楊萬勇, 馬麗, 任家駿, 楊旭東△

1東莞市水鄉(xiāng)中心醫(yī)院檢驗科(廣東東莞 523130); 2西安交通大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系(陜西西安 710061)

支氣管哮喘是一種過敏性氣道炎癥性疾病，氣道炎癥進而導致哮喘患者氣道高反應性，引發(fā)氣道通氣障礙，哮喘長期反復發(fā)作會導致氣道重塑[1]。呼吸道上皮細胞是機體和外部環(huán)境之間的屏障，是機體抵抗病原微生物、有害氣體和過敏原侵害的第一道防線[2]。近來許多研究發(fā)現(xiàn)，上皮細胞在哮喘發(fā)病進程中發(fā)揮了重要的作用，它可通過分泌多種細胞因子啟動并加強氣道炎癥，并導致氣道高反應性[3]。蛋白質精氨酸甲基轉移酶1(PRMT1)是Ⅰ型的蛋白質精氨酸甲基轉移酶(PRMTs)家族的成員，它可以催化蛋白質精氨酸殘基發(fā)生非對稱二甲基化修飾[4]，這是一種調節(jié)蛋白質功能的重要方式。根據(jù)我們課題組的前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，在卵清蛋白誘導的E3大鼠急性哮喘模型(AIPI)中，肺上皮PRMT1 的表達明顯升高，白細胞介素-4(IL-4)可以上調肺上皮細胞中PRMT1的表達水平。這些都提示PRMT1與哮喘氣道炎癥的發(fā)生密切相關[4]。但是在哮喘發(fā)病的進程中，PRMT1是如何發(fā)揮作用的，它修飾的下游靶分子有哪些尚不清楚。為了闡明PRMT1在哮喘中的作用，2018年1月至2021年3月我們采用免疫沉淀的方法對肺上皮細胞中PRMT1修飾的靶蛋白進行了篩選，并對篩選出的對氧磷酶-2(PON2)的甲基化修飾做了進一步的驗證。

1 材料與方法

1.1 材料 卵清白蛋白(OVA)(美國Sigma公司)、KAl(SO4)2·12H2O(美國Sigma公司)、小鼠IgE檢測試劑盒(上海西塘生物)、RevertAcid 第一鏈 cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher Scientific, USA)、2×SYBR? Prime mix(Roche)、ECL 發(fā)光液(BIO-RAD)、重組人IL-4(易飛生物)、兔抗PRMT1 多克隆抗體(英國Abcam 公司)、兔抗PON 2 多克隆抗體(英國Abcam 公司)、兔抗不對稱精氨酸甲基化多克隆抗體(英國Abcam 公司)、兔同型IgG(英國Abcam 公司)、兔抗 β-actin 單克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)、鼠抗GAPDH多克隆抗體(Santa)、MS023(MCE)、Protein A+G磁珠(碧云天生物技術有限公司)、銀染試劑盒(碧云天生物技術有限公司)。

本研究已獲西安交通大學倫理委員會審批(審批號為2017-693)。

1.2 篩選在IL-4刺激下發(fā)生精氨酸非對稱性二甲基化修飾的蛋白 A549 細胞購于上海中科院細胞庫，用含10% FBS的1640培養(yǎng)基，在37℃,5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。把細胞種于10 cm的平皿，用50 ng/μL IL-4的刺激A549細胞24 h，用中等強度的RIPA細胞裂解液在冰上裂解細胞，提取總蛋白；對照組的細胞用PBS刺激24 h提取總蛋白。用BCA試劑盒測定樣品的濃度。

用Protein A+G磁珠吸附同型兔IgG后，與3 mg新鮮的蛋白樣品混合，去除非特異性結合的蛋白，分離上清溶液。隨后用Protein A+G磁珠吸附抗不對稱精氨酸甲基化多克隆抗體，與去除了非特異性結合蛋白后的蛋白樣品混合，在搖床上4℃孵育過夜。棄掉上清液，用PBS清洗磁珠。加入SDS-PAGE上樣緩沖液，并在95℃加熱5 min，以洗脫磁珠結合的蛋白和抗體。把洗脫的上清液保存在-80℃冰箱備用。

制作中型變性梯度聚丙烯酰胺凝膠，濃度梯度的范圍為5%～20%。把從磁珠上洗脫的蛋白在中型變性梯度聚丙烯酰胺凝膠上電泳。電泳結束后，用銀染法對凝膠進行染色，顯示電泳的條帶。割取對照樣品泳道與IL-4刺激樣品泳道的差異性條帶。用胰酶進行膠內(nèi)酶解20 h，隨后抽提酶解肽段進行ESI質譜鑒定。

1.3 PON2精氨酸甲基化修飾的水平的驗證 把A549細胞接種到6孔板培養(yǎng)，分為2種不同的處理組：IL-4刺激組和對照組。用50 ng/μL IL-4的刺激24 h，對照孔用PBS刺激細胞。用RIPA裂解細胞，提取蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。從對照樣品及IL-4處理樣品中各取400 μg，用免疫沉淀法檢測PON2的甲基化。具體過程如下：把抗PON2的抗體與蛋白樣品混合，在4℃緩慢搖動過夜，用兔IgG做同型對照；把孵育好的樣品與Protein A+G磁珠混勻，在室溫孵育1 h；用PBST洗滌磁珠3次后，用SDS電泳上樣緩沖液洗脫磁珠捕獲的蛋白，用抗精氨酸非對稱性二級甲基化修飾的抗體做Western blot，檢測PON2的甲基化修飾水平。

1.4 IL-4對PON2和PRMT1表達的影響 把A549細胞接種到6孔板培養(yǎng)，分析PON2和PRMT1表達對IL-4的濃度依賴性。分別用0、25、50、100、200 ng/mL的IL-4刺激細胞，刺激24 h后，用RIPA裂解細胞，提取蛋白。用BCA法測定蛋白濃度。用Western blot檢測PON2和PRMT1的表達水平，用GADPH做內(nèi)參。

并且用50 ng/mL的IL-4分別刺激細胞0、6、12、24、48 h，用RIPA裂解細胞，提取蛋白。用BCA法測定蛋白濃度。用Western blot檢測PON2和PRMT1的表達水平，用GADPH做內(nèi)參，分析PON2和PRMT1表達對IL-4的時間依賴性。

1.5 分析PON2與PRMT1的相互作用 把A549細胞接種到6孔板培養(yǎng)，分為2種不同的處理組：IL-4刺激組和對照組。用50 ng/μL IL-4的刺激24 h，對照孔用PBS刺激細胞。用RIPA裂解細胞，提取蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。從對照樣品及IL-4處理樣品中各取400 μg，用免疫共沉淀法檢測PON2與PRMT1的相互作用。把抗PRMT1的抗體與蛋白樣品混合，在4℃緩慢搖動過夜，用兔IgG做同型對照；把孵育好的樣品與Protein A+G磁珠混勻，在室溫孵育1 h；用PBST洗滌磁珠3次后，用SDS電泳上樣緩沖液洗脫磁珠捕獲的蛋白，用抗PON2的抗體做western blotting，檢測沉淀下來的PON2的水平。

進而用PRMT1抑制劑MS023處理細胞，檢測PON2的甲基化水平。把A549細胞接種到6孔板培養(yǎng)，分為3種不同的處理組：IL-4刺激組、對照組、IL-4+MS023組和MS023組。用50 ng/μL IL-4的刺激24 h，對照孔用PBS刺激細胞，MS023的終濃度為4.76 μmol/mL。用RIPA裂解細胞，提取蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。從對照樣品及IL-4處理樣品中各取400 μg。用免疫沉淀法檢測PON2甲基化的水平，用抗精氨酸非對稱性二級甲基化修飾的抗體做western blotting，檢測PON2的甲基化修飾水平。具體方法同1.3。

1.6 急性哮喘模型的誘導 24只7～8周的雌性Balb/c小鼠，均購自西安交通大學動物實驗中心。適應1周，自由攝取水食，晝/夜12 h循環(huán)燈光。飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在(25±3)℃，相對濕度維持在(40±5)%。1周后隨機分為對照組和哮喘模型組。

在第0天，給哮喘模型組小鼠腹腔注射卵清蛋白-氫氧化鋁混懸液[0.1% OVA，5% Al(OH)3]0.1 mL進行致敏；在第7天再次注射卵清蛋白-氫氧化鋁混懸液以加強免疫。給對照組小鼠腹腔注射等量PBS。在第14 天開始哮喘組小鼠用40μL 2.5 mg/mL OVA 溶液滴鼻，1次/d，連續(xù)7 d，對照組小鼠用PBS滴鼻。在第21天拔眼取血處死小鼠，分離血清備用。分離出完整的肺連同氣管，用1 mL PBS進行肺泡灌洗，共灌洗3次，1 000 r/min離心10 min，分離肺泡灌洗液中的細胞，300 μL的PBS懸浮細胞。吸取30 μL細胞懸液涂到載玻片上制備肺泡灌洗液涂片，等涂片干燥后用甲醇固定細胞。分離出左肺第三葉，用4%多聚甲醛固后，在石蠟中包埋。剩余的肺組織用液氮速凍后保存到-80℃冰箱。

用吉姆薩染液對細胞涂片進行染色，檢測肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞的水平。石蠟切片用HE染色，觀察肺組織的病理改變。用PON2抗體做免疫組化檢測肺組織中PON2表達的組織細胞類型。用ELISA法檢測小鼠血清中總IgE的水平。

用RIPA裂解肺組織，提取組織蛋白，用western blotting檢測肺組織中PON2和PRMT1的表達水平。

1.7 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，采用Mann Whitney檢驗分析進行兩兩比較。采用One way ANOVA中的Newman-Keuls 多組檢驗來進行多組比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計意義。所有統(tǒng)計采用統(tǒng)計軟件 GraphPad Prism5完成。

2 結果

2.1 質譜篩查結果顯示PON2精氨酸殘基可發(fā)生非對稱性二甲基化修飾 分別從IL-4刺激的A549細胞以及對照組細胞中提取蛋白質，用免疫沉淀法捕獲其中發(fā)生了精氨酸殘基非對稱性二甲基化修飾的蛋白，并采用變性梯度聚丙烯酰胺膠來顯示甲基化水平發(fā)生改變的蛋白。經(jīng)銀染后顯示，在40 KD左右的位置，在IL-4處理組的泳道有2個差異明顯的條帶(圖1-A)。我們割取了這兩個差異比較明顯的蛋白條帶，進行ESI質譜鑒定。第一個膠條，蛋白的分子量范圍約為40 KD；第二個膠條蛋白的分子量范圍約為35 KD。第一個膠條的質譜圖顯示有一個較強的質譜峰(圖1-B)。對獲得多肽序列進行評價，以Delta CN(≥0.1)和具備恰當cross-correlation scores的序列為鑒定成功的序列，又從中選擇肽段數(shù)≥2的肽段來做搜庫。最終獲得159個候選蛋白。第二個膠條的質譜圖也顯示有一個較強的質譜峰(圖1-C)，搜庫后找到152個候選蛋白。

注：A：變性梯度聚丙烯酰胺電泳顯示抗甲基化抗體免疫性沉淀捕獲的蛋白；B：在45 KD處的差異性條帶的質譜分析圖；C：在35 KD處的差異性條帶的質譜分析圖

PON2為第一個膠條所篩選出的159個蛋白中之一。Polonikov等[5]在采用關聯(lián)分析及多因素維數(shù)降維分析等方法分析抗氧化酶的基因多態(tài)性與成人哮喘發(fā)病的相關性時，發(fā)現(xiàn)PON2可能是哮喘的易感基因。因此，我們選擇PON2作為進一步研究的對象。

2.2 IL-4可以促進PON2發(fā)生非對稱性二甲基化修飾 為了進一步驗證質譜分析的結果，我們采用免疫沉淀的方法檢測了IL-4刺激的肺上皮細胞株A549中PON2的非對稱性二甲基化修飾水平。發(fā)現(xiàn)IL-4刺激可導致肺上皮細胞株中PON2的甲基化非對稱性二甲基化修飾水平升高(圖2)。

圖2 免疫沉淀顯示 IL-4上調A549細胞中PON2的甲基化水平

2.3 IL-4上調PRMT1的表達，但不改變PON2的表達水平 PRMT1是催化蛋白質發(fā)生精氨酸殘基非對稱性甲基化的酶。為了進一步闡明IL-4促進PON2甲基化水平升高的機制，我們分析了不同的IL-4劑量，以及刺激不同的時間對PRMT1和PON2表達水平的影響。結果顯示，隨IL-4濃度的升高，PRMT1的蛋白水平不斷升高，但是PON2的蛋白水平不會隨IL-4濃度的升高而改變(圖3-A)；在不同濃度IL-4刺激下PRMT1和PON2的相對表達見表1。同時在IL-4刺激12 h時，PRMT1的蛋白水平開始顯著升高，隨著IL-4刺激時間的延長，PRMT1的水平會繼續(xù)升高；隨著IL-4刺激時間從0～48 h，PON2的蛋白水平均無明顯的變化(圖3-B)；在IL-4刺激不同時間后PRMT1和PON2的相對表達見表2。由此可以得出結論，IL-4對PRMT1的表達水平的影響呈時間依賴性和劑量依賴性，但是對PON2的表達水平無顯著的影響。

表1 IL-4刺激24 h后PRMT1和PON2的相對表達

表2 50 ng/mL IL-4刺激不同時間后PRMT1和PON2的相對表達

注：A：隨IL-4濃度從0～200 ng/mL不斷升高，PRMT1的蛋白水平升高，而PON2的表達水平不變；B：隨IL-4濃度從0～200 ng/mL不斷升高，PRMT1蛋白的相對表達水平升高

2.4 PON2為PRMT1的底物分子 為了驗證PON2是PRMT1的底物蛋白，我們通過免疫共沉淀(Co-IP)實驗來檢測PRMT1和PON2 的相互作用。Co-IP實驗結果表明，用抗PON2 抗體沉淀后，再用抗PRMT1 抗體進行Western blotting 檢測，可以發(fā)現(xiàn)IL-4 刺激組PRMT1的水平顯著高于對照組(圖4-A)。這說明PON2與PRMT1在細胞內(nèi)有相互作用，并且隨著IL-4刺激，與PON2結合的PRMT1增多。這說明PON2為PRMT1的底物蛋白。因為IL-4不會上調PON2的表達水平，所以我們可以確定是因為PRMT1的表達升高，所以有更多的PON2被PRMT1所識別和結合，從而提高了PON2的甲基化水平。為了進一步驗證這一結論，我們使用了Ⅰ型PRMT的抑制劑MS023，可以看到IL-4可以上調PON2蛋白精氨酸殘基非對稱性二甲基化水平，但是當PRMT1的活性被抑制后，IL-4上調PON2甲基化的效應立即減弱了(圖4-B)。這進一步說明PON2是PRMT1的底物蛋白。

注：A：用抗PON2抗體做免疫共沉淀，可以拉下PRMT1蛋白，這說明PON2與PRMT1相結合。并且IL-4處理組PRMT1與PON2的結合增強。B：用免疫沉淀法檢測PON2蛋白的甲基化修飾水平，IL-4可增強PON2蛋白的甲基化修飾水平，但當MS023抑制PRMT1活性后，IL-4對PON2蛋白甲基化修飾的促進作用也削弱了

2.5 小鼠哮喘模型氣道上皮細胞中PON2的表達水平無明顯變化 為了了解哮喘動物模型中PON2的表達情況，我們誘導了小鼠的急性哮喘模型。我們哮喘組和對照組小鼠的肺組織切片進行了HE染色：和對照組相比，哮喘模型組小鼠在氣道壁周圍均有大量炎癥細胞浸潤(圖5)。與對照組相比，哮喘模型組小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞的比例顯著升高(P<0.01)。并且，哮喘模型組血清中總IgE水平也顯著高于對照組(P<0.01)，見表3。這些都說明急性哮喘模型誘導成功。

表3 肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞的水平及血清總IgE的水平

注：A：對照組小鼠肺組織的組織圖片；B：哮喘模型組小鼠肺組織的組織圖片

隨后，我們檢測了小鼠肺組織中PON2的表達。我們發(fā)現(xiàn)，小鼠肺組織中PON2主要表達于氣道上皮細胞(圖6-A、B)；并且與對照組相比，哮喘模型組小鼠的PON2的表達水平無明顯變化，但是PRMT1的表達水平顯著升高(圖6-C)。這與細胞模型相吻合。見表4。由此，我們推測在哮喘發(fā)生過程中，PON2的精氨酸殘基非對稱性二甲基化修飾水平應該與細胞模型中所觀察的一樣，會顯著升高。

表4 小鼠哮喘模型肺組織PRMT1和PON2的相對表達

注：A：對照組小鼠肺組織PON2主要在氣道上皮細胞中表達;B：哮喘模型組小鼠肺組織中PON2主要在氣道上皮細胞中表達；C：與對照組相比，哮喘模型組小鼠PRMT1的表達水平顯著升高，PON2的表達水平無明顯變化

3 討論

在本研究中，我們篩選了肺上皮細胞中PRMT1的底物蛋白，并發(fā)現(xiàn)PON2為PRMT1的底物蛋白，IL-4可以促進PON2發(fā)生非對稱性的二甲基化修飾。

氣道上皮是隔絕機體內(nèi)環(huán)境與外界環(huán)境的屏障[6]，并且可通過分泌多種細胞因子等多種細胞因子來調介導先天性免疫和繼發(fā)性免疫，在維持維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面具有重要的意義。而哮喘的發(fā)生、發(fā)展與氣道上皮損傷有密切關系[7-8]。一般認為，哮喘導致的氣道上皮損傷與氧化應激以及內(nèi)質網(wǎng)應激有密切的關系。哮喘可導致肺組織中氧化-抗氧化平衡的破壞[9-11]，造成氧化應激。氧化應激可導致支氣管上皮損傷[12-14]。同時，與氣道過敏性炎癥有密切關系的IL-4可通過誘導氣道上皮細胞發(fā)生氧化應激，進而導致氣道上皮損傷[15]。氧化應激造成的脂質過氧化會向氣道招募的炎癥細胞促進TGF-β和VEGF釋放，進一步增強氣道炎癥，并引發(fā)氣道重塑[16]。而且ROS的積累不僅破壞細胞結構，還可激活線粒體凋亡通路，造成氣道上皮細胞過度凋亡[17-19]。因此，抗氧化也成為哮喘治療的一個重要研究方向。

PON2是對氧磷酶家族中最古老的成員，它在多種組織細胞中廣泛表達，并且分布于細胞膜、胞漿、內(nèi)質網(wǎng)、線粒體和胞核等多個亞細胞部位。PON2具有鈣依賴的內(nèi)酯、酶、芳基酯酶活性和抗氧化活性[20]，在抗病原菌感染發(fā)揮重要的作用[21]；同時它也是抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分[22]，可保護線粒體免受氧化應激的損傷，并減少氧化應激誘導的凋亡[23]；PON2還表現(xiàn)出抗內(nèi)質網(wǎng)應激的能力[24]。Polonikov等[5]在采用關聯(lián)分析及多因素維數(shù)降維分析等方法分析抗氧化酶的基因多態(tài)性與成人哮喘發(fā)病的相關性時，發(fā)現(xiàn)PON2可能是哮喘的易感基因。在從PON2表現(xiàn)出的抗氧化和抗內(nèi)質網(wǎng)應激能力來看，它對細胞有保護性的作用。通過我們的實驗顯示，在小鼠哮喘模型中，PON2主要表達于氣道上皮細胞，并且與對照組相比，小鼠哮喘模型肺組織中PON2的表達水平無明顯的改變。結合在哮喘發(fā)生過程中氣道上皮會發(fā)生氧化應激和內(nèi)質網(wǎng)應激這一情況來看，在PON2蛋白表達水平不變的情況下，它的保護功能應該是通過蛋白的修飾，或活性調節(jié)等方式來進行調整，以適應生理狀態(tài)的變化。

在篩選肺上皮細胞中PRMT1底物時，我們發(fā)現(xiàn)PON2為PRMT1底物，可發(fā)生精氨酸非對稱的二甲基化修飾，并且IL-4可促進PON2發(fā)生非對稱的二甲基化修飾，但是不改變PON2的蛋白表達水平。我們前期的工作已證實PRMT1在哮喘發(fā)生中起重要作用，IL-4可以上調肺上皮細胞中PRMT1表達[4]，隨著PRMT1的升高可促使上皮細胞產(chǎn)生趨化因子[5]，改變miRNA的表達譜[25]。在氣道上皮細胞中，PRMT1發(fā)揮作用的機制尚不清楚。而且有研究顯示，ROS可促進PRMT1活性的升高[26]。蛋白質的精氨酸殘基發(fā)生非對稱的二甲基化修飾通常會改變蛋白的功能，PON2已被證實可發(fā)生泛素化以及谷胱甘肽化等修飾形式，而且這些修飾也會改變PON2的功能。因此，PRMT1催化PON2發(fā)生非對稱的二甲基化修飾很可能也改變PON2的抗氧化及抗內(nèi)質網(wǎng)應激活性，從而參與哮喘的發(fā)病過程中去。

在本研究中，我們確定了PON2是PRMT1的底物蛋白，并且在IL-4刺激下其精氨酸殘基可發(fā)生非對稱性的二甲基化修飾。這為我們理解PRMT1參與哮喘氣道上皮炎癥發(fā)生的過程提供了一個新的視角，也為我們理解哮喘發(fā)病過程中氧化-抗氧化失衡的機制提供了一個新的研究方向。

利益相關聲明：文章所有作者共同認可文章無相關利益沖突。

作者貢獻說明：研究設計為楊旭東，研究方案執(zhí)行與實施為楊萬勇、馬麗、任家駿，數(shù)據(jù)整理為馬麗，統(tǒng)計撰寫論文為楊萬勇，論文審閱為楊旭東。