董 浩，徐 燕，吳家大，冼燕萍，楊 娟，于立梅，錢 敏，曾曉房,*，白衛(wèi)東,*

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東 州 510225；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 廣東省嶺南特色食品科學與技術重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點實驗室，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程創(chuàng)新研究院，廣東 廣州 510225；3.廣州質量監(jiān)督檢測研究院，食品安全預警研發(fā)中心，廣東 廣州 510447）

雜環(huán)胺是富含蛋白質的食品在熱加工過程中由蛋白質、氨基酸、糖類以及其他物質發(fā)生美拉德反應或裂解反應而生成的一類致癌、致突變化合物[1-2]。迄今已經(jīng)從食品中分離和鑒定出約30種雜環(huán)胺，主要常見于油炸、油煎、燒烤類肉制品中[3-4]。按照化學結構和生成途徑的不同，雜環(huán)胺可分為兩大類，分別為氨基咪唑氮雜芳烴類和氨基咔啉類，其中氨基咪唑氮雜芳烴類雜環(huán)胺在200 ℃以下加熱條件下就能形成，而氨基咔啉類雜環(huán)胺一般在200 ℃以上由氨基酸或蛋白質受熱降解生成[5]。人體若攝入過多含有雜環(huán)胺的食物，將可能導致體內肝臟、胃腸道、膀胱、皮膚以及口腔等多種器官產(chǎn)生病變[6]。因此，肉制品熱加工過程中雜環(huán)胺的控制受到眾多相關研究人員的關注[7-9]。

肉制品中雜環(huán)胺的生成受到多種因素影響，如肉種類、烹調方式、加熱溫度和時間、前體物和脂質種類以及水分含量等，通過選擇合適的烹調方式和加工條件能夠一定程度減少雜環(huán)胺的生成[10]。大量研究表明，水煮等低溫烹飪方式相對于油炸等高溫烹飪方式會產(chǎn)生更少的雜環(huán)胺[11-16]。但由于油炸或者油煎過程能夠提升肉的風味，增進食欲，因此油煎等烹飪方式深受消費者喜愛。加熱溫度和時間是影響雜環(huán)胺種類和含量的主要因素，降低加工溫度、減少加工時間可有效降低雜環(huán)胺在肉制品中的生成[17]。雖然烹飪方式、加熱溫度、加熱時間等因素對肉制品中雜環(huán)胺的影響研究已有較多報道[18-22]，但研究多集中在加工條件對氨基咪唑氮雜芳烴類雜環(huán)胺生成的影響，且加工鍋具、食用油等熱加工條件對肉制品中雜環(huán)胺種類和含量的研究還相對較少[23-24]。

因此，本實驗以2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚（2-amino-3-methyl-9H-pyrido[2,3-b]indole，MeAαC）、2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚（2-amino-9H-pyrido[2,3-b]indole，AαC）、1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（1-methyl-9H-pyrido[3,4-b]indole，Harman）、9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（9H-pyrido[3,4-b]indole，Norharman）、3-氨基-1,4-二甲基-5H-吡啶并[4,3-b]-吲哚（3-amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido[4,3-b]-indole，Trp-P-1）和3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚（3-amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole，Trp-P-2）6種氨基咔啉類雜環(huán)胺為研究對象，建立一種同時測定豬肉餅中6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜檢測方法。重點研究加工條件（如油煎時間、油種類、鍋具、肉餅尺寸等）對6種氨基咔啉類雜環(huán)胺生成的影響，以期為烹飪條件的合理選擇和肉制品熱加工過程中雜環(huán)胺的減控提供數(shù)據(jù)支撐和方法指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

排酸后冷鮮豬肉，購自廣州市海珠區(qū)家樂福超市。

MeAαC、AαC、Harman、Norharman、Trp-P-1和Trp-P-2標準品（純度均大于0.995） 上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Merck公司；甲酸、乙酸銨（均為色譜純） 美國CNW公司；氨水（分析純） 國藥化學試劑有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉（均為分析純） 廣州化學試劑廠；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

StrataTM-X-C固相萃取柱（60 mg/3 mL） 美國Phenomenex公司；Ulimate 3000超高效液相色譜儀、Q Exactive Focus四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜 美國Thermo Fisher Scientific公司；MS3digital渦旋混合器美國IKA公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；N-EVAP 112水浴氮吹儀 美國OA公司；KQ-500E超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；KDC-40低速離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豬肉餅的制備

去除樣品肉中可見脂肪及筋膜，放入絞肉機制成肉糜，攪拌均勻后，稱取40 g肉糜制作不同直徑（4、6、8、10 cm）圓形肉餅，于4 ℃的冰箱中保存6～8 h備用。

1.3.2 樣品前處理

稱取1 g待測樣品于50 mL離心管中，加入4 mL 1.0 mol/L NaOH溶液和6 mL乙腈，均質30 s后加入1.5 g NaCl，渦旋2 min，4 500 r/min離心5 min，將上層溶劑轉移到15 mL玻璃管中，殘渣中再加入4 mL乙腈萃取1次，合并乙腈層，在40 ℃下氮吹至約2 mL，待凈化。

預先用甲醇、超純水、體積分數(shù)1%甲酸溶液各3 mL，將StrataTM-X-C固相萃取柱活化和平衡。將提取液全部通過StrataTM-X-C固相萃取柱（60 mg/3 mL）。依次用3 mL體積分數(shù)0.1%甲酸、3 mL超純水和3 mL甲醇淋洗，再用4 mL甲醇-氨水（90∶10，V/V）洗脫，洗脫液在40 ℃下氮吹至干，用流動相定容至1.0 mL，渦旋30 s，過0.22 μm濾膜，待超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜檢測。

1.3.3 雜環(huán)胺檢測

標準溶液的配制：分別稱取各標準品適量，用甲醇溶解并定容，配成單標儲備液；再用甲醇稀釋，配制成質量濃度為1.0 mg/L的混合標準溶液。使用時，用初始流動相（1 mmol/L乙酸銨溶液（含0.05%甲酸）-乙腈，95∶5，V/V）配制成不同濃度的混合標準工作液。

色譜條件：色譜柱Agilent Poroshell 120-EC-C18（150 mmh2.1 mm，2.7 μm），柱溫30℃；流動相A：1 mmol/L乙酸銨溶液（含0.05%乙酸）；流動相B：乙腈；梯度洗脫程序：0～1 min，90% A、10% B；1～6.5 min，90%～80% A、10%～20% B；6.5～7.5 min，80%～5% A、20%～95% B；7.5～9.0 min，5% A、95% B；9.0～10 min，5%～90% A、95%～10% B；10～12 min，90% A、10% B。進樣量5 μL；流速0.3 mL/min。

質譜條件：電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）源，正離子模式；噴霧電壓3.5 kV；毛細管溫度320 ℃；噴霧溫度250 ℃；鞘氣壓力45 arb；輔助氣壓力8 arb；S-LensRF電壓50 V；噴霧氣/碰撞氣：氮氣。利用正離子Full MS模式進行掃描，F(xiàn)ull MS一級全掃描范圍m/z50～650，分辨率70 000，自動增益控制106，自動注入時間100 ms；dd-MS2二級掃描自動增益控制105，分辨率17 500，自動注入時間60 ms，各化合物的歸一化碰撞能量設為80%、100%、120%，動態(tài)排除設為8 s。

1.3.4 基質效應計算

選取3種不同油煎條件制備的豬肉餅樣品混合均勻，添加不同濃度的混合標準工作溶液后，按照1.3.2節(jié)前處理后上機，以目標物定量離子峰面積為縱坐標，以標準品質量濃度為橫坐標進行回歸分析，獲得基質標準曲線；以初始流動相作為純溶劑，配制不同濃度混合標準工作溶液，獲得純溶劑標準曲線?；|效應為基質標準曲線斜率與純溶劑標準曲線斜率比值。

1.3.5 油煎豬肉餅的制備

將上述制備的豬肉餅（直徑8 cm）置于平底不粘鍋中煎制，固定油煎溫度225 ℃，加工5 min（2.5 min翻面），考察玉米油、花生油、菜籽油、橄欖油、大豆油5種家庭常用油對油煎豬肉餅中6種氨基咔啉類雜環(huán)胺含量的影響；使用花生油，固定油煎溫度225 ℃，考察不同油煎時間（1、2、3、4、5 min）對豬肉餅中6種氨基咔啉類雜環(huán)胺含量的影響。使用花生油，固定豬肉餅直徑8 cm、油煎溫度225 ℃，加工5 min（2.5 min翻面），考察不粘鍋、電磁鍋、鐵鍋和復合涂層鍋4種鍋具對油煎豬肉餅中6種氨基咔啉類雜環(huán)胺含量的影響。使用花生油、平底不粘鍋，固定油煎溫度225 ℃，加工5 min（2.5 min翻面），考察肉餅直徑（4、6、8、10 cm）對油煎豬肉餅中6種氨基咔啉類雜環(huán)胺含量的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003軟件處理數(shù)據(jù)，每組實驗平行測定3次，結果以 fs表示；采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，采用方差分析、Duncan多重范圍檢驗差異顯著性分析；使用Origin 8.1軟件進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 6種氨基咔啉類雜環(huán)的測定

6種氨基咔啉類雜環(huán)胺在ESI+模式下均得到[M+H]+的準分子離子峰。根據(jù)獲得的6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的一級質譜以及二級碎片離子質譜，得到6種氨基咔啉類雜環(huán)胺分子母離子分子質量的測定值和理論值、質量精確度。由表1可知，6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的質量偏差絕對值均小于3.0，符合歐盟指令2002/657/EC中的定性確證準則。根據(jù)保留時間與準確相對分子質量可實現(xiàn)對6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的準確定性。

2.2 方法性能

以3 倍信噪比確定方法檢出限，以10 倍信噪比確定方法定量限。以目標物定量離子峰面積為縱坐標，以標準品質量濃度為橫坐標進行回歸分析，得到6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的線性回歸方程。由表1可知，MeAαC、AαC、Harman、Norharman、Trp-P-1和Trp-P-2這6種氨基咔啉類雜環(huán)胺在相應質量濃度范圍內呈良好線性關系，相關系數(shù)（R2）均大于0.996。方法檢出限為0.02～0.15 μg/kg，定量限為0.05～0.5 μg/kg，表明方法具有較好的靈敏度。方法基質效應為0.93～1.16，基本可以忽略。

表1 6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的準確質量數(shù)測定數(shù)據(jù)和方法性能參數(shù)Table 1 Accurate mass number data of six amino-caroline HAAs and analytical figures of merit of the proposed method

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的確定

雜環(huán)胺結構中的氨基或環(huán)上的氮原子具有不同的解離常數(shù)（pKa），這使得6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的pKa值存在較大差異，MeAαC、AαC、Harman、Norharman、Trp-P-1和Trp-P-2的pKa值分別為7.08、6.79、8.62、7.85、10.88和10.59。提取溶劑的選擇需要同時兼顧不同非極性的雜環(huán)胺。此外，肉制品富含油脂，應盡量減少油脂的干擾。通過分析發(fā)現(xiàn)，極性過強的甲醇會提取出樣品中較多油脂等雜質，提取溶液呈黏稠狀，固相萃取凈化時容易堵塞固相萃取柱，增加后續(xù)凈化難度[25]。二氯甲烷和乙酸乙酯對雜環(huán)胺類化合物回收率較低，大部分目標雜環(huán)胺的回收率低于30%。而乙腈極性范圍大，其分子較小，具有較強的組織穿透能力和良好的沉淀效果，尤其是對脂肪、蛋白質類化合物，對6種氨基咔啉類雜環(huán)胺類化合物均有較高的提取率，提取溶液氮吹濃縮后殘留物較少。適當引入堿性水溶液有利于樣品分散，使目標化合物被更充分提取。因此，考察0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mol/L NaOH溶液對目標雜環(huán)胺的提取效率。由圖1A可知，隨著NaOH濃度的增大，6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的回收率整體呈上升趨勢，在NaOH濃度1 mol/L時回收率最佳，目標雜環(huán)胺的回收率均在68%以上，且在實驗過程中觀察到1 mol/L NaOH的提取溶液在氮吹濃縮時渾濁度最弱，氮吹濃縮后殘留物更少，基質效應低，表明提取出的油脂最少；原因可能是堿液加入使部分油脂皂化水解，起到一定的除脂效果[26]。但提取體系NaOH濃度過高（2 mol/L）時，則容易出現(xiàn)乳化，不利于分層，影響目標物在乙腈層的分配，從而降低了雜環(huán)胺的提取回收率。最終采用乙腈-1 mol/L NaOH溶液作為提取溶劑。

圖1 NaOH濃度（A）、NaCl添加量（B）、固相萃取柱（C）和洗脫液（D）對6種氨基咔啉類雜環(huán)胺提取回收率的影響Fig.1 Effects of NaOH concentration (A), NaCl addition (B), solid phase extractioncartridges (C) and eluents (D) on the recoveries of six amino-carboline HAAs

2.3.2 NaCl添加量的確定

研究發(fā)現(xiàn)，萃取過程中添加1 g NaCl可顯著提高1 g漢堡肉餅樣品中雜環(huán)胺的萃取效率，而添加超過1 g NaCl，鹽析效果并沒有顯著提高[27]。由圖1B可知，不添加NaCl時，6種氨基咔啉類雜環(huán)胺中只有MeAαC、Harman和Norharman的回收率在60%以上，其余均在60%以下，表明不添加NaCl時目標雜環(huán)胺的提取效果較差。添加1.0 g NaCl時，雜環(huán)胺提取回收率顯著提高，但AαC、Trp-P-1這兩種雜環(huán)胺的回收率仍低于70%。NaCl添加量1.5 g時，6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的提取回收率均相對較高；NaCl添加量增加到2.0、3.0 g時，大多數(shù)雜環(huán)胺的回收率變化不明顯。因此，最終選擇添加1.5 g NaCl以獲得較優(yōu)的目標雜環(huán)胺回收率。

2.3.3 固相萃取柱的選擇

比較StrataTM-X-C柱（60 mg/3 mL）、Cleanert PCX柱（60 mg/3 mL）、Waters Oasis MCX柱（60 mg/3 mL）3種陽離子交換型固相萃取柱對6種氨基咔啉類雜環(huán)胺提取回收率的影響。按照固相萃取柱填料的吸附原理優(yōu)化各自上樣溶液、淋洗和洗脫溶液。由圖1C可知，采用StrataTM-X-C柱凈化，6種氨基咔啉類雜環(huán)胺均可獲得較好的凈化效果，回收率在70%以上，儀器檢測顯示基質抑制效應降低。StrataTM-X-C柱為鍵合了苯磺酸官能團的強陽離子交換柱，與雜環(huán)胺上的—N+可形成較強的離子鍵，可以用水和甲醇充分淋洗進行除雜，提高目標雜環(huán)胺的提取回收率。采用Cleanert PCX柱和Waters Oasis MCX柱凈化，儀器檢測顯示基質抑制效應較強，目標雜環(huán)胺回收率較低。綜上所述，最終采用StrataTM-X-C固相萃取柱對提取溶液進行凈化。

2.3.4 洗脫液的確定

由圖1D可知，當氨水體積分數(shù)10%時，除AαC、Trp-P-2，其他4種氨基咔啉類雜環(huán)胺的提取回收率顯著增加，并達到最佳，而氨水體積分數(shù)達到20%和30%時，回收率顯著降低。在甲醇-氨水體積比90∶10，雜環(huán)胺整體回收率為64%～91%，優(yōu)于體積比為95∶5、80∶20和70∶30時的整體回收率。因此采用甲醇-氨水（90∶10，V/V）作為洗脫液。

綜上，最終確定6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的最優(yōu)提取和凈化條件為：1 g樣品中添加1.5 g NaCl、10 mL 1 mol/L NaOH溶液-乙腈（4∶6，V/V）提取，StrataTM-X-C柱凈化，甲醇-氨水（90∶10，V/V）洗脫。

2.4 油種類對油煎豬肉餅中6種氨基咔啉類雜環(huán)胺生成的影響

如表2所示，不同油對豬肉餅中6種氨基咔啉類雜環(huán)胺生成具有顯著影響，橄欖油煎制豬肉餅中6種雜環(huán)胺生成總量（4.37 μg/kg）低于其他4種油煎制豬肉餅。這可能是因為相比玉米油、花生油、菜籽油、大豆油，橄欖油中含有多酚等抗氧化物質更豐富，這些物質可通過清除參與雜環(huán)胺形成途徑中的自由基從而抑制雜環(huán)胺的生成[24]。有研究發(fā)現(xiàn)橄欖油、葵花籽油和榛子油等對雜環(huán)胺形成能起到抑制效果，原因可能是這幾種油中不飽和脂肪酸較多，會對雜環(huán)胺形成過程中的美拉德反應造成干擾，破壞反應進行，從而發(fā)揮抑制雜環(huán)胺形成的效果；也有研究認為是由于其中的共軛亞油酸具有較強的抗氧化作用，從而對雜環(huán)胺的形成產(chǎn)生抑制作用[28]。

表2 油種類對油煎豬肉餅中雜環(huán)胺生成的影響Table 2 Effects of cooking oil types on the formation of HAAs in pan-fried pork patties μg/kg

2.5 油煎時間對豬肉餅中6種氨基咔啉類雜環(huán)胺生成的影響

如表3所示，油煎時間對豬肉餅中雜環(huán)胺的產(chǎn)生具有顯著影響，隨著油煎時間的延長，Trp-P-2、MeAαC和Norharman 3種雜環(huán)胺的生成量顯著增加（P＜0.05）。Dong等[29]研究發(fā)現(xiàn)230 ℃煎炸16 min牛肉餡餅中Norharman和Harman的含量分別約為煎炸4 min樣品的18 倍和12 倍。

表3 油煎時間對油煎豬肉餅中雜環(huán)胺生成的影響Table 3 Effect of pan-frying time on the formation of HAAs in pan-fried pork patties μg/kg

2.6 油煎鍋具對豬肉餅中6種氨基咔啉類雜環(huán)胺生成的影響

如表4所示，采用不同鍋具油煎豬肉餅生成的雜環(huán)胺總量依次為不粘鍋＜電磁鍋＜鐵鍋＜復合涂層鍋的趨勢。使用不粘鍋（聚四氟乙烯涂層）和電磁鍋油煎過程中肉餅不粘連且受熱均勻，從而減少雜環(huán)胺的生成[10]。

表4 油煎鍋具對油煎豬肉餅中雜環(huán)胺生成的影響Table 4 Effect of pot types on the formation of HAAs in pan-fried pork patties μg/kg

2.7 肉餅直徑對豬肉餅中6種氨基咔啉類雜環(huán)胺生成的影響

肉的表面積和形狀也是影響熱加工豬肉餅中雜環(huán)胺類型和含量的重要因素之一[30]。如表5所示，油煎豬肉餅中雜環(huán)胺的種類及含量隨著豬肉餅直徑的減小顯著變化（P＜0.05）。在直徑8 cm和10 cm的肉餅中僅檢測到Norharman，含量分別為0.89 μg/kg和0.52 μg/kg。直徑6 cm時檢測到3種氨基咔啉類雜環(huán)胺，分別為AαC（0.05 μg/kg）、Harman（0.06 μg/kg）和Norharman（1.48 μg/kg），但當直徑為4 cm時，6種氨基咔啉類雜環(huán)胺均有檢出，總含量為29.33 μg/kg，遠高于10 cm的0.52 μg/kg。因此，肉制品尺寸對雜環(huán)胺生成含量有重要影響，豬肉餅直徑越小，雜環(huán)胺生成含量越高。

表5 肉餅尺寸對豬肉餅中雜環(huán)胺含量的影響Table 5 Effect of patty thickness on the formation of HAAs in pan-fried pork patties μg/kg

3 結 論

本研究首先建立一種超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜同時測定熱加工豬肉餅中6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的檢測方法。優(yōu)化后，1 g樣品選用1 mol/L NaOH溶液-乙腈作為提取試劑，添加1.5 g NaCl進行萃取，采用StrataTM-X-C柱凈化，用甲醇-氨水溶液（90∶10，V/V）洗脫。在上述條件下，6種氨基咔啉類雜環(huán)胺全部實現(xiàn)分離，且峰型良好。方法具有良好的穩(wěn)定性和準確性。進一步探究油煎條件對豬肉餅中雜環(huán)胺生成的影響。結果表明，油種類對雜環(huán)胺生成影響顯著，菜籽油煎制豬肉餅中雜環(huán)胺含量最高，橄欖油煎制豬肉餅中最低。采用不同鍋具煎制所產(chǎn)生的雜環(huán)胺含量為復合涂層鍋＞鐵鍋＞電磁鍋＞不粘鍋；不同尺寸豬肉餅煎制后產(chǎn)生的雜環(huán)胺含量也不同，豬肉餅直徑越小，雜環(huán)胺生成量越高。研究結果可為油炸肉制品中雜環(huán)胺的檢測和減控提供數(shù)據(jù)支撐和方法指導。