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        茅臺(tái)酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)的檢測及溯源

        2022-05-09 09:40:10胡光源陳宗校楊理章李永素王和玉
        食品科學(xué) 2022年8期
        關(guān)鍵詞:三萜類酒糟甾醇

        胡光源,陳宗校,楊理章,李永素,王和玉,王 莉*

        (1.貴州茅臺(tái)酒股份有限公司,貴州 遵義 564501;2.中國貴州茅臺(tái)酒廠(集團(tuán))有限責(zé)任公司,貴州 遵義 564501)

        酒糟是糧食用于釀酒后殘留的固態(tài)混合物,是白酒行業(yè)最主要的副產(chǎn)物。除水分外,酒糟中含有豐富的淀粉、粗蛋白、粗脂肪、氨基酸和微量元素[1],具有潛在的研究和應(yīng)用價(jià)值。然而目前酒糟的處理和應(yīng)用主要集中于提取蛋白質(zhì)、動(dòng)物飼料、丟糟酒、調(diào)味品、纖維素、食用菌培養(yǎng)基、乙醇燃料等的粗加工[2]及生產(chǎn)有機(jī)肥[3]等方面,關(guān)于酒糟中化學(xué)成分及其生物學(xué)功能的研究報(bào)道較少,通過對(duì)酒糟中生物活性物質(zhì)的發(fā)掘和研究,可提高酒糟的二次利用價(jià)值,實(shí)現(xiàn)利潤最大化。

        生育酚和生育三烯酚統(tǒng)稱VE,是人體必需的脂溶性維生素[4-5]。VE是一種強(qiáng)有效的抗氧化劑,具有提高機(jī)體免疫力、延緩衰老、神經(jīng)保護(hù)、抑制膽固醇合成及腫瘤細(xì)胞生長、預(yù)防動(dòng)脈硬化和心腦血管疾病等多種生理功能[6-7]。甾醇是一類以環(huán)戊烷多氫菲為骨架[8-9],與膽固醇結(jié)構(gòu)相似,類似于維生素原性質(zhì)的活性物質(zhì)[10],目前研究發(fā)現(xiàn),甾醇具有降低膽固醇[11-12]、抗菌[8]、抗炎[11,13]、鎮(zhèn)痛[11]、抗癌[14]、抗腫瘤[15]、免疫調(diào)節(jié)[16]、抗氧化[17-18]、預(yù)防心血管疾病[19]、抑制乳腺增生[20]等多種生物學(xué)功能;三萜類化合物是一類基本母核由30個(gè)碳原子組成的萜類化合物,是一類重要的中藥化學(xué)成分,這類化合物具有溶血[21]、抗病毒[22]、降低膽固醇[23]、神經(jīng)保護(hù)[24]等活性。這3類活性物質(zhì)均在醫(yī)藥、食品、化妝品、化工、紡織等行業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景。

        本研究擬建立超聲輔助提取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)法分析酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類生物活性物質(zhì)的方法,在茅臺(tái)酒糟中發(fā)現(xiàn)生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)共18種,可為酒糟中生物活性物質(zhì)的高效利用和開發(fā)奠定基礎(chǔ),同時(shí)也為酒糟的高附加值利用提供了新思路。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        茅臺(tái)酒糟、茅臺(tái)大曲,茅臺(tái)酒用高粱和小麥,均由貴州茅臺(tái)酒股份有限公司提供。

        α-生育酚(純度95.5%)、γ-生育酚(純度≥96%)、麥角甾醇(純度≥95%)、豆甾醇(純度95%)、羊毛甾醇(純度≥93%) 美國Sigma公司;膽甾烷醇(純度≥98%) 美國Alfa Aesar公司;菜油甾醇(純度≥99%) 百靈威科技有限公司;正丁醇、乙醚(均為分析純),丙酮(色譜純)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇、乙醇、二氯甲烷、正己烷(均為色譜純) 美國Tedia公司;乙腈、乙酸乙酯(均為色譜純) 德國Merck公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        7890A/5975C GC-MS聯(lián)用儀、HP-5毛細(xì)管色譜柱(30 mh0.25 mm,0.25 μm) 美國Agilent公司;Mikro 220R型離心機(jī) 德國Hettich公司;8800超聲波清洗機(jī) 美國Branson公司;KS 260搖床 德國IKA公司;MS1602TS電子天平 瑞士梅特勒公司。

        1.3 方法

        1.3.1 樣品前處理

        稱取5.00 g樣品(酒糟、大曲、高粱或小麥)于50 mL離心管中,加入適量提取溶劑,450 r/min搖床振蕩15 min混勻,超聲提取5 min,5 000 r/min離心5 min分層,上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,4 ℃保存待測。

        1.3.2 色譜條件

        色譜柱:HP-5毛細(xì)管色譜柱(30 mh0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:初始溫度60 ℃,以100 ℃/min升至300 ℃,保持16 min;采用恒流模式,載氣(He)流速1.0 mL/min,不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣量1 μL,進(jìn)樣口溫度300 ℃。

        1.3.3 質(zhì)譜條件

        電子電離源:電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃。定性采用全掃描模式,質(zhì)量掃描范圍m/z35~500;溶劑延遲:5.0 min;定量采用選擇離子掃描模式(single ion monitor,SIM),每個(gè)化合物選擇1個(gè)定量離子,2~3個(gè)定性離子。

        1.3.4 定量方法

        用正丁醇配制7種標(biāo)準(zhǔn)品的混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.3.2、1.3.3節(jié)的方法進(jìn)樣分析,以質(zhì)量濃度-峰面積建立標(biāo)準(zhǔn)曲線;將色譜峰信噪比大于3的質(zhì)量濃度確定為檢出限,信噪比大于10確定為定量限[25]。因本研究的重點(diǎn)是對(duì)酒糟中發(fā)現(xiàn)的生物活性物質(zhì)進(jìn)行定性和溯源分析,因三萜類物質(zhì)含量較低、且標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴,在不影響生物活性物質(zhì)溯源分析的前提下,只對(duì)部分化合物進(jìn)行了精確定量。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

        2.1.1 提取劑的選擇

        不同溶劑對(duì)樣品中化學(xué)成分的提取效率不同,本研究按照1.3.1節(jié)方法,在提取劑體積為10 mL及其他條件恒定下,對(duì)比乙酸乙酯、丙酮、乙醚、正己烷、正丁醇、乙醇、二氯甲烷、乙腈、甲醇對(duì)酒糟中生育酚類和甾醇類物質(zhì)的提取效果,為了簡化,以7種物質(zhì)(標(biāo)準(zhǔn)品)的總峰面積作為衡量指標(biāo)。如圖1所示,極性溶劑的提取效果整體比非極性溶劑好,其中極性溶劑正丁醇的提取效果最好,乙酸乙酯和丙酮的提取效果相當(dāng),而非極性的溶劑乙醚和正己烷的提取效果均較差,因此選擇正丁醇作為提取劑。

        圖1 提取溶劑對(duì)提取效果的影響Fig.1 Effect of solvent type on extraction efficiency

        2.1.2 提取劑用量的優(yōu)化

        在其他條件恒定下,考察料液比對(duì)提取效果的影響,如圖2所示。采用不同料液比對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行提取時(shí),提取效率會(huì)隨著料液比的減小而增加(提取效率/%=酒糟中7種定量化合物提取一次的總含量/酒糟中7種化合物的實(shí)際總含量×100),在料液比為1∶3(g/mL)時(shí),提取效率最高,達(dá)到80%,然后趨于平衡,在料液比為1∶4和1∶5(g/mL)時(shí),提取效率均保持在80%左右。盡管在料液比為1∶1(g/mL)時(shí),提取效率只有45%左右,但因酒糟中目標(biāo)化合物的含量較低,為提高檢出限、定量的準(zhǔn)確性、方法的經(jīng)濟(jì)性與環(huán)保性,最終選擇目標(biāo)化合物的峰面積最高,提取溶劑為5 mL,作為最優(yōu)提取劑用量,即料液比為1∶1(g/mL)。

        圖2 料液比對(duì)提取效果的影響Fig.2 Effect of solid-to-solvent ratio on extraction efficiency

        2.2 茅臺(tái)酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)的定性分析

        采用上述優(yōu)化的條件對(duì)酒糟進(jìn)行提取并經(jīng)GC-MS分析,通過質(zhì)譜信息和保留指數(shù)比對(duì)定性,共定性茅臺(tái)酒糟中5種生育酚類、9種甾醇類和4種三萜類生物活性物質(zhì),見表1。

        表1 茅臺(tái)酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)Table 1 Mass spectrometric parameters and retention indices of tocopherols, sterols and triterpenoids in Moutai distiller’s grains

        文獻(xiàn)報(bào)道此類物質(zhì)均具有一定的生物活性功能,生育酚和生育三烯酚是VE的兩大亞族,均存在α、β、γ和δ四種同分異構(gòu)體[26],其中4種生育酚均具有很強(qiáng)的抗氧化活性[27],生育三烯酚則具有抗氧化、降膽固醇、抗炎和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[28],其中在茅臺(tái)酒糟中發(fā)現(xiàn)的γ-生育三烯酚可以選擇性抑制結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展[29];麥角甾醇是決定細(xì)胞流動(dòng)性的真菌細(xì)胞膜的重要組成部分,其生物合成途徑是許多抗真菌劑的靶標(biāo)[30-31];菜油甾醇是重要的制造藥物類固醇的前體[32];豆甾醇具有免疫調(diào)節(jié)作用,在過敏性皮膚病的治療方面具有巨大潛力[33];γ-谷甾醇具有降血脂作用[34];羊毛甾醇是一種兩親分子,可有效阻礙晶狀體蛋白質(zhì)的聚集[35],并具有抗生物膜活性和抗群體感應(yīng)活性的功能[36];環(huán)阿屯醇具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗阿爾茨海默病等多種活性[37],β-扶桑甾醇氧化物具有一定的抗瘧疾活性[38];屬于三萜類的羽扇豆醇和5-麥谷蛋白-3-醇具有一定的抗癌活性[39]和良好的抗炎活性[40];24-亞甲基環(huán)阿屯醇具有抗糖尿病作用[41];乙酸羽扇醇酯具有與羽扇豆醇相似的生物活性和更高的生物利用度[42],可促進(jìn)皮膚修復(fù),作為活性物質(zhì)用于治療皮膚灼傷[43]。因此,本研究在茅臺(tái)酒糟中發(fā)現(xiàn)18種生物活性物質(zhì),不僅提高了對(duì)茅臺(tái)酒糟及茅臺(tái)酒中化學(xué)成分的認(rèn)識(shí),更為酒糟資源化利用提供了新思路。

        2.3 茅臺(tái)酒糟中生育酚類和甾醇類物質(zhì)的定量分析2.3.1 方法評(píng)價(jià)

        按照1.3節(jié)方法、2.1節(jié)優(yōu)化確定的條件及2.2節(jié)中各物質(zhì)的特征離子,對(duì)其中的7種化合物進(jìn)行定量,具體結(jié)構(gòu)見圖3,并對(duì)同一個(gè)酒糟樣品進(jìn)行連續(xù)6次相互獨(dú)立的測定,通過相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差考察方法的精密度;通過向樣品中添加適量標(biāo)準(zhǔn)品,并在優(yōu)化的條件下回收提取,測定加標(biāo)回收率(加標(biāo)回收率/%=(加標(biāo)酒糟提取的總含量-空白酒糟提取的總含量)/(加標(biāo)含量×單次提取率)h100),考察方法準(zhǔn)確度;將信噪比大于3的質(zhì)量濃度確定為檢出限,信噪比大于10確定為定量限。

        圖3 7種定量物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.3 Structures of 7 quantitatively analyzed substances

        如表2所示,7種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好,R2均大于0.99;在重復(fù)性條件下連續(xù)進(jìn)樣分析,酒糟中7種目標(biāo)物質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不高于6.40%,方法精密度較高;平行測定酒糟樣品和向其中加入已知濃度待測組分的加標(biāo)樣品,計(jì)算其加標(biāo)回收率,加標(biāo)回收率在88.9%~102.3%之間,加入的被測組分量可定量回收,方法準(zhǔn)確度較高。

        表2 方法評(píng)價(jià)指標(biāo)Table 2 Analytical figures of merit of the developed method

        2.3.2 酒糟中生育酚類、甾醇類物質(zhì)的含量

        酒糟中目標(biāo)物質(zhì)含量與第1次提取的量及提取率有關(guān),本研究按上述優(yōu)化確定的方法測定了酒糟提取液中目標(biāo)物質(zhì)的含量,并對(duì)同一酒糟樣品進(jìn)行反復(fù)提取,直至提取液中檢測不到任何目標(biāo)物質(zhì)。由于正丁醇對(duì)不同化合物的提取效果不同,具體提取次數(shù)和提取結(jié)果如表3所示。酒糟經(jīng)過3次提取后,儀器基本檢測不到膽甾烷醇和羊毛甾醇兩個(gè)化合物;而γ-生育酚、α-生育酚、麥角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇需提取8次,儀器才基本檢測不到。根據(jù)各提取液中目標(biāo)物的含量計(jì)算第1次提取率和在酒糟中的含量,7個(gè)目標(biāo)化合物的首次提取率在34.33%~58.74%,茅臺(tái)酒糟中7種生物活性物質(zhì)含量為0.85~133.09 mg/kg。

        表3 酒糟中生育酚類和甾醇類物質(zhì)的提取結(jié)果Table 3 Effect of number of extraction cycles on contents of tocopherols and sterols in Moutai distiller’s grains

        2.4 茅臺(tái)酒糟中生育酚、甾醇類和三萜類物質(zhì)的來源

        茅臺(tái)酒糟以高粱為主要原料,經(jīng)過多輪次蒸煮和發(fā)酵,每個(gè)輪次加入適量大曲(以小麥為主要原料生產(chǎn)的高溫大曲),因此茅臺(tái)酒糟中的生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)可能來源于高粱、大曲(小麥)或生產(chǎn)過程的生化反應(yīng)。

        表5 B班酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)含量跟蹤分析Table 5 Traceability analysis of tocopherols, sterols and triterpenoids contents in the distiller’s grains from class B

        為研究茅臺(tái)酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)的來源,跟蹤分析酒糟中此類物質(zhì)在1個(gè)輪次生產(chǎn)周期內(nèi)的含量,表4、5分別為兩個(gè)不同班組各1個(gè)窖的樣品跟蹤分析結(jié)果,δ-生育酚在6輪次生產(chǎn)前后含量升高22.2%~32.9%,主要來自固態(tài)蒸餾過程(表4、5中“拌殼~下甑”),其他物質(zhì)在1個(gè)輪次生產(chǎn)周期內(nèi)的含量變化均較小,即生產(chǎn)過程的生化反應(yīng)對(duì)此17種物質(zhì)的貢獻(xiàn)小,可能主要來源于釀酒原料,即高粱或(和)大曲(小麥)。

        表4 A班酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)含量跟蹤分析Table 4 Traceability analysis of tocopherols, sterols and triterpenoids contents in distiller’s grains from class A

        為此,進(jìn)一步分析生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)在原料和大曲中的含量如表6所示,δ-生育酚在小麥和大曲中未檢出,在高粱中的含量高于酒糟,綜合確定其來自高粱和蒸餾過程;環(huán)阿屯醇、羽扇豆醇和5-麥谷蛋白-3-醇在小麥和大曲中未檢出,γ-生育酚和乙酸羽扇醇酯的含量為高粱>酒糟>小麥、大曲,此5種物質(zhì)主要來自高粱;膽甾烷醇、β-生育酚、γ-生育三烯酚的含量為小麥>大曲>酒糟>高粱,主要來自小麥;麥角甾醇在高粱和小麥中的含量均顯著低于酒糟,但在大曲中的含量較高,該物質(zhì)主要來自制曲生產(chǎn)過程;β-扶桑甾醇氧化物在小麥中的含量高于高粱,但低于酒糟,而大曲中的含量顯著較高,該物質(zhì)主要來自小麥和制曲生產(chǎn)過程;24-亞甲基環(huán)阿屯醇在高粱和小麥中的含量略低于酒糟,大曲中的含量較高,主要來自高粱、小麥和制曲生產(chǎn)過程;α-生育酚、菜油甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇、γ-谷甾醇、豆甾-5,24(28)-二烯-3-醇來自高粱和小麥的共同貢獻(xiàn)。

        表6 原料和大曲中生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)的含量Table 6 Tocopherols, sterols and triterpenoids contents in raw materials and Daqu

        3 結(jié) 論

        建立了酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)的分析方法,實(shí)現(xiàn)茅臺(tái)酒糟中5種生育酚類、9種甾醇類和4種三萜類生物活性物質(zhì)的定性及其中7種物質(zhì)的定量分析,完成茅臺(tái)酒糟中上述18種生物活性物質(zhì)的溯源分析,確定了環(huán)阿屯醇、羽扇豆醇、5-麥谷蛋白-3-醇、γ-生育酚、乙酸羽扇醇酯主要來自高粱,膽甾烷醇、β-生育酚、γ-生育三烯酚主要來自小麥,δ-生育酚主要來自高粱和蒸餾過程,β-扶桑甾醇氧化物主要來自小麥和制曲生產(chǎn)過程,麥角甾醇主要來自制曲生產(chǎn)過程,24-亞甲基環(huán)阿屯醇主要來自高粱、小麥和制曲生產(chǎn)過程,α-生育酚、菜油甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇、γ-谷甾醇、豆甾-5,24(28)-二烯-3-醇來自高粱和小麥的共同貢獻(xiàn)。

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