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        咽炎片微生物限度檢查方法的構(gòu)建

        2022-05-09 08:22:44任仲麗曹魯娜李秀菊張裕民
        中國藥物經(jīng)濟學 2022年4期
        關鍵詞:試液咽炎稀釋液

        劉 博 任仲麗 曹魯娜 李秀菊 張裕民

        作者單位:菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院,山東菏澤 274000

        咽炎片主要由玄參、天冬、麥冬、板藍根、薄荷油等成分組成,具有養(yǎng)陰潤肺、清熱解毒、清利咽喉、鎮(zhèn)咳止癢功效[1]。因處方中的多味藥具有抑菌作用[2-8],根據(jù)《中華人民共和國藥典》2020年版四部1105 規(guī)定,采用增加稀釋液或培養(yǎng)基體積、加入適宜的中和劑或滅活劑、采用薄膜過濾法,上述幾種方法的聯(lián)合使用可消除供試品的抑菌活性。為了真實反映藥品中微生物污染狀況,本研究采用了常規(guī)法、增加培養(yǎng)基體積法和薄膜過濾法進行檢查,以期建立咽炎片的微生物限度檢查方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 樣品根據(jù)山東省藥品監(jiān)督管理局藥品質(zhì)量風險監(jiān)測項目要求,選取10 個不同生產(chǎn)企業(yè)的咽炎片樣品。

        1.1.2 菌種菌種微生物計數(shù)方法適用性試驗所用菌種為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003],控制菌檢查方法適用性試驗所用菌種為大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、乙型副傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphi-B)[CMCC(B)50094],由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供,試驗所用菌株為第3 代。

        1.1.3 儀器電子天平(JY2002,上海精密科學儀器有限公司)、高壓蒸汽滅菌器(mLS-3780,三洋)、細菌濁度分析儀(WGZ-2XJ,上海盺瑞儀器儀表有限公司)、生物安全柜(Class Ⅱ BSC,新加坡ESCD 公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH4000B Ⅱ,天津市泰斯特儀器有限公司)、霉菌培養(yǎng)箱(MJ-250F-1,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)、微生物限度檢驗儀(HTY-302G,杭州泰林生物技術股份有限公司)。

        1.1.4 培養(yǎng)基與試劑胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基等由北京陸橋技術股份有限公司提供。氯化鈉、聚山梨酯80 由天津市科密歐化學試劑有限公司提供。

        1.2 方法

        對10 個不同企業(yè)生產(chǎn)的咽炎片進行微生物方法適用性試驗。

        1.2.1 菌液制備將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門氏菌的新鮮培養(yǎng)物經(jīng)濁度計比濁后,用0.9%無菌氯化鈉溶液10 倍系列稀釋制成100~10 000 cfu/ml 的菌懸液;取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入10 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液(含0.05%聚山梨酯80)將孢子洗脫,經(jīng)濁度計比濁后,稀釋制成100~10 000 cfu/ml 的菌懸液,做活菌計數(shù)后備用。

        1.2.2 供試液的制備 稱取供試品10 g,加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml,溶解均勻后得1∶10的供試液。取1∶10 供試液1 ml 加pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液至10 ml,制成1∶100 的供試液,同理制得1∶1 000 的供試液。

        1.2.3 需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法的驗證

        1.2.3.1 常規(guī)法(1 ml/皿)試驗組:取5 個滅菌試管裝入9.9 ml 1.2.2 項下1∶10 的供試液,每個試管中依次加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌懸液0.1 ml;供試品對照組:取相應量的稀釋液代替菌液同試驗組操作;菌液對照組:取相應量的稀釋液替代供試液同試驗組操作[9]。以上各組吸取1 ml 注入平皿中,平行制備2 個平皿,傾注15~20 ml 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,置33 ℃培養(yǎng)3 d 計數(shù);分別取白色念珠菌、黑曲霉的實驗組、供試品對照組和菌液對照組各1 ml 注入平皿中,平行制備2 個平皿,傾注15~20 ml 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,置23 ℃培養(yǎng)5 d 計數(shù)。

        1.2.3.2 增加培養(yǎng)基體積(0.2 ml/皿)試驗組:取5 個滅菌試管裝入9.9 ml 1.2.2 項下1∶10 的供試液,每個試管中依次加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌懸液0.1 ml;供試品對照組:取相應量的稀釋液代替菌液同試驗組操作;菌液對照組:取相應量的稀釋液替代供試液同試驗組操作[9]。以上各組吸取2 ml 注入10 個平皿中,傾注15~20 ml 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,置33 ℃培養(yǎng)3 d 計數(shù);分別取白色念珠菌、黑曲霉的實驗組、供試品對照組和菌液對照組各2 ml 注入10 個平皿中,傾注15~20 ml 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,置23 ℃培養(yǎng)5 d 計數(shù)。

        1.2.3.3 薄膜過濾法試驗組:取1.2.2 項下1∶10的供試液1 ml 至100 ml pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,用稀釋液分3 次沖洗濾膜,100 ml/膜,在末次沖洗中依次加入制備好的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌懸液0.1 ml;供試品對照組:取相應量的稀釋液代替菌液同試驗組操作;菌液對照組:取相應量的稀釋液替代供試液同試驗組操作[9]。濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,平行制備2 個平皿,33 ℃培養(yǎng)3 d 計數(shù);分別取白色念珠菌、黑曲霉的實驗組、供試品對照組和菌液對照組各個濾膜,菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,平行制備2 個平皿,置23 ℃培養(yǎng)5 d 計數(shù)。

        1.2.4 回收率的計算試驗組菌回收率(%)=[(試驗組菌落數(shù)平均值-供試品對照組菌落數(shù)平均值)/菌液對照組菌落平均值]×100%,若3 次平行試驗中5 種菌回收率均在70%以上,則認為結(jié)果符合驗證試驗。

        1.2.5 控制菌的檢查

        1.2.5.1 耐膽鹽革蘭陰性菌取供試品10 g 用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基稀釋制成1∶10 供試液,混勻,20~25 ℃培養(yǎng)2 h[9],依次制成1∶100、1∶1 000的供試液。分別取1∶10、1∶100、1∶1 000 的供試液1 ml 接種至10 ml 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基作為供試品組;陽性對照組照供試品組配制,再加入小于100 cfu/ml 的大腸埃希菌和銅綠假單胞菌菌懸液;陰性對照組以稀釋液代替供試液,其他同供試品組。放置33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,上述培養(yǎng)物劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上,33 ℃培養(yǎng)24 h。

        1.2.5.2 大腸埃希菌取1.2.2 項下的1∶10 的供試液10 ml 接種至100 ml 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為供試品組;陽性對照組照供試品組配制,再加入小于100 cfu/ml 的大腸埃希菌菌懸液;陰性對照組以稀釋液代替供試液,其他同供試品組。置33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,將其1 ml 接種至100 ml 麥康凱液體培養(yǎng)基中,43 ℃培養(yǎng)48 h,之后劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上,33 ℃培養(yǎng)72 h[10]。

        1.2.5.3 沙門菌取10 g 供試品直接接種于100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,混勻,置30~35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24 h 作為供試品組;陽性對照組照供試品組配制,再加入小于100 cfu/ml 的乙型副傷寒沙門氏菌菌懸液;陰性對照組以稀釋液代替供試品,其他同供試品組。取上述培養(yǎng)物0.1 ml 接種至10 ml RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中,置33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,取RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上,33 ℃培養(yǎng)48 h[10]。

        2 結(jié)果

        不同企業(yè)樣品的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均低于50%。見表1。增加培養(yǎng)基體積可適當提高金黃色葡萄球菌的回收率,但枯草芽孢桿菌的回收率仍不能達到藥典的要求,又選擇薄膜過濾法再進行驗證。見表2。采用薄膜過濾法各試驗菌的回收率均符合要求。見表3??刂凭鷻z查采用常規(guī)法,陽性對照均檢出生長良好,陰性對照未檢出。見表4。

        表1 常規(guī)法需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)方法平均回收率(%)

        表2 增加培養(yǎng)基體積需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)方法平均回收率(%)

        表3 薄膜過濾法需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)方法平均回收率(%)

        表4 控制菌檢查驗證結(jié)果

        3 討論

        藥品微生物限度檢查指的是微生物對各種中藥、西藥的侵蝕及感染的程度,并對這種侵蝕程度進行實驗驗證,在規(guī)定的試驗條件下,檢查樣品中存在微生物的數(shù)量以及是否存在特定微生物[10]。在檢驗過程中易受到各種因素的影響,不僅要遵循藥品檢驗的相關標準,還要符合微生物的檢測要求,除了要牢記“無菌、快速、準確”外還要謹記微生物的特殊性[11]。以最大程度保證微生物檢測結(jié)果的準確性,降低誤差率。

        咽炎片處方中含有多種抑菌成分,具有抑菌作用的成分可影響微生物限度檢查的準確性[12]。雖然不同企業(yè)同名中藥制劑的成分基本相同,但其含量存在一定差異[13],同一種中草藥由于不同來源、季節(jié)性變化、植物不同部位、不同提取方法導致其成分也有差別[4]。為了保證檢查方法的可靠性,本研究通過對10 個不同企業(yè)生產(chǎn)的50 批次的咽炎片樣品進行了需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)及控制菌的方法驗證。結(jié)果表明金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌采用常規(guī)法和增加培養(yǎng)基體積法不能完全消除供試品的抑菌活性,說明咽炎片對需氧菌有較強的抑菌作用,應重新選擇適當?shù)姆椒ㄟM行驗證。含有抑菌成分的中成藥往往對這兩種菌有作用,這與相關研究一致[14-15]。為進一步驗證方法適用性結(jié)果的可行性,本研究選取了薄膜過濾法進行再驗證,結(jié)果表明,采用薄膜過濾法各種菌的回收率在70%以上,因此選擇薄膜過濾法(300 ml/膜)對咽炎片進行微生物計數(shù)檢查,符合方法適用性試驗要求。咽炎片的控制菌檢查方法有效性驗證試驗表明,10 個企業(yè)生產(chǎn)的50 批次的咽炎片均可使用常規(guī)法進行檢查。結(jié)果完全符合《中華人民共和國藥典》2020年版四部微生物限度檢查控制菌驗證要求,所以該方法可行。本試驗建立的方法準確、可靠,適用于咽炎片的微生物限度檢查。

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