王淑華 賈鳳菊 焦倩 傅琳 杜希恂 陳曦 姜宏

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東省神經(jīng)相關(guān)疾病的機(jī)制與重點(diǎn)防治實(shí)驗(yàn)室，山東省沿海地區(qū)神經(jīng)退變疾病協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 青島 266071)

細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)是指細(xì)胞內(nèi)鐵濃度維持動(dòng)態(tài)平衡，鐵含量過多或過少都可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷[1-2]。鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)主要依賴于鐵調(diào)節(jié)蛋白(IRPs)，IRPs分為IRP1和IRP2兩種。研究發(fā)現(xiàn)IRP1主要與腎臟和肺組織特定細(xì)胞中的鐵反應(yīng)元件(IRE)結(jié)合，IRP1基因敲除(IRP1-/-)小鼠則會(huì)出現(xiàn)紅細(xì)胞增多癥和肺動(dòng)脈高壓[3]；IRP2也可以與細(xì)胞中鐵轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存蛋白的IRE結(jié)構(gòu)結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)鐵代謝的作用[4]，IRP2基因敲除(IRP2-/-)小鼠會(huì)出現(xiàn)貧血、鐵穩(wěn)態(tài)失衡并且?guī)в猩窠?jīng)退行性疾病癥狀(如姿勢異常、尾巴僵硬、步態(tài)不協(xié)調(diào)等)[5-6]。另外，IRP1-/-并IRP2-/-小鼠在胚胎期即可死亡[7]。研究發(fā)現(xiàn)，將IRP2高表達(dá)的人肺癌細(xì)胞H1299注射到裸鼠皮下，可通過調(diào)節(jié)鐵代謝促進(jìn)腫瘤生長[8]，但I(xiàn)RP2高表達(dá)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響目前尚無報(bào)道。

既往的研究結(jié)果表明，IRP2-/-小鼠中IRP1代償性表達(dá)增加[9]，但同時(shí)也有研究報(bào)道結(jié)果顯示，IRP2和IRP1在各類癌細(xì)胞中的表達(dá)水平并不一致[10-11]。在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中IRP1以及IRP2蛋白的表達(dá)水平均顯示呈顯著性升高，但是在MDA-MB-175乳腺癌細(xì)胞中IRP1和IRP2蛋白的表達(dá)水平卻呈現(xiàn)相反的趨勢[12]。在神經(jīng)退行性疾病當(dāng)中，IRP2高表達(dá)對(duì)IRP1蛋白表達(dá)水平的影響并不明確，本研究旨在進(jìn)一步探討高表達(dá)的IRP2對(duì)PC12細(xì)胞存活率以及細(xì)胞中IRP1蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料來源

PC12細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所；Vector空載質(zhì)粒購自和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司；MYC-IRP2質(zhì)粒由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建； Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；MTT Formazan試劑盒購自美國Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒(Protein Assay Kit)購自江蘇康為世界生物科技有限公司；IRP1抗體和IRP2抗體購自美國Abcam公司；GAPDH抗體購自美國CST公司；羊抗兔IgG-HRP購自上海愛必信生科科技有限公司。

1.2 PC12細(xì)胞培養(yǎng)

將含有PC12細(xì)胞的凍存管從液氮罐取出后立即轉(zhuǎn)移到37 ℃水浴鍋中至完全融化，吸取凍存管中的PC12細(xì)胞懸液并轉(zhuǎn)移到含有5 mL完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基+體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清+體積分?jǐn)?shù)0.01青鏈霉素混合液)的離心管中。然后用吸管吹打混勻后以1 000 r/min離心5 min，棄掉上清液。再次與5 mL完全培養(yǎng)基混勻，接種到培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次，傳到第3代且細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

將培養(yǎng)好的細(xì)胞分別接種于96孔板(每組各設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，用于MTT實(shí)驗(yàn))和12孔板(每組各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，用于免疫印跡分析)中，在細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染MYC-Vector空載質(zhì)粒的細(xì)胞設(shè)為Vector組，轉(zhuǎn)染MYC-IRP2質(zhì)粒的細(xì)胞設(shè)為IRP2組。分別將MYC-Vector空載質(zhì)粒、MYC-IRP2質(zhì)粒、Lip 2000與DMEM培養(yǎng)基混合，靜置5 min后將MYC-Vector空載質(zhì)?；旌衔锛癕YC-IRP2質(zhì)?；旌衔锓謩e與Lip 2000混合物吹打混勻，靜置15～20 min后加到96孔板和12孔板的PC12細(xì)胞中轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染6～8 h后觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞有變圓趨勢時(shí)將培養(yǎng)液換成完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行后面的MTT實(shí)驗(yàn)或免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT法檢測PC12細(xì)胞存活率

棄掉96孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，在培養(yǎng)箱中避光孵育4 h；棄上清液后，每孔均加入DMSO 100 μL，室溫下避光孵育10 min后；使用酶標(biāo)儀檢測各孔在波長570 nm處的吸光度(A)值并進(jìn)一步計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=AIRP2組/A對(duì)照組×100%。

1.5 免疫印跡法檢測PC12細(xì)胞中IRP2及IRP1的表達(dá)水平

對(duì)培養(yǎng)在12孔板中的Vector組和IRP2組細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取，使用BCA法檢測并計(jì)算上樣量，Vector組和IRP2組每個(gè)蛋白樣品的上樣量均為20 μg，然后加入5×上樣緩沖液混勻以后，金屬浴10 min以后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。然后以300 mA穩(wěn)定電流轉(zhuǎn)膜90 min，以含體積分?jǐn)?shù)0.10脫脂奶粉室溫封閉2 h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑诿總€(gè)條帶分別對(duì)應(yīng)加入IRP2、IRP1及GAPDH一抗4 ℃輕搖過夜。第2天于室溫下以TBST洗膜3次，每次10 min。然后羊抗兔二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。最后用ECL發(fā)光液顯影，并用Image J軟件分析IRP2、IRP1和GAPDH條帶的灰度值，IRP2、IRP1的相對(duì)表達(dá)水平以IRP2/GAPDH比值和IRP1/GAPDH比值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 IRP2高表達(dá)對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響

Vector組和IRP2組PC12細(xì)胞存活率分別為(95.79±1.91)%和(81.71±2.98)%，與Vector組進(jìn)行比較，IRP2組的細(xì)胞活力明顯降低(t=3.97，P<0.01)。

2.2 IRP2高表達(dá)對(duì)PC12細(xì)胞中IRP1表達(dá)水平的影響

Vector組IRP1和IRP2蛋白的表達(dá)水平分別為0.88±0.05、0.55±0.04，IRP2組IRP1和IRP2蛋白的表達(dá)水平分別為1.24±0.13、0.84±0.09，兩組比較，IRP1和IRP2蛋白的表達(dá)水平差異均具有顯著性(t=2.59、3.01，P<0.05)。見圖1。

A：兩組細(xì)胞中IRP2表達(dá)水平，B：兩組細(xì)胞中IRP1表達(dá)水平

3 討 論

IRPs在靶基因5′mRNA與非翻譯區(qū)的IRE結(jié)合，阻斷翻譯起始，或結(jié)合在靶基因3′mRNA附近，增強(qiáng)其穩(wěn)定性[13]，從而影響調(diào)節(jié)鐵代謝的靶蛋白，這些靶蛋白包括負(fù)責(zé)將鐵轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TFR1)、二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1(DMT1)、在細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存鐵的鐵蛋白以及負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)出鐵的鐵轉(zhuǎn)出蛋白(FPN)。當(dāng)外源性給予三價(jià)或二價(jià)鐵試劑處理導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)高鐵時(shí)，IRPs與IRE結(jié)合力減弱，F(xiàn)PN和鐵蛋白表達(dá)增加，TFR1和DMT1表達(dá)減少，以降低胞內(nèi)鐵含量；當(dāng)外源性加入鐵螯合劑或誘導(dǎo)缺氧等因素誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)低鐵時(shí)，IRPs與IRE結(jié)合力增強(qiáng)，鐵蛋白與FPN表達(dá)減少，TFR1與DMT1表達(dá)增加以升高細(xì)胞內(nèi)鐵含量[14]。研究發(fā)現(xiàn)，IRP2是大腦中鐵代謝的關(guān)鍵蛋白，可以調(diào)節(jié)鐵的吸收與利用、血紅蛋白的合成及影響氧氣運(yùn)輸?shù)?，以直接或間接的方式參與肺癌、乳腺癌以及神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展過程[14]。研究顯示IRP2與帕金森病(PD)有關(guān)，IRP2-/-小鼠TFR1和DMT1的表達(dá)水平明顯降低，F(xiàn)PN和鐵蛋白的表達(dá)水平增高，誘導(dǎo)黑質(zhì)鐵沉積，加劇多巴胺能神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致紋狀體中多巴胺的釋放減少，從而出現(xiàn)PD相關(guān)癥狀[15-17]。在腫瘤細(xì)胞中，IRP2也可通過調(diào)節(jié)鐵代謝促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡[18]。因此，我們推測IRP-IRE系統(tǒng)是通過調(diào)控TFR1、DMT1、鐵蛋白、FPN等鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)影響PD的發(fā)生和發(fā)展[15]。

本研究結(jié)果顯示，IRP2高表達(dá)后細(xì)胞存活率降低，說明IRP2的高表達(dá)對(duì)PC12細(xì)胞具有損傷作用，其損傷機(jī)制可能與IRP-IRE調(diào)節(jié)有關(guān)。一方面，IRP2表達(dá)上調(diào)后，IRP2與鐵代謝相關(guān)基因上的IRE莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合，干擾細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低。另一方面，IRP2還可以與抑癌基因P53、缺氧誘導(dǎo)因子[19]、影響腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)功能的線粒體烏頭酸酶[20]、影響血紅素合成的δ-氨基-γ-酮戊酸合成酶[21]等基因上的IRE莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合，影響這些基因的表達(dá)，可能對(duì)細(xì)胞的存活率產(chǎn)生影響，但作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

據(jù)報(bào)道，IRP1也可通過與IRE結(jié)合而影響鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)，其機(jī)制與IRP2相似，這可能與兩者同源性較高有關(guān)[13]，IRP1與IRP2有64%的氨基酸序列重疊[22-23]。但是兩者在鐵代謝的調(diào)節(jié)作用上存在差異，IRP2在鐵充足的細(xì)胞中可通過泛素化降解調(diào)節(jié)鐵代謝[22]，IRP1可以特別地結(jié)合鐵硫簇感知細(xì)胞內(nèi)鐵水平，但調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的能力相較IRP2弱[24]。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在PC12細(xì)胞中高表達(dá)IRP2后IRP1蛋白表達(dá)水平升高，提示IRP2高表達(dá)或可促進(jìn)IRP1蛋白水平的表達(dá)。目前IRP1表達(dá)水平增高的作用并不明確，它可能起到保護(hù)細(xì)胞的作用，因?yàn)橛醒芯勘砻髟诎柎暮Ｄ〉牡湫蜆?biāo)志物——淀粉樣前體蛋白(APP)的5′端的非翻譯區(qū)亦存在IRE樣RNA莖環(huán)，在人源神經(jīng)細(xì)胞中IRP1可以選擇性地與該莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合并抑制其翻譯，減少細(xì)胞損傷，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用[25]。但也有研究指出，IRP1過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞鐵代謝紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致鐵分布異常[26]，有可能造成器官或機(jī)體損傷。因此，IRP1增多對(duì)細(xì)胞的作用仍需進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在PC12細(xì)胞中，當(dāng)IRP2蛋白水平升高時(shí)，IRP1蛋白表達(dá)水平亦增高。這與在乳腺癌腫瘤細(xì)胞中得到的結(jié)果一致，即IRP2高表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長過快時(shí)，可引起IRP1高表達(dá)來發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用[12]。也有研究發(fā)現(xiàn)，IRP2與IRP1蛋白的表達(dá)呈相反趨勢，在IRP2-/-小鼠的小腦、前腦以及腦干細(xì)胞中IRP1水平升高。可能與IRP1能部分代償IRP2的功能有關(guān)[9]，因?yàn)楸M管IRP2對(duì)鐵代謝相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)起主導(dǎo)作用，而IRP1可能相當(dāng)于潛在的“替補(bǔ)部隊(duì)”，來彌補(bǔ)IRP2的缺失以維持機(jī)體鐵代謝穩(wěn)定[9]?？傊?，IRP2與IRP1的關(guān)系并不明確，可能因細(xì)胞來源、在體或離體條件的不同而存在差異。

綜上所述，IRP2高表達(dá)對(duì)PC12細(xì)胞具有損傷作用，同時(shí)IRP2高表達(dá)也可引起PC12細(xì)胞中的IRP1表達(dá)升高，本研究為進(jìn)一步明確IRP2與IRP1的關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)闡明IRP2與IRP1在鐵代謝紊亂相關(guān)疾病中的作用具有一定的科學(xué)意義。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻(xiàn)：王淑華、賈鳳菊、陳曦、姜宏參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；王淑華、焦倩、傅琳、杜希恂參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byWANGShuhua,JIAFengju,CHENXi, andJIANGHong. The manuscript was drafted and revised byWANGShuhua,JIAOQian,FULin, andDUXixun. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.