吳豪杰, 施振華, 姚贊芳, 熊金丹

浙江新安國(guó)際醫(yī)院 1神經(jīng)外科，3急診科(浙江嘉興 314000)；2杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科(浙江杭州 310015)

顱腦損傷是常見(jiàn)的神經(jīng)外科重癥之一，具有發(fā)病率、致殘率和致死率高特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅患者生命健康[1-2]。早期診斷和治療對(duì)顱腦損傷患者預(yù)后改善尤為關(guān)鍵，不同病情程度顱腦損傷治療和預(yù)后差異較大。既往多采用格拉斯哥昏迷評(píng)分評(píng)估顱腦損傷的嚴(yán)重程度，缺乏客觀性、準(zhǔn)確性均較高的早期評(píng)估指標(biāo)[3]。研究報(bào)道顯示，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和中樞神經(jīng)特異性蛋白(S100B)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷重要標(biāo)志物，可用于評(píng)價(jià)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度[4-5]。微小RNA(miRNA)是長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸的一類(lèi)非編碼分子RNA，與多種疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是近年來(lái)臨床研究熱點(diǎn)[6]。因此，本研究探討顱腦損傷患者血清miRNA-124和miRNA-132與NSE和S100B蛋白表達(dá)與病情嚴(yán)重程度相關(guān)性，為診斷顱腦損傷及病情嚴(yán)重程度評(píng)估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇浙江新安國(guó)際醫(yī)院于2018年1月至2020年12月顱腦損傷患者112例作為觀察組，其中男79例，女33例；年齡21～75歲，平均(56.89±8.73)歲；致傷原因：交通事故64例，高墜墜傷32例，重物砸傷16例；依據(jù)格拉斯哥昏迷評(píng)分(GCS)分為輕中度組78例與重度組34例。另選擇浙江新安國(guó)際醫(yī)院于同期健康體檢者96例作為對(duì)照組，其中男62例，女34例；年齡20～72歲，平均(57.32±8.59)歲。各組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)浙江新安國(guó)際醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：2017-第34)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)顱腦CT或MRI證實(shí)為顱腦損傷；(2)臨床資料完整；(3)年齡≥18歲；(4)簽署知情同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)創(chuàng)傷前存在顱腦病變者；(2)合并顱內(nèi)感染、脊髓病變及腦缺血等疾??；(3)合并造血系統(tǒng)、自身免疫系統(tǒng)及惡性腫瘤者；(4)妊娠或哺乳期婦女；(5)嚴(yán)重精神疾病者。

1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：NSE試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)，S100B試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)，Trizol試劑(南京森貝伽生物科技有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)，qRT-PCR試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)，總RNA快速提取試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)。

主要儀器：實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(德國(guó)Roche公司)，伯樂(lè)iMark酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 血清miRNA-124和miRNA-132表達(dá) 采集受試者6 mL外周靜脈血，以10 cm離心半徑、3 000 r/min離心轉(zhuǎn)速，離心8 min，收集血清，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法測(cè)定血清miRNA-124和miRNA-132水平。采用Trizol試劑提取血清總RNA，取5 μL總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并檢測(cè)總RNA的純度和完整度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)要求將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以U6作為內(nèi)參基因，檢測(cè)miRNA-124和miRNA-132 mRNA表達(dá)水平。總反應(yīng)體系20 μL：SYBER GREEN 6.8 μL、PCR forward primer 0.4 μL、DYE I 0.4 μL、PCR reverse primer 0.4 μL、cDNA 2.0 μL、RNase-free H2O 10 μL，混勻，置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s、60℃退火1 min，延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用2-ΔΔCt法(Ct為循環(huán)值)計(jì)算miRNA-124和miRNA-132 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 血清NSE和S100B水平測(cè)定 采集受試者6 mL外周靜脈血，以10 cm離心半徑、3 000 r/min離心轉(zhuǎn)速，離心8 min，收集血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清NSE和S100B水平，嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定。

1.4 觀察指標(biāo) (1)觀察各組血清miRNA-124和miRNA-132 mRNA表達(dá)；(2)觀察各組血清NSE和S100B表達(dá)；(3)分析miRNA-124、miRNA-132、NSE和S100B對(duì)顱腦損傷預(yù)測(cè)價(jià)值；(4)分析miRNA-124、miRNA-132、NSE和S100B與病情嚴(yán)重程度相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 各組血清miRNA-124和miRNA-132 mRNA表達(dá)比較 輕中度組和重度組血清miRNA-124 mRNA表達(dá)高于對(duì)照組，而血清miRNA-132 mRNA表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)；重度組血清miRNA-124 mRNA表達(dá)高于輕中度組，而血清miRNA-132 mRNA表達(dá)低于輕中度組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組血清miRNA-124和miRNA-132 mRNA表達(dá)比較

2.2 各組血清NSE和S100B水平比較 輕中度組和重度組血清NSE和S100B水平高于對(duì)照組(P<0.05)；重度組血清NSE和S100B水平高于輕中度組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組血清NSE和S100B水平比較

2.3 miRNA-124、miRNA-132、NSE和S100B對(duì)顱腦損傷預(yù)測(cè)價(jià)值 經(jīng)ROC曲線分析，miRNA-124對(duì)顱腦損傷診斷敏感度為75.44%，特異度為43.64%；miRNA-132對(duì)顱腦損傷診斷敏感度為67.86%，特異度為35.71%；NSE對(duì)顱腦損傷診斷敏感度為86.76%，特異度為65.91%；S100B對(duì)顱腦損傷診斷敏感度為79.22%，特異度為62.86%。見(jiàn)表3。

表3 分析miRNA-124、miRNA-132、NSE和S100B對(duì)顱腦損傷預(yù)測(cè)價(jià)值

圖1 miRNA-124、miRNA-132、NSE和S100B對(duì)顱腦損傷預(yù)測(cè)價(jià)值

2.4 miRNA-124、miRNA-132、NSE和S100B與病情嚴(yán)重程度相關(guān)性 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，miRNA-124、NSE和S100B與重度顱腦損傷呈線性正相關(guān)，而miRNA-132與重度顱腦損傷呈線性負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 分析miRNA-124、miRNA-132、NSE和S100B與病情嚴(yán)重程度相關(guān)性

3 討論

顱腦損傷主要是由于腦組織原發(fā)或繼發(fā)性損傷造成顱內(nèi)高壓，導(dǎo)致腦灌注、腦組織代謝的持續(xù)惡化，若不采取及時(shí)有效的治療，則會(huì)導(dǎo)致患者預(yù)后不佳[7-10]。血清學(xué)作為簡(jiǎn)單和敏感的一種檢測(cè)手段，對(duì)診斷顱腦損傷具有較高臨床價(jià)值。

NSE屬一種神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的蛋白酶，當(dāng)出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞損傷后，從而會(huì)使得損傷的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)釋放出呈游離狀態(tài)的NSE，進(jìn)入腦脊液中，再跨越血腦屏障進(jìn)入外周血循環(huán)，而造成血液及腦脊液中NSE水平升高[11]。張豐等[12]研究發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷患者入院72 h血清NSE持續(xù)增高，且與腦死亡診斷呈正相關(guān)，及對(duì)腦死亡具有更高的診斷價(jià)值。由此可見(jiàn)，NSE作為神經(jīng)元細(xì)胞損害的一種標(biāo)志物，其敏感度和特異度較高。本研究表明，輕中度組和重度組血清NSE水平高于對(duì)照組且重度組高于輕中度組，由此可見(jiàn)顱腦損傷患者血清NSE水平升高，且隨著病情加重升高越明顯，分析其原因可能是由于腦損傷后的顱內(nèi)壓增高、腦水腫導(dǎo)致腦內(nèi)血循環(huán)受阻，血腦屏障和腦血流量減少的進(jìn)一步破壞，繼發(fā)腦損傷，而導(dǎo)致NSE活性升高，且隨著患者病情加重NSE水平升高越明顯。S100B主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的Schwann細(xì)胞。當(dāng)神經(jīng)組織受損時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞分泌大量S100B蛋白[13]。隨著S100B蛋白水平升高，可增加一氧化氮合成酶的弧形，且促進(jìn)一氧化氮分泌，從而造成細(xì)胞因子激活更多星形膠質(zhì)細(xì)胞和小細(xì)胞，激活核轉(zhuǎn)錄因子分泌細(xì)胞因子而導(dǎo)致炎性反應(yīng)[14]。通常S100B不能任意通過(guò)血腦屏障，而當(dāng)發(fā)生腦部損傷時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致血腦屏障被破壞，并且腦脊液內(nèi)S100B蛋白穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入血液中，而導(dǎo)致血液中S100B水平升高。梁炯芳等[15]學(xué)者研究表明，納入105例顱腦損傷患者，其中重度顱腦損傷、中度顱腦損傷和輕度顱腦損傷患者S100B蛋白水平高于健康體檢者，且呈劑量依賴(lài)性，可反映急性顱腦損傷患者病情進(jìn)展。本研究表明，輕中度組和重度組血清S100B水平高于對(duì)照組且重度組高于輕中度組，由此可見(jiàn)顱腦損傷患者血清S100B水平升高，且隨著病情加重升高越明顯。

miRNA可通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡、分化及增殖等細(xì)胞行為發(fā)揮調(diào)控作用。某些miRNA在神經(jīng)保護(hù)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)展等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在外周血中與顱腦損傷發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性[16]。miRNA-124過(guò)渡激活可能造成促炎因子的爆發(fā)性釋放，過(guò)度活化免疫細(xì)胞，且miRNA-124作用于Treg細(xì)胞，從而參與免疫抑制。程永紅等[17]的研究報(bào)道顯示，中重度顱腦損傷并發(fā)腦梗死患者血清miRNA-124表達(dá)高于對(duì)照組，且病情越重升高表達(dá)越高。miRNA-132被證實(shí)能夠靶向抑制乙酰膽堿酯酶的活性和表達(dá)，提高乙酰膽堿水平及其抗炎作用，在樹(shù)突狀細(xì)胞的起源、突出形成及腦組織發(fā)育中發(fā)揮重要作用[18]。本研究表明，輕中度組和重度組血清miRNA-124 mRNA表達(dá)高于對(duì)照組而血清miRNA-132 mRNA表達(dá)低于對(duì)照組，重度組血清miRNA-124 mRNA表達(dá)高于輕中度組而血清miRNA-132 mRNA表達(dá)低于輕中度組，由此可見(jiàn)顱腦損傷患者血清miRNA-124呈高表達(dá)而miRNA-132呈低表達(dá)，但其具體作用機(jī)制尚未完全闡明。

綜上所述，顱腦損傷患者血清miRNA-124、NSE和S100B呈高表達(dá)，而miRNA-132呈低表達(dá)，且與患者病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，具有重要臨床研究?jī)r(jià)值。本研究還存在一些局限之處，樣本量小，觀察指標(biāo)少，還需后續(xù)增加樣本量和觀察指標(biāo)做多中心、多樣本深入研究，提供可靠臨床參考依據(jù)。

利益相關(guān)聲明：所有作者聲明均無(wú)任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：研究設(shè)計(jì)為吳豪杰；研究實(shí)施為施振華；資料收集為姚贊芳；論文撰寫(xiě)為吳豪杰；論文修訂為熊金丹；審校為施振華。