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        溫度對黃粉蟲凝乳酶凝乳特性的影響

        2022-05-09 09:39:46宋朝陽楊曉麗文鵬程喬海軍張衛(wèi)兵張忠明
        食品科學 2022年8期
        關鍵詞:凝乳酶凝乳酪蛋白

        宋朝陽,汪 月,楊曉麗,張 炎,文鵬程,喬海軍,張衛(wèi)兵,*,張忠明,*

        (1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司,甘肅 蘭州 730000;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學理學院,甘肅 蘭州 730070)

        凝乳酶是干酪生產(chǎn)中重要的酶制劑,它可以水解αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白中的特定肽鍵,特別是對κ-酪蛋白中Phe105-Met106肽鍵具有高特異性的裂解作用,使酪蛋白膠束失穩(wěn),最終聚集形成凝乳[1-2]。動物源凝乳酶具有良好的凝乳性能、可接受性高、提取方便,是奶酪生產(chǎn)的最佳選擇,但是有限的動物資源限制了凝乳酶的產(chǎn)量[3],因此,尋找凝乳酶替代物是該領域的研究熱點,為了滿足凝乳酶的市場需求,以食用昆蟲為資源開發(fā)新型凝乳酶具有良好的前景。

        黃粉蟲(Tenebrio molitor),俗稱面包蟲,屬于鞘翅目動物。黃粉蟲幼蟲含有豐富的蛋白質、酶類及生物活性物質,是一種優(yōu)質的可食性昆蟲資源。它生長迅速,成本低,對環(huán)境的負擔較小,已經(jīng)廣泛應用于食品、醫(yī)藥和飼料等領域[4],但是黃粉蟲幼蟲體內(nèi)含有微量的苯醌毒物,加工中必須嚴格清雜排毒保證食用的安全性[5]。目前,對于黃粉蟲的研究報道主要集中在纖溶性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶和幾丁質酶等方面[6-7],而關于黃粉蟲凝乳酶(Tenebrio molitorrennet,TMR)的研究鮮有報道。

        酶誘導凝乳的形成是干酪生產(chǎn)中的關鍵步驟,它直接影響最終產(chǎn)品的質量。凝乳形成過程中,溫度對于凝乳酶的凝乳特性、凝乳結構以及干酪質量和風味等的影響極為重要。適宜的溫度會增加酪蛋白膠束碰撞的頻率,導致凝乳速度加快,較低的溫度很難破壞酪蛋白膠束的穩(wěn)定性,酪蛋白的聚集度降低,溫度過高會導致凝乳酶失活[8]。李貽珍等[9]的研究表明凝乳溫度升高,蛋白質之間的相互作用增強,顯著影響凝乳酶的凝乳性能。目前,溫度對TMR凝乳性能影響的研究鮮見報道。

        因此,本實驗以實驗室自制TMR為研究對象,探究凝乳溫度對其凝乳行為、水解特性及凝乳結構的影響,旨在為新型昆蟲凝乳酶的開發(fā)及在乳品工業(yè)中的應用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        TMR凍干粉(純化倍數(shù)66.52,比活力268.09 SU/mg),本實驗室自制;商品凝乳酶(commercial rennet,CR)北京愛多特生物技術有限公司;荷爾斯坦牛乳 甘肅農(nóng)業(yè)大學的奶牛場;脫脂乳粉 內(nèi)蒙古伊利乳業(yè)有限責任公司。

        三氯乙酸 國藥集團化學試劑有限公司;茚三酮 天津市光復科技發(fā)展有限公司;異硫氰酸熒光素酯(fluorescein isothiocyanate,F(xiàn)ITC) 北京索萊寶科技有限公司;其他試劑均為分析純。

        1.2 儀器與設備

        BS223S型電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;H/T16MM臺式高速離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司;HH-8電熱恒溫水浴鍋 常州市億能實驗儀器廠;PHS-3C pH計 上海雷磁儀器廠;DiscoveryHR-1混合流變儀 美國TA Instruments公司;Bettersize2600激光粒度分布儀 丹東百特儀器有限公司;UV-650紫外-可見分光光度計 中科瑞捷(天津)科技有限公司;Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;LSM 800型激光掃描共聚焦顯微鏡 德國蔡司股份公司;SCIENTZ-10ND冷凍干燥機 英國Stable Micro System公司。

        1.3 方法

        1.3.1 凝乳酶液的配制

        凝乳酶采用離子交換層析分離純化,使用冷凍干燥機制得凝乳酶粉,貯藏在-80 ℃。然后稱取1 g凝乳酶凍干粉,加入適量磷酸鹽緩沖液(0.5 mol/L,pH 7.0)溶解配制成凝乳酶液,適當稀釋后采用Arima法在35 ℃測定其酶活力為150 SU/mL。

        1.3.2 凝乳的制備

        將牛乳在3 000hg條件下離心10 min脫脂,然后分別在35、40、45、50、55、60 ℃條件下水浴10 min,加入體積分數(shù)10%同等條件下預熱的凝乳酶液,快速混勻,凝乳1 h,排出乳清,得到凝乳。

        1.3.3 凝乳持水力和乳清OD值測定

        凝乳持水力的測定參照趙笑等[10]的方法進行:將凝乳4 ℃、7 000 r/min離心10 min,取上清液稱質量,按式(1)計算乳樣持水力:

        乳清OD值測定參考吳檳等[11]的方法進行:使用紫外-可見分光光度計測定排出的乳清在波長500 nm處的光密度OD。

        1.3.4 凝乳粒徑分布的測定

        采用動態(tài)光散射測定[12],使用冷凍干燥機將凝乳樣品凍干,然后直接加到激光粒度分布儀的分散池中,以去離子水作為分散劑,分散劑和凝乳樣品的折射率分別為1.33和1.44。

        1.3.5 流變學特性

        1.3.5.1 凝乳表觀黏度的測定

        將凝乳樣品直接轉移到流變儀上,選用夾具40 mm,0°平行板,間隙為1 000 μm,應力為1.0 Pa,頻率范圍0.1~100 s-1,室溫下測定凝乳的表觀黏度[13]。

        1.3.5.2 凝乳過程中儲能模量(G′)的測定

        使用混合流變儀測定牛乳樣品的流變特性[14]。將脫脂牛奶分別在35、40、45、50、55、60 ℃條件下水浴10 min,取5 mL牛奶樣品,加入0.5 mL同等條件下預熱的凝乳酶,混合30 s,然后立即轉移至流變儀上,選用夾具40 mm,0°平行板,間隙為1 000 μm,頻率為1 Hz,應力為0.1 Pa,數(shù)據(jù)采集點間隔為10 s。所有測試都在線性黏彈性區(qū)域進行,測量的參數(shù)為儲能模量(G’),每次測試時間為1 h。

        1.3.6 乳清中酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptide,CGMP)含量和水解度的測定

        乳清前處理:將乳清在沸水浴中滅酶后,9 000hg離心10 min去除乳清中的殘余凝乳,然后加入三氯乙酸進一步除雜,過濾。

        CGMP含量的測定[15]:取2 mL唾液酸標準溶液,加入間苯二酚試劑工作液2 mL煮沸15 min,然后迅速冷卻,加入4 mL有機溶液乙酸丁酯和正丁醇(85∶15,V/V),搖勻,37 ℃水浴中提取5 min后,在4 ℃、2 860hg離心10 min,在波長580 nm處測定上層有機物的吸光度。唾液酸的標準曲線方程為y=24.671x+0.064,R2=0.991。然后取2 mL前處理后的乳清樣品,按上述步驟測定吸光度。CGMP含量按式(2)計算:

        式中:A為乳清樣品的吸光度;V1為乳清樣品的體積/mL;V2為脫脂牛乳的體積/mL。

        水解度測定采用茚三酮比色法[16],以甘氨酸為標準品。取稀釋后的甘氨酸2 mL,然后加入2 mL茚三酮顯色劑,混合后在沸水浴中加熱15 min,迅速冷卻,加入5 mL體積分數(shù)40%的乙醇溶液,混勻后放置15 min,然后在波長570 nm處測定吸光度。甘氨酸的標準曲線方程為y=0.054 1x+0.009 7,R2=0.998。另取2 mL同樣稀釋的乳清樣品,按上述方法測吸光度。水解度按式(3)計算:

        式中:C為蛋白質質量濃度/(g/L);W為蛋白質量/g;V1為水解液的總體積/mL;V2為顯色時所用稀釋液的總體積/mL。

        1.3.7 凝乳中蛋白二級結構的測定

        采用傅里葉變換紅外光譜儀進行紅外分析[17]。將凍干后的凝乳樣品平鋪在采樣器附件ZnSe晶片上,設置分辨率為4 cm-1,掃描范圍為4 000~400 cm-1。

        1.3.8 凝乳微觀結構觀察

        參考Koutina等[16]的方法略作修改。將5 mL脫脂乳與0.05 mL FITC(0.1 mg/mL)在10 mL離心管中混勻,2 min后加入0.5 mL凝乳酶充分混勻。然后吸取0.5 mL至帶有凹槽的載玻片上,蓋上蓋玻片在35 ℃孵育30 min,然后倒置并利用激光共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope,CLSM)對凝乳樣品進行觀察。

        1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

        實驗數(shù)據(jù)均重復3次,采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行顯著性和相關性分析,數(shù)據(jù)采用 fs表示,采用Origin 2018進行圖表繪制。

        2 結果與分析

        2.1 溫度對凝乳持水力和乳清OD值的影響

        持水力是反映凝乳穩(wěn)定性的重要參數(shù),也是評價凝乳品質的重要指標之一[9]。如圖1A所示,TMR凝乳的持水力隨溫度的升高呈增大趨勢,當溫度由40 ℃升高至55 ℃時,TMR凝乳的持水力由82.51%增加到86.69%;CR凝乳的持水力在35~45 ℃顯著增大(P<0.05),45~60 ℃差異不顯著(P>0.05);而且在不同溫度條件下,TMR凝乳的持水力均顯著大于CR凝乳。這可能是因為較低的凝乳溫度下,維持酪蛋白膠體狀態(tài)的疏水相互作用減弱,更多的疏水基團暴露,導致持水力較低[18];同時,由于TMR對溫度比較敏感,因而隨著溫度的升高,疏水作用力逐漸增強,持水力顯著增大。趙笑等[10]的研究表明溫度升高,TMR的活力提高,凝乳速度加快,包裹在凝乳結構中的水分增多,因而持水力增大,這與本研究結果一致。

        圖1 持水力和乳清OD值的變化Fig.1 Changes in water-holding capacity and whey OD value of curd with preheating temperature of milk

        乳清OD值可以反映排出乳清中的蛋白含量變化,乳清OD值越大,凝乳性能越差[9]。如圖1B所示,TMR的乳清OD值隨溫度的升高顯著減?。≒<0.05),而CR的乳清OD值則隨溫度的升高變化不顯著(P>0.05)。當溫度由35 ℃升高至45 ℃時,TMR的乳清OD值迅速下降到0.253,繼續(xù)升高溫度,乳清OD值基本穩(wěn)定。當溫度升高至45 ℃后,2種凝乳酶的乳清OD值差異較小,凝乳性能相近??赡艿脑蚴荰MR的最適作用溫度低于CR,隨著溫度升高,TMR活力逐漸增強,參與凝乳的蛋白增多,乳清OD值降低[18]。Anema等[19]的研究發(fā)現(xiàn)凝乳溫度的升高會增加酪蛋白的聚集能力,這可能是由于空間位阻或與酪蛋白膠束相關乳清蛋白導致電荷減少引起的。

        2.2 溫度對凝乳粒徑的影響

        表示粒度特征關鍵指標的D10、D50、D90分別代表該樣品的累積粒度分布的百分數(shù)達到10%、50%和90%時所對應的粒徑值,其中D50表示樣品的平均粒徑;D(4,3)表示樣本的體積平均粒徑,其更能反映微量的大直徑粒子的存在[20]。

        如圖2所示,2種酶凝乳的粒徑分布隨溫度的升高均趨于正態(tài)分布。這與Brishti等[21]的研究結果一致,可能的原因是隨凝乳溫度的升高,酪蛋白膠束聚集形成穩(wěn)定的蛋白結構,粒徑增大;當溫度高于45 ℃,TMR逐漸失活,蛋白水解活性增強,酪蛋白聚集形成松散的凝乳結構,蛋白粒徑減小。從表1可以看出,隨溫度的升高,2種酶凝乳的粒徑均先增大后減?。≒<0.05),45~55 ℃ TMR凝乳的平均粒徑差異不顯著(P>0.05);且TMR凝乳在45 ℃的粒徑值顯著大于CR凝乳的粒徑值,凝乳性能較好。這是由于TMR的最適凝乳溫度小于CR,隨溫度的升高,TMR凝乳中蛋白質分子間較強引力形成穩(wěn)定的凝聚結構[18]。

        圖2 凝乳粒徑分布的變化Fig.2 Changes in particle size distribution of curd with preheating temperature of milk

        表1 凝乳粒徑值的變化Table 1 Changes in particle size distribution parameters of curd with preheating temperature of milk

        2.3 凝乳溫度對流變學特性的影響

        2.3.1 凝乳溫度對表觀黏度的影響

        表觀黏度反映凝乳結構的穩(wěn)定性,表觀黏度大,蛋白質分子之間的連接更加緊密,凝乳體系越穩(wěn)定[22]。由圖3可知,凝乳的表觀黏度均隨著剪切速率的增加逐漸降低,表現(xiàn)出剪切變稀的假塑性,符合非牛頓流體特性[23];同一剪切速率下,不同溫度對凝乳表觀黏度的影響存在差異。而且隨溫度的升高,TMR凝乳的表觀黏度先增大后減小,45 ℃達到最大值0.51(圖3a);CR凝乳的表觀黏度則隨溫度的升高不斷增大(圖3b)。Zhao Zhengtao等[23]的研究發(fā)現(xiàn)溫度的升高增加了體系中的疏水基團,導致酪蛋白膠束間形成了穩(wěn)定的三維結構,降低了流動性,表觀黏度增大;相反,當體系中的疏水基團減少時,凝乳結構變得松散,流動性較強,表觀黏度減小,這與本研究的結果一致。45 ℃時2種酶凝乳的表觀黏度值差異最小,而且TMR凝乳的表觀黏度在45 ℃下的降幅最大,蛋白結構穩(wěn)定。這是因為在相同的剪切速率下,蛋白結構越穩(wěn)定的凝乳,其表觀黏度的降幅越大[22]。

        圖3 凝乳表觀黏度的變化Fig.3 Changes in apparent viscosity of curd with preheating temperature of milk

        2.3.2 凝乳溫度對儲能模量(G’)的影響

        小幅振蕩時間掃描已經(jīng)被廣泛用于研究凝乳過程中的黏彈性變化[24],凝乳屬于黏彈性聚合物,其質地受其流變學特性的影響很大[25]。如圖4所示,隨溫度升高,2種酶凝乳過程中的G’均先增大后減??;TMR凝乳和CR凝乳G’分別在50 ℃和40 ℃達到最大值,而且CR凝乳過程中G’顯著大于TMR??赡艿脑蚴荰MR酪蛋白的最大水解發(fā)生在pH 6.2~6.4之間[26],與脫脂牛乳的pH值接近;而且黃粉蟲中含有大量纖溶性蛋白酶,對于凝血塊及凝乳具有較大的溶解性[6];Esteves等[28]的研究發(fā)現(xiàn),溫度的升高促使凝乳酶活性顯著增加,隨凝乳時間的延長,凝乳酶逐漸失活,蛋白水解活性增大,凝乳結構的穩(wěn)定性被破壞,導致G’降低,這與本研究的結果相似。

        圖4 凝乳儲能模量(G’)的變化Fig.4 Changes in curd storage modulus (G’) with preheating temperature of milk

        2.4 凝乳溫度對酶解CGMP含量和水解度的影響

        凝乳酶的水解特性表現(xiàn)為可定向水解酪蛋白產(chǎn)生CGMP,CGMP上含有豐富的支鏈氨基酸和生物活性因子,具有調節(jié)免疫系統(tǒng)、促進腸道益生菌增殖以及抗氧化等特性,可以提高乳制品的附加值[29];水解度代表水解過程中蛋白質肽鍵被裂解的程度[30]。由圖5A可知,在35~45 ℃,TMR酶解產(chǎn)生的CGMP含量和水解度顯著增加(P<0.05),在45~55 ℃溫度范圍內(nèi),兩者均變化不顯著(P>0.05)。由圖5B可知,隨溫度升高,CR酶解產(chǎn)生的CGMP含量顯著降低,水解度顯著增大(P<0.05)。這是因為隨溫度升高,κ-酪蛋白的水解程度逐漸達到80%,Ca2+與酪蛋白膠束間形成了穩(wěn)定的化學鍵,使部分CGMP不能測定出來,因而CGMP含量增加緩慢,水解度下降,這與趙存朝等[12]的研究結果一致。與CR相比,當溫度升高至45 ℃時,TMR酶解產(chǎn)生的CGMP含量變化不顯著(P>0.05),且2種凝乳酶的水解度相近;Anema等[19]溫度的持續(xù)升高會促進β-乳球蛋白與副-κ-酪蛋白區(qū)域形成二硫化鍵,這種復合物在CGMP被去除后仍將附著在酪蛋白膠束上,阻礙凝乳過程中酪蛋白膠束的聚集。同時,TMR來源廣泛、價格低廉、制備工藝簡單,可以極大增加其在乳制品中的經(jīng)濟價值。

        圖5 酶解CGMP含量和水解度的變化Fig.5 Changes in CGMP content and DH of curd with preheating temperature of milk

        2.5 溫度對凝乳中蛋白質二級結構的影響

        小分子與生物大分子之間相互作用引起二級結構的改變[31],因此采用傅里葉紅外光譜研究不同凝乳溫度下酶誘導凝乳形成過程中的二級結構變化,紅外光譜圖中的峰代表不同官能團[32]。如圖6所示,在酰胺III帶1 330~1 220 cm-1之間,TMR凝乳有2個峰,分別對應üCH3彎曲振動和—NO2對稱伸縮;CR凝乳有一個峰,歸屬為—NO2對稱伸縮。因此選擇酰胺III帶進行擬合,計算二級結構的相對含量如表2所示。

        表2 凝乳酪蛋白二級結構的相對含量Table 2 Relative contents of secondary structure in curds

        α-螺旋與β-折疊含量比值可以表征蛋白質內(nèi)部結構的柔韌性,比值越小,蛋白柔韌性越大[33]。由表3可知,隨溫度升高,TMR凝乳中α-螺旋/β-折疊的比值和β-轉角相對含量均呈先減小后增大的趨勢,CR凝乳中的α-螺旋/β-折疊的比值和β-轉角相對含量隨溫度的升高呈先增大后減小的趨勢。與CR凝乳相比,TMR凝乳在45 ℃時的α-螺旋/β-折疊數(shù)值和β-轉角最小,無規(guī)卷曲含量達到最大值,說明TMR在45 ℃形成不規(guī)則的柔韌性和穩(wěn)定性良好的凝乳結構,且凝乳的柔韌性優(yōu)于CR凝乳,這與石彥國等[17]的研究結果一致。李柳等[34]的研究發(fā)現(xiàn)甲醇芽孢桿菌凝乳酶具有較強的疏水作用,而且其α-螺旋結構明顯少于β-折疊結構,因此凝乳酶容易發(fā)生降解。因此,凝乳二級結構的變化除了與溫度有關之外,還與凝乳酶的分子結構具有相關性。

        2.6 凝乳溫度對凝乳微觀結構的影響

        如圖7a所示,隨凝乳溫度的增加,TMR凝乳中的蛋白間隙呈先減少后增多趨勢;45 ℃ TMR凝乳中的酪蛋白膠束聚集形成密集的網(wǎng)狀結構;由圖7b可知,CR凝乳中的蛋白間隙隨溫度的升高不斷增大,凝乳結構逐漸疏松;35 ℃凝乳中的蛋白分布均勻,蛋白骨架也更飽滿,凝乳性能良好。這是因為在凝乳過程中,溫度的升高使酪蛋白膠束間的疏水作用增強[35-36]。TMR凝乳的水解度在35~45 ℃逐漸增大,酪蛋白膠束被破壞,酪蛋白分子在疏水基團的作用下聚集,形成穩(wěn)定的凝乳結構,與范金波等[37]的研究結果一致。當溫度高于45 ℃時,酪蛋白過度水解,導致凝乳中的蛋白間隙變大甚至發(fā)生斷裂,出現(xiàn)疏松的絮狀結構。趙笑[10]和賀殷媛[38]等的研究也發(fā)現(xiàn)類似的結果,即蛋白水解程度越高,蛋白聚集形成的間隙變大,凝乳結構變得越松散。2種凝乳的蛋白結構在45 ℃時差異最小,且TMR凝乳細膩柔軟,可塑性更強。

        圖7 凝乳的CLSM圖像Fig.7 CLSM images of curds

        3 結 論

        為了開發(fā)具有良好凝乳性能的新型凝乳酶,本實驗以實驗室自制TMR為研究對象,探究不同凝乳溫度對TMR凝乳行為、水解特性及凝乳結構的影響。結果表明,隨凝乳溫度的升高,TMR的蛋白水解活性被抑制,TMR的凝乳性能逐漸改善;當溫度超過45 ℃時,凝乳酶活性降低,凝乳結構變得疏松;與CR凝乳相比,TMR凝乳的持水力和乳清OD值在45 ℃趨于穩(wěn)定,粒徑顯著大于CR凝乳的粒徑,凝乳性能較好;同時,TMR凝乳在45 ℃形成了連續(xù)不規(guī)則且較為致密的網(wǎng)狀結構,有利于在干酪中應用。因此,TMR可作為小牛凝乳酶的替代品應用于干酪生產(chǎn)中。

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