張玉揚, 趙津平, 張丹, 翟振華△

錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 1腫瘤科，2腫瘤血管與微環(huán)境實驗室(遼寧錦州 121000)；3遼寧省健康產業(yè)集團撫礦總醫(yī)院婦科(遼寧撫順 113008)

胃癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，早期發(fā)病隱匿，缺乏有效診斷指標，大多患者確診時往往已是中晚期，已出現遠處轉移癥狀，具有高死亡率且預后差等特點[1-2]。目前，臨床主要采用手術、放化療等手段治療胃癌且取得了一定進展，但患者5年生存率仍無明顯提高[3]。因此，進一步深入探索胃癌發(fā)病相關機制，探索有效治療靶點對于提高胃癌治療效果改善患者預后有重要意義。著絲粒蛋白(centromere protein，CENP)是有絲分裂階段染色體分離的主要成分，其中CENP-N是CENP的主要成員之一，可以募集其他CENPs及著絲粒，進一步與微管之間形成鏈接，促進細胞分裂[3-4]。Zhai等[5]研究顯示，CENP-N在乳腺癌組織中異常高表達，參與腫瘤進展。孟慶彬等[6]研究顯示，CENP-H在胃癌組織中異常高表達且與腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移有關。目前有關CENP-N在胃癌中的相關研究鮮有報道，因此本研究主要探討CENP-N對胃癌細胞增殖、凋亡等的影響，并分析相關機制，以期為尋找胃癌新型有效治療靶標提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 在2017年7月至2019年7月期間，從本院收集了143例胃癌患者癌組織及其癌旁組織，并將組織樣本保存在-80℃冰箱中。研究得到了本院倫理委員會的批準(20170406)，所有患者均簽署了書面知情同意書。人胃癌細胞系HS-746T(貨號：YS354C)及人胃黏膜細胞GES1(貨號：CL1317)人胃癌細胞株SNU-1(bio-73415)、HS-746T(YS354C)、AGS(FS-0173)、MGC-803(ml-cs-0276)及人胃黏膜細胞GES1(CL1317)均購自北京百歐博偉生物技術有限公司。

RPMI-1640培養(yǎng)基(CDLG-3719)購自武漢純度生物科技有限公司；CCK-8試劑盒(CA1210-500T)、AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒(HUDY03)均購自上海碧云天公司；Hoechst33342熒光染料(B8040)購自北京索萊寶科技有限公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒(L2000-015)購自杭州沃森生物技術有限公司；CENP-N-siRNA及無關序列siRNA-NC由上海吉瑪生物科技有限公司設計合成；BCA試劑盒(批號2763DB)、蛋白提取試劑盒(BC3710-100T)購自上海吉至生化科技有限公司；兔抗CENP-N(D285-3)、細胞增殖相關核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)(100130-MM21)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)(FNab00839)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)(2774)、磷脂肌醇3-激酶(phosphati-dylinositol 3-kinase，PI3K)(PL0402037)、p-PI3K(3154-100)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)(ATA24502)、p-AKT(F48643-0.4ML)、p-mTOR(IC194464)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)(ATA33361)、p-mTOR(IC194464)、β-actin(ATA40114)、山羊抗兔HRP(SE12-0.1)二抗均購自北京索萊寶科技有限公司。

CO2培養(yǎng)箱(型號CCL-050A-8)購自日本Esco公司；Elx800酶標儀(型號HSG9832)購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息數據庫分析 利用基因表達譜交互式分析網站(GEPIA，http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html)中的癌癥基因組圖譜(TCGA)數據分析CENP-N基因在胃癌組織和癌旁組織中的表達水平，其中胃癌組織503例，癌旁組織125例。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 取SNU-1、HS-746T、AGS、MGC-803、GES1細胞解凍、復蘇，于含10%滅活胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)+RPMI-1640培養(yǎng)液、37℃、5% CO2、95% O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d左右更換1次培養(yǎng)液，無菌操作，待細胞穩(wěn)定傳代后，取對數生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞分組及處理 取1.2.2對數生長期的SNU-1細胞接種于24孔板(2.5×104個/孔)。采用LipofectamineTM2000對細胞進行轉染，先用無血清培養(yǎng)液將LipofectamineTM2000稀釋并配制siRNA-NC、CENP-N-siRNA(均為10 mmol/L)，后將等體積LipofectamineTM2000分別與siRNA-NC、CENP-N-siRNA混勻、靜置，分別加入SW620細胞中，作為siRNA-NC組(陰性對照組)、CENP-N-siRNA組(沉默CENP-N表達組)；同時設置未轉染細胞的空白對照組，以及轉染CENP-N-siRNA后，加入含PI3K通路激活劑740Y-P(100 μg/mL)[7]的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞的通路激活劑組。繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度，每組設置6個復孔，實驗重復3次。

1.2.4 實時熒光定量PCR法檢測CENP-N mRNA表達水平 按照試劑盒說明書提取各組SNU-1細胞中總RNA并測定濃度及純度；以RNA為模板行逆轉錄反應，所得cDNA進行實時熒光定量PCR反應。體系20 μL：ULtraSYBR mixture(10 μL)、模板cDNA(2.0 μL)、上下游引物(各2.0 μL)、去離子純化水(4.0 μL)；條件(40個循環(huán))：93℃ 30 s、93℃ 5 s、65℃ 30 s。引物序列見表1，由赫澎(上海)生物科技有限公司設計并合成，以β-actin為內參，以2-ΔΔCt法計算CENP-N mRNA含量。

表1 引物設計

1.2.5 CCK-8法檢測細胞增殖情況 取1.2.3各組培養(yǎng)48 h的SNU-1細胞經胰酶消化，接種至24孔板(2.5×104個/孔)，嚴格按照CCK-8試劑試劑盒說明書分別于培養(yǎng)48 h后加入CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，檢測490 nm處各孔細胞光密度(optic density，OD)值，重復3次，取平均值。計算細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%。

1.2.6 平板克隆實驗檢測各組SNU-1細胞克隆形成率 取1.2.3各組培養(yǎng)48 h后的SNU-1細胞，消化并接種于6孔板(300個細胞/孔)，每組6個復孔，于37℃、5% CO2、95% O2條件下培養(yǎng)15 d，加入4%多聚甲醛固定30 min，0.25%結晶紫染色30 min；棄掉染液，晾干，拍照并計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?%)=克隆形成數/接種細胞數×100%。

分組:分別噴1.0、0.6、0.3 mL 3個劑量復合溶葡萄球菌酶溶液試驗組、消毒劑對照組和空白對照組,消毒劑對照組選用苯扎溴銨溶液(1∶600 稀釋)。

1.2.7 Hoechst33342染色法檢測各組SNU-1細胞凋亡形態(tài)學變化 取1.2.3各組培養(yǎng)48 h的SNU-1細胞，消化并接種于6孔板(1×106個/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入4%多聚甲醛(pH=7.5)，37℃固定30 min，PBS沖洗、晾干，加入Hoechst33342染液(5 mg/mL)，染色30 min，PBS沖洗、封片，熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.8 流式細胞儀檢測各組SNU-1細胞凋亡率 取1.2.3各組培養(yǎng)48 h的SNU-1細胞接種于24孔板(2.5×105個/孔)，參照Annexin-V FITC/PI試劑盒說明書，以5 μL PI+5 μL AnnexinV-FITC雙染試劑4℃避光進行染色30 min，稀釋；用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組設6個復孔，重復3次。

1.2.9 免疫印跡法檢測增殖、凋亡及PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達情況 取1.2.3各組培養(yǎng)48 h的SNU-1細胞，以RIPA裂解并提取總蛋白，檢測濃度及純度，行12%SDS-PAGE電泳，轉膜，放入脫脂奶粉(5%)溶液室溫封閉2 h，分別加入一抗增殖相關蛋白(PCNA)、凋亡相關蛋白(Bcl-2、Bax)、PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白和CENP-N蛋白(p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、CENP-N)、內參β-actin，均為1∶500的稀釋比，4℃過夜，加入HRP標記山羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，顯影、定影，半定量分析各蛋白含量。

2 結果

2.1 生物信息數據庫分析結果 利用GEPIA網站得到CENP-N mRNA在503例胃癌組織和125例癌旁組織中的表達情況，結果顯示，CENP-N在胃癌組織、癌旁組織中的表達分別為4.25±0.36、1.45±0.21，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 CENP-N在胃癌組織中的表達水平 與癌旁組織比較，胃癌組織中CENP-N mRNA及蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖1和表2。

圖1 Western blot檢測胃癌組織中CENP-N蛋白表達水平

表2 在胃癌組織中CENP-N mRNA及蛋白的表達水平

2.3 CENP-N在不同胃癌系中的表達 與GES1細胞比較，CENP-N mRNA在胃癌SNU-1、HS-746T、AGS、MGC-803細胞中的表達水平顯著升高(P<0.05)，且CENP-N mRNA在SNU-1細胞中的表達水平最高。因此，選擇SNU-1細胞進行后續(xù)實驗研究，見表3。

表3 CENP-N在不同胃癌系中的mRNA表達水平

圖2 細胞轉染效果(×100)

表4 CENP-N mRNA水平比較

2.5 各組SNU-1細胞增殖情況比較 與空白對照組、siRNA-NC組比較，CENP-N-siRNA組SNU-1細胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)；與CENP-N-siRNA組比較，通路激活劑組SNU-1細胞增殖抑制率顯著降低(P<0.05)。見表5。

表5 各組細胞增殖情況比較

2.6 各組SNU-1細胞平板克隆結果比較 與空白對照組、siRNA-NC組比較，CENP-N-siRNA組SNU-1細胞克隆形成率顯著降低(P<0.05)；與CENP-N-siRNA組比較，通路激活劑組SNU-1細胞克隆形成率顯著升高(P<0.05)。見圖3及表6。

圖3 各組SNU-1細胞平板克隆結果比較

表6 各組SNU-1細胞平板克隆結果比較

2.7 各組SNU-1細胞形態(tài)學變化 Hoechst33342染色結果顯示，空白對照組、siRNA-NC組SNU-1細胞呈圓形或橢圓形，核完整、形態(tài)飽滿，邊緣清晰，染色呈均勻彌漫的淺色熒光，未見亮藍色細胞核；CENP-N-siRNA組SNU-1細胞細胞數減少，核皺縮破裂，胞核或胞質內有濃縮致密的藍色熒光，呈細胞凋亡形態(tài)，當加入通路激活劑后，細胞此種形態(tài)變化有明顯改善。見圖4。

圖4 各組SNU-1細胞形態(tài)學變化(×400)

2.8 各組SNU-1細胞凋亡情況比較 與空白對照組、siRNA-NC組比較，CENP-N-siRNA組SNU-1細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與CENP-N-siRNA組比較，通路激活劑組SNU-1細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖5及表7。

表7 各組SNU-1細胞凋亡情況比較

圖5 各組SNU-1細胞凋亡情況比較

2.9 各組SNU-1細胞增殖、凋亡相關蛋白表達比較 與空白對照組、siRNA-NC組比較，CENP-N-siRNA組SNU-1細胞增殖相關蛋白PCNA、抑凋亡相關蛋白Bcl-2表達顯著降低(P<0.05)，促凋亡相關蛋白Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與CENP-N-siRNA組比較，通路激活劑組SNU-1細胞PCNA、Bcl-2表達顯著升高(P<0.05)，Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖6及表8。

表8 各組細胞增殖、凋亡相關蛋白表達比較

圖6 各組細胞增殖、凋亡相關蛋白表達比較

2.10 各組SNU-1細胞PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達比較 與空白對照組、siRNA-NC組比較，CENP-N-siRNA組SNU-1細胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表達顯著降低(P<0.05)；與CENP-N-siRNA組比較，通路激活劑組SNU-1細胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表達顯著升高(P<0.05)。見圖7及表9。

圖7 各組SNU-1細胞PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達比較

表9 各組SNU-1細胞PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達比較

3 討論

胃癌是胃黏膜上皮細胞惡性腫瘤，發(fā)病早期癥狀不典型，大多患者于中晚期才得以確診，隨著醫(yī)療水平的不斷提高，胃癌診療方法也得到有效提升，主要包括手術輔以放化療或聯合治療等，但是患者5年生存率仍居于30%左右[8]。因此深入探索胃癌發(fā)生發(fā)展相關機制，尋找新型生物學靶標以提高胃癌治療效果具有重要的意義。

CENP-N是線粒體蛋白，不僅能夠募集其他CENPs及著絲粒，與有絲分裂紡錘體微管之間形成鏈接，推動染色體分離，還能夠識別著絲粒核小體中的著絲粒特異性組蛋白CENP-A，實現線粒體和著絲粒染色質正確組裝，進而促進腫瘤細胞分裂及增殖[9-10]。在CENP中，CENP-A高表達的乳腺癌患者預后更差，整體生存期更短[11]；CENP-A mRNA和蛋白在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達明顯高于正常組織，其表達與腫瘤體積大小、淋巴轉移有關[12]。而關于CENP-N在腫瘤中的研究較少，僅僅有研究報道CENP-N在口腔鱗狀細胞癌組織中異常高表達，且下調其表達后可明顯阻滯細胞周期進展并抑制細胞增殖[13]。本研究利用GEPIA網站中的TCGA數據以及收集的143例胃癌患者癌組織及其癌旁組織，發(fā)現CENP-N mRNA及蛋白表達水平顯著高于癌旁組織；還發(fā)現CENP-N mRNA在SNU-1、HS-746T、AGS、MGC-803胃癌細胞中的表達水平顯著高于人胃黏膜細胞GES1，且CENP-N mRNA在SNU-1細胞中的表達水平最高，因此，以胃癌SNU-1細胞為研究對象，探究CENP-N對SNU-1細胞增殖、凋亡的影響，并分析相關機制。本研究利用倒置熒光顯微鏡可觀察到CENP-N-siRNA組細胞有較強綠色熒光，且CENP-N-siRNA組SNU-1細胞CENP-N mRNA水平顯著低于空白對照組及siRNA-NC組，說明細胞轉染成功。腫瘤細胞增殖及凋亡失衡是腫瘤進展最主要的因素，其中PCNA是細胞增殖核抗原，能夠識別細胞周期，反應細胞增殖活性；Bax、Bcl-2是最主要的凋亡相關蛋白，分別具有促凋亡、抑凋亡作用[14]。Hoechst33342可透過細胞膜，與DNA結合而發(fā)出藍色熒光，用以檢測細胞凋亡[15]。本研究結果顯示，抑制CENP-N表達后，SNU-1細胞呈明顯的細胞凋亡形態(tài)，且增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表達顯著升高，PCNA、Bcl-2蛋白表達顯著降低。提示抑制CENP-N表達可抑制胃癌SNU-1細胞增殖并誘導細胞凋亡。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是細胞內重要轉導途徑之一，其異?；罨c宮頸癌[16]、胃癌[17]等腫瘤發(fā)生發(fā)展有關。其中PI3K是通路的起始因子，其活化后產生第二信使PIP3，進一步磷酸化下游Akt蛋白的Thr308位點，促使Akt活化，而活化的Akt磷酸化并激活下游靶基因mTOR并促使mTOR發(fā)生磷酸化反應，調控下游基因轉錄及表達，進而促進細胞生長，抑制細胞凋亡[18-19]。既往研究顯示，過表達C型凝集素結構域家族5成員A可通過活化PI3K/AKT/mTOR信號通路促進胃癌細胞增殖[20]；FGFC1可以抑制非小細胞肺癌細胞的增殖活性，并促進細胞凋亡，該機制與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路活化有關[21]。本研究結果顯示，抑制CENP-N表達后，SNU-1細胞p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達顯著降低。當在轉染CENP-N-siRNA基礎上加入通路激活劑后，細胞增殖能力增強、細胞凋亡能力減弱。提示沉默CENP-N表達可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路活化抑制SNU-1細胞增殖并誘導細胞凋亡。

綜上所述，沉默CENP-N表達可抑制胃癌SNU-1細胞增殖并誘導細胞凋亡，該機制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路活化有關，可能是胃癌新型生物治療的靶標。但本研究未能明確PI3K/AKT/mTOR通路在SNU-1細胞增殖、凋亡中的具體作用機制，后期仍需進一步研究。

利益相關聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻說明：翟振華：主持研究，質量控制；張玉揚：課題設計、文獻檢索、論文撰寫；趙津平：實驗室實驗、數據統(tǒng)計、實驗試劑、細胞等準備；張丹：文獻檢索、論文撰寫。