王瑩瓊, 陳建歐, 應(yīng)曉媚, 李小菲, 林鵬

1溫州市中醫(yī)院病理科(浙江溫州 325000)；2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科(浙江溫州 325000)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌80%～85%，在我國肺癌病死率占據(jù)首位，大部分患者一旦確診已經(jīng)處于晚期，主要是因為癌癥病灶對患者周圍血管浸潤，導(dǎo)致遠處轉(zhuǎn)移，錯過最佳的治療時間，目前臨床中主要采用放療、化療進行治療，大部分患者預(yù)后較差[1-2]。因此及早對NSCLC診斷，對患者來說至關(guān)重要。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)屬于抑制細胞表面免疫球蛋白，維持正常組織結(jié)構(gòu)和功能，參與婦科惡性腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲過程[3]。熱休克蛋白90(heat shock protein,Hsp90)具有高度保守性，有助于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、激素應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程中至關(guān)重要，調(diào)節(jié)腫瘤凋亡、增殖等，Hsp90AB1是Hsp90的一種亞型，組成性表達，在細胞長期適應(yīng)性中至關(guān)重要[4-5]。硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)屬于一種抑癌基因，在多種惡性腫瘤中顯示低表達，能抑制細胞增殖，促進凋亡，參與細胞周期介導(dǎo)的細胞增殖、抑制過程[6]。目前臨床中缺少關(guān)于RAGE、Hsp90AB1、TXNIP三者在NSCLC中的研究。因此，本文旨在研究RAGE、Hsp90AB1、TXNIP在NSCLC患者中的表達及與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取病理科2020年5月至2021年5月行肺癌根治術(shù)切除的NSCLC 55例標本(NSCLC組)，男35例，女20例，年齡30～75歲，選取同時期病理科保存的正常組織標本36例(正常組)，男20例，女16例，年齡30～78歲，兩組研究對象一般資料比較，見表1。

表1 兩組研究對象一般資料比較

納入標準：所有NSCLC患者均經(jīng)過病理、影像學(xué)確診；均符合中華醫(yī)學(xué)會制定的關(guān)于NSCLC的診斷標準[7]；無化療、放療治療患者；本文研究患者及其家屬均知情，簽署知情通知書，經(jīng)過我院倫理委員會批準(2020XL0407)。

排除標準：進行化療、放療、免疫等治療者；伴有其他惡性腫瘤者；伴傳染性疾病者；精神異常者。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色 將保存的NSCLC病理組織厚度切片3 μm，80℃烘烤50 min，進行二甲苯脫蠟處理，使用遞減梯度酒精脫二甲苯脫；在3%過氧化氫中孵育10 min，將組織中內(nèi)源性過氧化物酶活性清除干凈，之后采用蒸餾水清洗干凈，PBS溶液浸潤5 min，在微波爐中將0.01 mol/L的枸櫞酸鈉緩沖液加熱至沸騰后將各組組織切片置入其中，給予抗原修復(fù)15 min，室溫靜置4 min，再次采用PBS溶液連續(xù)沖洗3次，5 min/次，滴加50 μL的一抗(RAGE(廠家：北京翹神州科技股份有限公司，貨號203765-T08)、Hsp90AB1(廠家：上?？泼羯锟萍加邢薰荆浱朒00003326-D01P)1∶80工作液)，4℃過夜保存。PBS連續(xù)沖洗3次，每次持續(xù)5 min；滴加羊抗鼠二抗，室溫孵育10 min；再次采用PBS沖洗，DAB顯色5 min，蒸餾水再次沖洗。最后蘇木色復(fù)染、封片，顯微鏡觀察RAGE、Hsp90AB1陽性表達。

免疫組化結(jié)果判定：采用雙盲法，由我院經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生對免疫組化染色進行評估。根據(jù)染色數(shù)目判定[8]：0%為0分，1%～33%為1分，34%～66%為2分，67%～100%為3分。染色強度判定：0分表示無著色，1分表示淡黃色弱陽性，2分表示淺棕色中等陽性，3分表示棕褐色強陽性。以染色數(shù)目和染色強度為依據(jù)，低表達表示0～2分，高表達3～6分。

1.2.2 TXNIP基因表達檢測 將NSCLC病理組織、正常組織標本置入玻璃勻漿器中，滴加5～10 mL的PBS溶液，進行充分研磨，在冰上進行，得到的勻漿通過超聲破碎進行反復(fù)凍融后，置入離心機中，5 000×g離心處理5 min，提取上清液，采用實時熒光定量PCR檢測：將采集到的100 μL組織上清液標本加300 μL Trizol震蕩混勻靜置10 min，加80 μL氯仿再次震蕩混勻靜置5 min，離心后凝膠離心至管底，加100 μL DEPC水。將標本混合液15 000 r/min，離心處理15 min。提取上清至液轉(zhuǎn)移到含糖原EP管中，加等體積預(yù)冷異丙醇，混勻，-20℃靜置2 h。提取白色沉淀加1 mL的75%乙醇，混勻后充分洗滌RNA沉淀，4℃ 7 500×g，離心處理5 min，摒棄上清液。加80 μL DEPC水對RNA沉淀進行溶解，-80℃保存。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaqMan? miRNA Reverse Transcription Kit)逆轉(zhuǎn)成cDNA，嚴格按照操作說明書進行操作。采用THUNDERBIRD qPCR Mix PCR試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測，采用2-ΔΔCT法對TXNIP基因表達水平分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象RAGE、Hsp90AB1、TXNIP表達比較 NSCLC RAGE陽性表達為32.73%(18/55)，Hsp90AB1陽性表達為54.55%(30/55)。正常組RAGE陽性、TXNIP基因表達高于NSCLC組鱗癌、腺癌，Hsp90AB1陽性表達低于NSCLC組鱗癌、腺癌(P<0.05)。NSCLC患者鱗癌、腺癌RAGE、Hsp90AB1陽性及TXNIP基因表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組RAGE、Hsp90AB1、TXNIP表達比較 例(%)

RAGE在NSCLC組織細胞膜、細胞漿中顯示棕黃色顆粒；Hsp90AB1在NSCLC組織細胞漿中顯示棕黃色，彌漫分布。見圖1。

注：A:正常組Hsp90AB1;B:鱗癌Hsp90AB1;C:腺癌Hsp90AB1;D:正常組RAGE;E:鱗癌RAGE;F:腺癌RAGE

2.2 RAGE、Hsp90AB1、TXNIP表達與NSCLC患者臨床病理的關(guān)系 RAGE、Hsp90AB1、TXNIP表達與NSCLC患者性別、腫瘤大小、年齡無關(guān)(P>0.05)。RAGE、Hsp90AB1、TXNIP表達與NSCLC患者組織分化程度、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)：其中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ～Ⅳ期患者Hsp90AB1陽性表達高于中-高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅰ～Ⅱ期患者，低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ～Ⅳ期患者RAGE陽性、TXNIP基因表達低于中-高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)。見表3。

表3 RAGE、Hsp90AB1、TXNIP表達與NSCLC患者臨床病理的關(guān)系 例(%)

2.3 RAGE、Hsp90AB1、TXNIP表達與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性 RAGE陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)(r=-0.289，P=0.012)，Hsp90AB1陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(r=0.385，P=0.002)，TXNIP基因表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)(r=-4.112，P=0.001)。

2.4 RAGE、Hsp90AB1、TXNIP對NSCLC的診斷價值 RAGE、Hsp90AB1、TXNIP三者聯(lián)合對NSCLC診斷敏感度、準確度高于三項單一檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 RAGE、Hsp90AB1、TXNIP對NSCLC的診斷價值

3 討論

研究顯示，肺癌發(fā)病與癌細胞氧化還原平衡失調(diào)有關(guān)，受氧化應(yīng)激，導(dǎo)致肺癌細胞快速增殖，持續(xù)刺激引起信號通路中信號傳遞過程受影響，細胞代謝紊亂[8-9]。TXNIP是氧化還原調(diào)節(jié)者，通過與硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)結(jié)合，促進Trx表達下調(diào)，起到抑制Trx清除活性氧的作用[10]。通過逆轉(zhuǎn)錄TXNIP，轉(zhuǎn)染黑色素細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞凋亡與TXNIP有關(guān)，能促進黑色素細胞凋亡，抑制腫瘤生長[11]。在乳腺癌細胞中，TXNIP通過與β連環(huán)蛋白結(jié)合，參與腫瘤發(fā)展過程[12]。以上研究證實，TXNIP參與多種腫瘤發(fā)生，在腫瘤中表達降低。本文研究結(jié)果顯示，TXNIP基因在NSCLC患者中顯示低表達，其表達水平的高低與患者組織分化程度、有淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)。提示TXNIP基因參與NSCLC患者臨床病理發(fā)展過程，直接影響腫瘤進展，以及患者預(yù)后。分析TXNIP基因參與NSCLC的作用機制：TXNIP作為Trx的內(nèi)源性抑制因子，通過與Trx結(jié)合，Trx表達水平下降，與凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)蛋白配體結(jié)合，降低Trx-1抗凋亡能力，參與癌癥發(fā)生[13]。

RAGE主要存在于肺組織細胞膜上，屬于一種受體黏附分子，參與肺泡分化過程，維持正常肺泡形態(tài)[14]。已經(jīng)有研究證實，RAGE水平下降會對正常肺組織形態(tài)產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致肺部腫瘤發(fā)生，與細胞分化、凋亡有關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，RAGE在NSCLC中表達降低，其中低分化、有淋巴轉(zhuǎn)移、Ⅲ～Ⅳ期患者RAGE陽性表達低于中-高分化、無淋巴轉(zhuǎn)移、Ⅰ～Ⅱ期患者，與NSCLC臨床病理特征有關(guān)。

圖2 RAGE、Hsp90AB1、TXNIP對NSCLC的診斷價值(ROC曲線)

李洋等[16]在相關(guān)研究中指出，RAGE在肺癌組織中表達降低，與患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與本研究結(jié)果一致。RAGE參與NSCLC可能機制：RAGE胞內(nèi)端可與下游信號分子DIAPH1結(jié)合，促進RAGE-DIAPH1復(fù)合體形成，胞外配體對RAGE刺激作用不斷提高，參與NSCLC疾病進展過程[17]。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組鱗癌、腺癌Hsp90AB1陽性表達低于正常組，且鱗癌、腺癌Hsp90AB1陽性表達比較無差異。本研究中，Hsp90AB1表達與NSCLC組織分化程度、有淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，參與NSCLC疾病發(fā)展過程。劉俊雅等[18]發(fā)現(xiàn)，Hsp90在胰腺癌組織中顯著高表達，與腫瘤病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、TNM分期有關(guān)，與胰腺癌高侵襲、高轉(zhuǎn)移疾不良預(yù)后相關(guān)，因此Hsp90可能作為肺癌預(yù)后獨立危險因素的重要指標。與王明慧等[19]研究中肺腺癌組織中的陽性表達高于肺鱗癌結(jié)果不一致，可能是因為本研究樣本量有限。EGFR突變在肺腺癌發(fā)病中占較高比重，且EGFR作為Hsp90AB1底物蛋白，參與肺癌發(fā)病過程[20-21]。

經(jīng)過Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，RAGE陽性、TXNIP表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，Hsp90AB1陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示隨著NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，RAGE、TXNIP表達逐漸降低，Hsp90AB1表達升高，參與NSCLC發(fā)病進展。RAGE、Hsp90AB1、TXNIP三者聯(lián)合檢查敏感性、準確度較高，從而提高NSCLC診斷價值。

綜上所述，RAGE、Hsp90AB1、TXNIP在NSCLC中表達異常，三者與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，參與疾病發(fā)展，三者聯(lián)合檢查對NSCLC診斷價值較高。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻說明：王瑩瓊：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫與修改；陳建歐：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核;李小菲：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改;應(yīng)曉媚：進行統(tǒng)計學(xué)分析;林鵬：課題設(shè)計，論文修改，資料收集整理。