)RNA前體中的雙鏈降解，將16S及23S rRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄物加工成更短的中間產(chǎn)物［52］。對(duì)于E. coli來說，敲除RNase III并不具致命性，但缺失該酶的細(xì)胞內(nèi)會(huì)聚集大量30S rRNA前體及剪接異常的 23S rRNA 片段［10，53］。同時(shí)，RNase III也參與E. coli的基因表達(dá)調(diào)控，特別是mRNA的轉(zhuǎn)化再利用［54］。此外，RNase III也與噬菌體RNA、質(zhì)粒RNA及某些tRNA在細(xì)菌體內(nèi)的代謝相關(guān)［55-56］。而RNase III在大腸桿菌體內(nèi)活性調(diào)節(jié)主要與細(xì)菌進(jìn)入穩(wěn)定期營養(yǎng)缺乏、溫度及滲透壓改變、抗生素壓力等有關(guān)［11］。

目前對(duì)RNase III酶活性調(diào)節(jié)研究最深入的是自調(diào)控機(jī)制。RNase III可進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的自我調(diào)節(jié)。當(dāng)E. coli體內(nèi)RNase III表達(dá)量高于所需水平時(shí)，其可將編碼自身rnc mRNA的5′-UTR進(jìn)行裂解，使自身mRNA更易被其它RNase迅速降解，進(jìn)而抑制自身蛋白的表達(dá)。同樣，RNase III的活性也受PTM調(diào)節(jié)。大腸桿菌在感染T7噬菌體后，T7噬菌體蛋白激酶能夠抑制RNase E活性的同時(shí)增強(qiáng)RNase III的活性［44］；噬菌體蛋白激酶能夠?qū)Nase III上的絲氨酸位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化修飾，使RNase III酶活性升高3至4倍，揭示T7噬菌體蛋白激酶引起的磷酸化可能與增強(qiáng)噬菌體感染有關(guān)［12］。但非噬菌體感染的細(xì)胞內(nèi)是否存在此調(diào)節(jié)方式目前仍未知。

RNase III也受某些小分子蛋白的調(diào)控。YmdB是E. coli內(nèi)高度保守的小分子蛋白，當(dāng)E. coli處于低溫或進(jìn)入穩(wěn)定期生長后能夠誘導(dǎo)YmdB大量表達(dá)［2］。但只有在低溫情況下大量表達(dá)的YmdB能通過與RNase III催化中心相結(jié)合而抑制其活性，也能通過影響RNase III二聚體形成而影響其功能（圖 3）［57］。Paudyal等［58］利用計(jì)算機(jī)技術(shù)模擬了YmdB-RNase III相互作用的結(jié)構(gòu)，YmdB第40位精氨酸能夠與RNase III亞基表面的氨基酸殘基相結(jié)合，可能通過此方式影響RNase III的活性。

圖3 YmdB影響大腸桿菌RNase Ⅲ活性Fig.3 Activity of RNase Ⅲ mediated by YmdB in E. coli

此外，細(xì)胞滲透壓的改變［59］、外界氨基糖苷類抗生素壓力［60］、氧分壓的變化［11］等均可調(diào)節(jié)RNase III活性，但具體機(jī)制仍待明確。

1.3 核糖核酸酶BN

核糖核酸酶BN（RNase BN）屬于RNase Z核糖核酸酶超家族。不同于其它生物，E. coli RNase BN同時(shí)具有外切和內(nèi)切核糖核酸酶的活性，具有能夠水解雙（對(duì)硝基苯基）磷酸酯和胸腺嘧啶-5′-對(duì)硝基苯磷酸酯的磷酸二酯酶活性［61］。RNase BN能夠作用的RNA底物種類非常少。目前研究最詳細(xì)的是RNase BN參與3′端缺乏CCA序列的tRNA前體的加工過程［41］。此外，E. coli RNase BN能夠在體外降解已經(jīng)被RNase E剪切之后的rpsT mRNA［14］。RNase BN能夠調(diào)控sRNA的含量；同樣，sRNA也可對(duì)RNase BN進(jìn)行調(diào)節(jié)；如6S RNA通過與含有σ70的 RNA聚合酶全酶相結(jié)合而抑制該酶活性。RNase BN能直接作用于6S RNA；對(duì)數(shù)生長期，RNase BN通過降低6S RNA的穩(wěn)定性以降低其在體內(nèi)的含量；反之，穩(wěn)定生長期RNase BN含量降低，6S RNA 體內(nèi)水平升高［15，62］。盡管對(duì)于 RNase BN的功能已有上述報(bào)道，但體內(nèi)敲除RNase BN對(duì)細(xì)菌生長并沒有致命影響?；騬nb的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對(duì)體內(nèi)pH較為敏感，因此在酸性環(huán)境脅迫下，RNase BN酶蛋白含量會(huì)顯著降低［63］。

E. coli RNase BN由rbn基因編碼，目前已知調(diào)控主要針對(duì)rbn mRNA的穩(wěn)定性。RNase BN在體內(nèi)含量隨生長周期變化，穩(wěn)定期RNase BN及rbn mRNA水平同時(shí)降低。最新的研究發(fā)現(xiàn)小RNA GcvB和Hfq蛋白能夠共同保護(hù)rbn mRNA不被RNase E降解。在穩(wěn)定生長期，細(xì)菌體內(nèi)GcvB水平降低后削減了其對(duì)rbn mRNA的保護(hù)，使rbn mRNA更易被RNase E進(jìn)行剪切，從而降低穩(wěn)定期RNase BN的水平［8］。

1.4 核糖核酸酶 I

核糖核酸酶 I（RNase I）是主要存在于大腸桿菌周質(zhì)空間內(nèi)的較為活躍的內(nèi)切酶。自被發(fā)現(xiàn)以來，其生理學(xué)功能至今仍然是未解之謎。RNase I可降解所有形式的RNA分子，但更偏好于降解單鏈區(qū)域。最新研究表明RNase I還具有Ca2+強(qiáng)依賴性的雙鏈RNA酶切活性［64］。這種由Ca2+調(diào)控的單、雙鏈RNA酶切活性的轉(zhuǎn)換也許能夠使其成為RNA編輯實(shí)際應(yīng)用中的工具酶。

大腸桿菌RNase I天然缺失株或人工敲除株未表現(xiàn)出任何生理缺陷，RNA降解也不受任何影響［9］。RNase I編碼基因?yàn)閞na，其中可編碼一段23個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽，可引導(dǎo)RNase I蛋白轉(zhuǎn)移至周質(zhì)空間。最新的研究發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)的少部分（約10%）RNase I可能參與調(diào)節(jié)大腸桿菌生物膜的形成［65］，但周質(zhì)空間內(nèi)存在的90% RNase I的生理功能還需要進(jìn)一步探索。這一發(fā)現(xiàn)揭示出RNase I生理功能的調(diào)控可能與其在細(xì)胞內(nèi)的定位有關(guān)。

2 核糖核酸外切酶

2.1 核糖核酸酶R

核糖核酸酶R（RNase R）是廣泛存在于E. coli及其它生物中的3′-5′外切酶［13］，同時(shí)具有RNA解旋酶活性［66］。RNase R能降解具有空間結(jié)構(gòu)的RNA分子，如rRNA及tRNA［67］。RNase R對(duì)于RNA的質(zhì)控非常重要，參與降解有缺陷的RNA；同時(shí)，RNase R能夠加工或降解rRNA，如和YbeY共同作用參與 E. coli 16S rRNA 的 3′端的加工［25］。RNase R能夠?qū)μ囟╩RNA進(jìn)行降解，特別是對(duì)含有REP（repetitive extragenic palindromic）序列的mRNA進(jìn)行選擇性降解［68］。同時(shí)，RNase R能夠在分子伴侶Hfq的協(xié)助下參與核糖體的組裝、16S與23S rRNA前體的成熟以及rRNA的質(zhì)控過程（有害及錯(cuò)誤裝配 rRNA 的清除）［34］。

正常生長狀態(tài)下，大腸桿菌體內(nèi)RNase R蛋白不穩(wěn)定，平均半衰期約為10 min。當(dāng)外界條件壓力變化，如細(xì)菌遭遇冷激、高溫等，RNase R蛋白質(zhì)穩(wěn)定性會(huì)有所提升［68］，保證細(xì)菌適應(yīng)外界條件環(huán)境變化。

RNase R幾乎可以降解所有類型的RNA，如不進(jìn)行嚴(yán)格調(diào)控，會(huì)對(duì)細(xì)菌的正常生理功能造成極大的破壞。對(duì)于RNase R的調(diào)控，目前已知有2種方式：一種是PTM對(duì)蛋白穩(wěn)定性影響的調(diào)控機(jī)制；另一種是核糖體參與的調(diào)控。當(dāng)細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長期，體內(nèi)的乙?；D(zhuǎn)移酶能將RNase R蛋白第544位賴氨酸（K544）進(jìn)行乙酰化修飾，導(dǎo)致蛋白C末端無法再與K544結(jié)合。暴露出的C末端與tmRNA和SmpB結(jié)合形成復(fù)合物，HslUV或Lon等蛋白酶同時(shí)與RNase R的N末端及tmRNA-SmpB復(fù)合物相結(jié)合，啟動(dòng)對(duì)RNase R蛋白的降解［69］。當(dāng)遭遇環(huán)境壓力，體內(nèi)相應(yīng)缺乏乙?；笇?dǎo)致RNase R蛋白無法進(jìn)行修飾，不易被蛋白酶降解從而維持較高活性，體內(nèi)rRNA被大量降解，為其它生存代謝途徑提供原料［69］（圖4-A）。正常生長E. coli中80%的RNase R與核糖體結(jié)合，參與反式翻譯過程。當(dāng)細(xì)菌生長處于穩(wěn)定期后，體內(nèi)蛋白合成活動(dòng)減少，RNase R從核糖體上釋放成為游離態(tài)，將胞內(nèi)RNA大量降解（圖4-B）。但這一過程也會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害，故穩(wěn)定生長期RNase R蛋白極其不穩(wěn)定，平均半衰期約為2 min［35］。

圖4 大腸桿菌RNase R調(diào)控機(jī)制Fig.4 Regulation mechanisms of RNase R in E. coli

2.2 多核苷酸磷酸化酶

多核苷酸磷酸化酶（polynucleotide phosphorylase，PNPase）是E. coli內(nèi)高度保守的依賴單磷酸Pi作為親核試劑催化反應(yīng)的3′-5′核糖核酸外切酶。PNPase是一個(gè)雙向酶，既可降解RNA，又可以將核苷二磷酸前體合成為RNA［70］。因多功能性，其可參與體內(nèi)眾多RNA代謝反應(yīng)。PNPase協(xié)同RNase II及RNase R，共同參與體內(nèi)mRNA的降解。PNPase還能夠降解缺陷的tRNA前體、參與sRNAs的穩(wěn)定、多種RNA的成熟，例如16S rRNA 3′端的成熟、tRNA及sRNA的加工［71-73］。若PNPase表達(dá)量不足，細(xì)菌則表現(xiàn)出生物膜增多［74］，導(dǎo)致對(duì)抗生素敏感性增強(qiáng)，同時(shí)影響其應(yīng)激反應(yīng)［75］。此外，PNPase還可作為sRNA的伴侶，參與基因調(diào)控［27］。PNPase是大腸桿菌降解體的核心組成酶之一，轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)表明，PNPase是穩(wěn)定生長期大腸桿菌mRNA降解過程中發(fā)揮最主要作用的酶［28］。

PNPase由pnp基因編碼，其在體內(nèi)的表達(dá)由兩種不同啟動(dòng)子調(diào)控，生成長短不一的兩種mRNA：長鏈mRNA包含PNPase及其上游RpsO（核糖體S15亞基蛋白）的基因產(chǎn)物，短鏈mRNA僅編碼PNPase自身［56］。E. coli對(duì)體內(nèi) PNPase含量的調(diào)控存在多種機(jī)制，目前研究最詳細(xì)的是自我調(diào)控（圖5-A）。RNase III能夠?qū)?pnp mRNA 的 5′端莖環(huán)結(jié)構(gòu)剪切形成3′末端，PNPase隨即與此末端結(jié)合并啟動(dòng)降解；隨后RNase E將剩余pnp mRNA全部水解，降低PNPase蛋白表達(dá)量。在此過程中，sRNA結(jié)合蛋白CsrA能夠同時(shí)阻遏已經(jīng)被RNase III剪切過的pnp mRNA進(jìn)行進(jìn)一步翻譯，從而利于RNase E對(duì)其全部降解［29］。PNPase在體內(nèi)的含量也受環(huán)境溫度調(diào)節(jié)。當(dāng)E. coli處于冷激狀態(tài)，PNPase對(duì)自身mRNA的降解效率降低，酶蛋白表達(dá)量升高［46］。同樣，PNPase也受sRNA的調(diào)節(jié)（圖5-B）。sRNA SraG的過表達(dá)能夠抑制pnp表達(dá)的同時(shí)，也能夠降低pnp mRNA的穩(wěn)定性［30，76］。此外，三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物——檸檬酸鹽的胞內(nèi)含量也能夠調(diào)節(jié)PNPase的活性（圖5-C）。鎂離子螯合的檸檬酸鹽能夠與PNPase結(jié)合，封閉催化位點(diǎn)抑制其活性；而沒有金屬螯合的檸檬酸鹽則能通過與酶的殘留活性位點(diǎn)相互作用進(jìn)而充當(dāng)PNPase 的變構(gòu)激活劑［77］。檸檬酸鹽對(duì)PNPase 的調(diào)控廣泛存在于原核生物中，這種調(diào)控機(jī)制今后可能成為研究RNA調(diào)控與細(xì)胞能量代謝之間相互關(guān)系的突破點(diǎn)。

圖5 大腸桿菌PNPase調(diào)控機(jī)制Fig.5 Regulation mechanisms of PNPase in E. coli

2.3 核糖核酸酶 II

E. coli核糖核酸酶 II（RNase II）由rnb基因編碼，是體內(nèi)最活躍的3′-5′外切酶。RNase II能夠特異性剪切單鏈 RNA，特別是 poly（A）鏈［67，78］。mRNA的降解過程往往需要poly（A）尾存在。因RNase II能夠特異性移除poly（A），故而可以起到穩(wěn)定mRNA的作用［79］。對(duì)于rRNA來說，RNase II主要降解體內(nèi)23S rRNA的poly（A）尾［70］。RNase II也參與某些前體tRNA的成熟過程［22］。當(dāng)核糖體暫停工作后，RNase II也參與mRNA的降解過程，降解位點(diǎn)主要位于核糖體A位點(diǎn)下游序列［80］。

RNase II是E. coli體內(nèi)第一個(gè)被鑒定和純化的RNase［1］，距今已有五十多年歷史，但對(duì)其調(diào)控機(jī)制的報(bào)道仍不多。目前研究最詳盡的是通過PTM調(diào)控。RNase II第501位賴氨酸殘基發(fā)生乙?；揎椇竽軌蛞种圃撁傅拇呋钚裕?3］。當(dāng)處于穩(wěn)定生長期或遭遇其它緩慢生長條件時(shí)，RNase II蛋白的乙?；揎椝斤@著升高，RNase II酶活性明顯降低?？赡娴刭嚢彼嵋阴；揎椖軌蛘{(diào)節(jié)RNase II活性以使細(xì)菌盡快適應(yīng)不同環(huán)境條件。此外，第31、60和107位賴氨酸參與單鏈RNA的結(jié)合，這些位點(diǎn)的賴氨酸乙?；部赡苡绊慠Nase II與底物的結(jié)合進(jìn)而影響其酶活［2］。

此外，當(dāng)位于RNase II編碼基因rnb下游的gmr基因被敲除后，RNase II蛋白量和酶活性明顯升高；此種調(diào)控并非發(fā)生在rnb基因的 mRNA水平上，而是顯著增強(qiáng)了其蛋白的穩(wěn)定性［31］；但具體是通過何種方式進(jìn)行調(diào)控還有待探索。E. coli體內(nèi)，RNase II與PNPase、RNase R行使相似的生理功能。組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研究RNase功能提供了新的研究思路。對(duì)比RNase II與RNase R雙突變株與單突變株的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，在對(duì)數(shù)生長期，雙突變株產(chǎn)物與RNase R單突變株產(chǎn)物相似，而穩(wěn)定生長期的雙突變株轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物更接近與RNase II單突變株［81］。但細(xì)菌體內(nèi)RNase II與RNase R功能是如何相互替代的，其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。同樣，當(dāng)細(xì)胞缺乏PNPase時(shí)，RNase II的含量明顯升高；反之，PNPase的超表達(dá)可降低rnb mRNA和RNase II蛋白的體內(nèi)含量［32］。近來研究發(fā)現(xiàn)RNase II的活性還與其細(xì)胞定位相關(guān)。RNase II蛋白通過其N末端的兩親性螺旋結(jié)構(gòu)與細(xì)胞質(zhì)膜相結(jié)合，這種結(jié)合可能影響特定條件下RNase II的存在與細(xì)菌生存之間的關(guān)系［32］，但其生理意義仍不明確。

2.4 核糖核酸酶PH

核糖核酸酶PH（RNase PH）與PNPase屬同一家族，也為單磷酸Pi依賴型的E. coli外切酶，由rph基因編碼。RNase PH具有多種功能。首先，RNase PH能參與tRNA前體加工；且只有在Pi存在的前提下，RNase PH才可發(fā)揮降解功能。同PNPase相似，RNase PH也具有合成酶活性，可在RNA鏈的3′末端添加二磷酸核苷［8］。除tRNA外，RNase PH還可參與sRNA和穩(wěn)定RNA的3′末端成熟，參與16S rRNA的代謝，及16S、23S rRNA的成熟等［42，82-83］。體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)都發(fā)現(xiàn) RNase PH 與RNase E能夠通過特殊結(jié)構(gòu)域相互作用［36］，但其生理意義尚不明確。目前對(duì)RNase PH調(diào)控的研究較少。當(dāng)E. coli處于饑餓狀態(tài)，RNase II能夠在蛋白穩(wěn)定性層面對(duì)RNase PH進(jìn)行調(diào)控［37］；且RNase II自身酶活性對(duì)RNase PH的調(diào)控是必須的，這一調(diào)控可能與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)蛋白酶相關(guān)（待發(fā)表資料）。這是目前首次報(bào)道兩種核糖核酸酶之間能夠存在相互調(diào)控。

3 總結(jié)與展望

RNase在RNA代謝各方面都起著至關(guān)重要的作用，參與RNA的成熟、降解、轉(zhuǎn)化再利用及質(zhì)控等。如果RNase在體內(nèi)調(diào)節(jié)受阻，也會(huì)給細(xì)胞造成致命性傷害。所以，細(xì)菌需要進(jìn)化出相應(yīng)調(diào)控機(jī)制以調(diào)整體內(nèi)核糖核酸酶的酶活性及蛋白含量水平，適應(yīng)不同生理環(huán)境。由于RNase參與體內(nèi)諸多生理生化反應(yīng)，針對(duì)RNase的研究多集中于其對(duì)RNA的剪接及其應(yīng)用，對(duì)酶自身的調(diào)控的研究還并不完善。本文介紹了E. coli對(duì)其自身核糖核酸酸酶調(diào)控的研究現(xiàn)狀。目前對(duì)于模式生物大腸桿菌體內(nèi)RNase的種類報(bào)道已非常詳盡，已發(fā)現(xiàn)的15種RNase中，有一半以上的調(diào)控方式已被發(fā)現(xiàn)；其中除RNase I、RNase BN和RNase PH外，其余已知調(diào)控方式的RNase均存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及PTM調(diào)節(jié)，且PTM中乙?；揎椦芯枯^為透徹。在應(yīng)用研究中，RNase作為工具酶已經(jīng)成為新興熱點(diǎn)研究方向之一。例如，細(xì)菌RNase常作為分析真核細(xì)胞總RNA的工具之一：應(yīng)用E. coli RNase R對(duì)真核細(xì)胞中提取的總RNA樣品進(jìn)行降解時(shí)，產(chǎn)物可得到無線性RNA干擾的環(huán)狀RNA（circular RNA）等，便于構(gòu)建內(nèi)含子cDNA文庫；而乙?；揎椏烧{(diào)節(jié)RNase R活性，能否利用改變乙?；揎棾潭纫哉{(diào)控RNase作為工具酶的活性有待進(jìn)一步研究；通過調(diào)控Ca2+的濃度讓RNase I在不同環(huán)境中行使單雙鏈酶切功能也使其能夠成為有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的工具酶。同樣，盡管現(xiàn)如今轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)已經(jīng)趨于成熟，但對(duì)于不同RNase與其底物RNA一一對(duì)應(yīng)關(guān)系的研究仍是空白，能否利用組學(xué)等先進(jìn)技術(shù)手段揭示其對(duì)應(yīng)關(guān)系也是未來研究的方向之一。同樣，細(xì)胞如何保護(hù)RNA免受RNase的無差別“攻擊”、如何整體性調(diào)控RNase的水平和活性、體內(nèi)眾多RNase之間相互作用關(guān)系等研究，雖處于起步階段，但仍有其光明的發(fā)展前景。