宋京芝 馬晏然 李宏 李云霞 周璇 項(xiàng)鋒鋼

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，山東 青島 266003)

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrine neoplasm，NEN)是起源于肽能神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的異質(zhì)性腫瘤。消化系統(tǒng)NEN的病理診斷名稱、分類和分級(jí)現(xiàn)逐漸趨于統(tǒng)一。第5版《WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類》中對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌瘤G3(neuroendocrine tumor，NET G3)與神經(jīng)內(nèi)分泌癌(neuroendocrine carcinoma，NEC)的鑒別進(jìn)行了闡述[1]。兩組腫瘤的診斷是基于腫瘤的組織學(xué)和增殖程度(核分裂象及Ki-67指數(shù))的評(píng)估，如僅靠組織學(xué)對(duì)兩者進(jìn)行鑒別，約2/3病例的診斷存在爭(zhēng)議[2]，且Ki-67指數(shù)又不能將NET G3與NEC鑒別開(kāi)來(lái)。因此，在缺乏典型的組織學(xué)表現(xiàn)(特別是活檢標(biāo)本)時(shí)，兩者的鑒別仍然比較困難。美國(guó)紀(jì)念Sloan-Kattering癌癥中心的研究結(jié)果顯示，NET G3患者的5年生存率大約為29.1%，而NEC患者則約為16.3%[3]。NET G3患者對(duì)化療不敏感，可用生長(zhǎng)抑素類似物、靶向藥物等治療，而NEC患者對(duì)化療的靈敏度較高[4]。兩者的治療策略與臨床預(yù)后等有顯著差異，因此二者的正確診斷極為重要。

針對(duì)胰腺NEN的遺傳學(xué)研究表明，胰腺NEC患者存在TP53及RB基因的異常，其在分化良好胰腺NET患者中較罕見(jiàn)[5]?！?020年中國(guó)胃腸胰NEN病理診斷共識(shí)”中也提及消化系統(tǒng)NEC患者常出現(xiàn)TP53和RB抑癌基因失活，免疫組織化學(xué)(IHC)的檢測(cè)結(jié)果顯示NEC患者中p53異常表達(dá)者約占76%，Rb異常表達(dá)者約占22%～58%，然而NET患者不存在TP53和RB基因的異常表達(dá)[6]。

本研究回顧性分析97例NEN病例，采用IHC染色檢測(cè)p53及Rb的表達(dá)，結(jié)合其臨床病理資料和隨訪數(shù)據(jù)，初步探討準(zhǔn)確鑒別消化系統(tǒng)NEC和NET G3的重要臨床意義，為患者今后的精準(zhǔn)治療提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

收集2010年8月—2020年8月我院病理學(xué)檢查診斷為消化系統(tǒng)NEC(93例)及“高增殖活性”NET(4例)并行根治性切除的手術(shù)標(biāo)本共97例，其中12例手術(shù)標(biāo)本NEC有對(duì)應(yīng)的活檢標(biāo)本。電話隨訪97例NEN患者，截至2021年7月31日，失訪患者10例。NEC患者術(shù)后滿5、3、1年且隨訪資料完整者分別有36、52、83例?！案咴鲋郴钚浴盢ET患者4例，均術(shù)后隨訪滿3年，不滿5年，隨訪資料完整。本研究針對(duì)隨訪5、3、1年的NEC患者以及隨訪3年的“高增殖活性”NET患者進(jìn)行預(yù)后分析。

1.2 IHC染色檢測(cè)p53及Rb的表達(dá)

采用IHC染色檢測(cè)每例腫瘤組織標(biāo)本p53及Rb的表達(dá)?？贵wp53購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，抗體Rb Gene Protein購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。IHC結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素生存分析，使用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型進(jìn)行多因素分析。采用最大偏似然估計(jì)似然比檢驗(yàn)(LR)法篩選變量。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 組織學(xué)及IHC染色檢測(cè)結(jié)果

復(fù)檢93例原診斷為NEC患者中，最終有5例被重新歸類為NET G3；復(fù)檢4例原診斷為“高增殖活性”NET病例中，最終3例被重新歸類為NEC。最終所有病例中91例被明確診斷為NEC，6例明確診斷為NET G3。

NET G3細(xì)胞多呈推擠式生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞形態(tài)溫和，呈巢狀、小梁狀或腺管樣結(jié)構(gòu)，染色質(zhì)細(xì)膩，核仁不明顯，周圍有豐富的小血管和多少不等的纖維間質(zhì)(圖1A、B)。IHC染色顯示，6例NET G3均無(wú)Rb及p53的異常表達(dá)(圖1C、D)。NEC細(xì)胞呈彌漫浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，細(xì)胞異型明顯，染色質(zhì)粗糙，核分裂象易見(jiàn)，可見(jiàn)核仁及壞死，有雜亂的大血管和促結(jié)締組織增生性間質(zhì)。組織類型分為大細(xì)胞型NEC(LCNEC)(圖2)及小細(xì)胞型NEC(SCNEC)(圖3)。NEC中p53和(或)Rb異常表達(dá)者約占89.0%(81/91)，僅p53異常表達(dá)者約占85.7%(78/91)，僅Rb異常表達(dá)者約占57.1%(52/91)，同一病例p53及Rb均異常表達(dá)者約占53.8%(49/91)。

A:HE染色，200倍；B:HE染色，400倍；C:Rb表達(dá)，PV6000法，400倍；D:p53表達(dá)，PV6000法，400倍

A：HE染色，400倍；B：Ki-67表達(dá)，PV6000法，400倍；C：Rb表達(dá)，PV6000法，400倍；D：p53表達(dá)，PV6000法，400倍

A：HE染色，400倍；B：p53表達(dá)，PV6000法，400倍；C：Ki-67表達(dá)，PV6000法，400倍；D：Rb表達(dá)，PV6000法，400倍

對(duì)原診斷為NEC的12例患者的活檢標(biāo)本及其對(duì)應(yīng)的手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行復(fù)核，結(jié)果顯示，診斷正確率為100%。兩者在組織學(xué)表現(xiàn)方面及IHC檢測(cè)相應(yīng)的結(jié)果上大致相同?；顧z標(biāo)本具有經(jīng)典組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)特征，包括浸潤(rùn)性生長(zhǎng)模式、異型性明顯的細(xì)胞形態(tài)以及促纖維結(jié)締組織增生性間質(zhì)，并伴有多灶壞死等表現(xiàn)。

2.2 NEC的臨床病理及患者的預(yù)后情況

91例NEC患者中，男74例，女17例；年齡28～84歲，平均年齡(61.1±9.8)歲；其中LCNEC患者42例，SCNEC患者49例。腫瘤原發(fā)于胃部約占50.5%(46/91，含2例肝轉(zhuǎn)移灶)，其次為結(jié)直腸約占19.8%(18/91，含3例肝轉(zhuǎn)移灶)，膽管及膽囊約占9.9%(9/91,含1例肝轉(zhuǎn)移灶)，食管約占7.7%(7/91)，十二指腸約占6.6%(6/91)，胰腺約占4.4%(4/91)，肝臟約占1.0%(1/91)，經(jīng)相關(guān)檢查未發(fā)現(xiàn)其他部位病灶。在手術(shù)切除標(biāo)本中，腫物平均最大徑(4.7±2.8)cm，神經(jīng)侵犯和脈管癌栓的發(fā)生率分別約為37.4%(34/91)和41.8%(38/91)。進(jìn)行周圍淋巴結(jié)清掃的病例中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例約達(dá)39.3%(33/84)。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率約占12.1%(11/91)，其中肝臟為最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位(6/91)，其次為腎上腺(3/91)及腹膜(2/91)。

81例患者成功隨訪，隨訪時(shí)間12～132個(gè)月，術(shù)后1、3、5年平均總生存期(OS)分別為10.7、24.0、31.2個(gè)月，42例患者現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，術(shù)后1、3、5年平均無(wú)病生存期(DFS)分別為8.9、19.9、26.4個(gè)月。以隨訪截止日NEC患者生存時(shí)間和生存情況為因變量(存活=0，死亡=1)，以組織學(xué)類型(大細(xì)胞型=0，小細(xì)胞型=1)，腫瘤部位(胃=0，結(jié)直腸=1，膽管及膽囊=2，食管=3，十二指腸=4，胰腺=5，肝臟=6)，腫瘤大小(最大徑≤2 cm=0，>2 cm=1)，脈管癌栓(否=0，是=1)，神經(jīng)侵犯(否=0，是=1)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(否=0，是=1)為自變量，納入Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型。單因素分析顯示，組織學(xué)類型、脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是NEC患者術(shù)后3年OS和DFS的影響因素(P<0.05)。將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的因素納入多因素Cox回歸分析，多因素Cox回歸分析結(jié)果表明，小細(xì)胞型及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是NEC患者術(shù)后3年OS和DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。SCNEC患者術(shù)后1、3、5年平均OS和DFS較LCNEC患者更短(P<0.05)。見(jiàn)圖4。單因素及多因素Cox回歸分析顯示，腫瘤部位、大小及是否神經(jīng)侵犯與患者的生存時(shí)間均無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)。見(jiàn)表1、2。

A:患者術(shù)后1年OS曲線，B:患者術(shù)后1年DFS曲線，C:患者術(shù)后3年OS曲線，D:患者術(shù)后3年DFS曲線，E:患者術(shù)后5年OS曲線，F(xiàn):患者術(shù)后5年DFS曲線

表1 單因素和多因素Cox回歸模型分析NEC患者術(shù)后3年OS的影響因素

表2 單因素和多因素Cox回歸模型分析NEC患者術(shù)后3年DFS的影響因素

2.3NET G3的臨床病理及患者的預(yù)后情況6例NET G3患者中，男4例，女2例；年齡為52～67歲，平均年齡(59.0±4.9)歲。腫瘤原發(fā)于胃3例，胰腺3例。腫物平均最大徑(4.3±1.7)cm。發(fā)生神經(jīng)侵犯和脈管癌栓分別為3例和4例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移2例，均無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

6例患者成功隨訪，隨訪時(shí)間36～94個(gè)月。1例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，6例患者均存活。術(shù)后3年平均DFS為34.0個(gè)月。因腫瘤病例較少，未對(duì)NET G3患者進(jìn)行單因素及多因素Cox回歸分析。

2.4 NET G3與NEC的預(yù)后比較

本研究中NET G3病例較少，對(duì)NET G3和NEC進(jìn)行初步比較分析。NET G3患者術(shù)后3年平均OS和DFS(分別為36.0、34.0個(gè)月)較NEC患者(分別為24.0、19.9個(gè)月)顯著延長(zhǎng)(χ2=6.014、5.930，P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 NET G3與NEC患者術(shù)后3年生存曲線

3 討 論

臨床上，NET G3疾病概念的提出過(guò)程較為漫長(zhǎng)。此前，病理醫(yī)師是以2010年第4版《WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類》中胃腸胰NEN分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]中按核分裂象及Ki-67指數(shù)進(jìn)行腫瘤分級(jí)。但在后續(xù)臨床研究和實(shí)際工作中，發(fā)現(xiàn)有一部分分化良好的胰腺NEN G3患者的預(yù)后較分化差的NEN G3患者更好[9-10]。“2013年中國(guó)胃腸胰NEN病理診斷共識(shí)”初次提出“高增殖活性”NET的概念[11]，但無(wú)具體診斷標(biāo)準(zhǔn)及輔助診斷指標(biāo)。2015年，日本TAKIZAWA等[12]對(duì)大腸NEC的分子特征進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示NEC患者有TP53及RB基因異常，但在NET患者中未檢測(cè)到TP53及RB基因的異常；同時(shí)IHC檢測(cè)顯示NEC患者中p53異常表達(dá)率約為88%，Rb異常表達(dá)率約為56%。2017年WHO內(nèi)分泌腫瘤中胰腺NEN分類[13]首次提出，分化良好的NET中也存在高級(jí)別G3的類型。2019年第5版《WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類》[1]中正式有了NET G3的診斷命名。本研究復(fù)檢的93例原診斷為NEC的患者，經(jīng)組織學(xué)并結(jié)合IHC檢測(cè)最終有5例被重新歸類為NET G3；復(fù)檢的4例原診斷為“高增殖活性”NET的患者，最終有3例被重新歸類為NEC。結(jié)果顯示，NET G3在組織學(xué)上，經(jīng)多點(diǎn)仔細(xì)尋找可發(fā)現(xiàn)存在良好分化的腫瘤區(qū)域；而NEC腫瘤組織分化較差，未見(jiàn)良好分化的腫瘤區(qū)域。IHC檢測(cè)顯示，NET G3的患者均無(wú)p53及Rb異常表達(dá)；而NEC患者中p53和(或)Rb異常表達(dá)者高達(dá)89.0%。研究結(jié)果提示，p53及Rb檢測(cè)對(duì)于NEC及NET G3具有較高的輔助鑒別價(jià)值。本研究復(fù)檢的12例診斷為NEC的活檢標(biāo)本，盡管與后續(xù)手術(shù)切除后的大標(biāo)本的診斷結(jié)果相一致，但發(fā)現(xiàn)相對(duì)于大標(biāo)本其組織學(xué)診斷更為困難。由于研究收集的活檢標(biāo)本均為NEC，其組織學(xué)及IHC檢測(cè)結(jié)果與相應(yīng)的手術(shù)標(biāo)本相同，因此診斷符合率高。隨著NET G3的提出，要求我們對(duì)活檢標(biāo)本的診斷必須更為準(zhǔn)確。值得注意的是，NET可以發(fā)生腫瘤的升級(jí)，即由G1/2期轉(zhuǎn)變?yōu)镚3期，因此NET G3常伴有分化好的神經(jīng)內(nèi)分泌瘤(NET G1/2)的區(qū)域；而NEC與NET進(jìn)展無(wú)關(guān)，一般也沒(méi)有經(jīng)典的NET形態(tài)[14-15]。因活檢標(biāo)本組織的局限性，僅靠組織學(xué)對(duì)活檢標(biāo)本做出診斷有時(shí)困難，因此建議同時(shí)進(jìn)行相應(yīng)IHC的檢測(cè)，最大限度消除標(biāo)本局限性帶來(lái)的誤診，做到更為精確的診斷。

STROJAN等[16]對(duì)喉的LCNEC及SCNEC的高質(zhì)量文獻(xiàn)進(jìn)行綜合性回顧分析發(fā)現(xiàn)，組織學(xué)為小細(xì)胞型的NEC患者較大細(xì)胞型預(yù)后更差，這可能與SCNEC腫瘤細(xì)胞的Azzopardi現(xiàn)象有關(guān)，即因腫瘤細(xì)胞溶酶體膜功能不全，使細(xì)胞核中DNA外溢，而這種現(xiàn)象使得腫瘤細(xì)胞更容易彌散并浸潤(rùn)血管壁。本研究重新歸類的91例NEC患者，單因素分析顯示，組織學(xué)類型、脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是NEC患者術(shù)后3年OS和DFS的影響因素。多因素Cox回歸分析表明，小細(xì)胞型及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是NEC患者術(shù)后3年OS和DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。提示臨床上可以考慮將上述指標(biāo)用于NEC患者的風(fēng)險(xiǎn)分層和預(yù)后評(píng)估。

有研究表明，NET G3常原發(fā)于胰腺[17]。國(guó)內(nèi)研究也顯示NET G3患者的腫瘤部位、大小、脈管癌栓、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與生存時(shí)間無(wú)顯著相關(guān)性[18]。目前認(rèn)為NET G3患者比NEC患者預(yù)后更好。研究顯示，NET G3患者的中位OS可達(dá)33～98個(gè)月，明顯高于NEC患者的11～17個(gè)月[19-20]。胰腺NET G3患者的中位OS為42～75個(gè)月，而胰腺NEC患者的中位OS僅有8.5～13.0個(gè)月[21]。本研究結(jié)果顯示，6例NET G3患者，僅1例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，術(shù)后3年平均DFS為34.0個(gè)月；NET G3患者術(shù)后3年OS和DFS較NEC患者更長(zhǎng)。本研究由于NET G3患者較少，僅有6例，未對(duì)NET G3患者進(jìn)行單因素及多因素Cox回歸分析，后續(xù)需加大樣本量，深入分析NET G3患者預(yù)后的影響因素，為患者的預(yù)后評(píng)估及精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。

綜上所述，NET G3作為一種新分類的腫瘤，僅靠組織學(xué)將其與NEC鑒別較為困難，結(jié)合p53、Rb檢測(cè)可以提高醫(yī)師的鑒別能力。小細(xì)胞型、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是NEC患者OS和DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可以考慮用于NEC患者的風(fēng)險(xiǎn)分層和預(yù)后評(píng)估。提高對(duì)NET G3及NEC的認(rèn)識(shí)，可以幫助臨床選擇正確的治療策略和準(zhǔn)確評(píng)估患者預(yù)后。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗(yàn)均已通過(guò)青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)(文件號(hào)QYFYWZLL26938)。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書(shū)。

EthicsApprovalandPatientConsent： All experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University (Approval Letter No. QYFYWZLL26938). Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻(xiàn)：宋京芝、項(xiàng)鋒鋼、周璇參與了研究設(shè)計(jì)；宋京芝、馬晏然、李云霞和李宏參與了論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed bySONGJingzhi,XIANGFenggang, andZHOUXuan.The manuscript was drafted and revised bySONGJingzhi,MAYanran,LIYunxia, andLIHong. All the authors have read the lastversion of the paper and conserted submission.