何維，安天星，余玲，廖柯，唐揚(yáng)，劉迎濤，鄧婷，黃才森，趙志峰

(1.四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610065；2.成都太和坊釀造有限公司，成都 610501)

豆豉通常是以黃豆、黑豆等豆類物質(zhì)為原料，經(jīng)浸泡、蒸煮、制曲、拌料、后發(fā)酵而成[1]。按照微生物發(fā)酵的種類不同，可分為毛霉型、曲霉型、根酶型、細(xì)菌型及脈胞菌型五大類，其中毛霉豆豉以重慶潼川、四川永川、四川太和豆豉為典型代表[2-3]。豆豉在發(fā)酵成熟的過(guò)程中發(fā)生著復(fù)雜的化學(xué)變化，其中主要包括還原糖、蛋白質(zhì)、脂肪酸等含量的變化，使豆豉口感細(xì)膩綿軟[4-5]。其中最主要的變化是豆豉中的蛋白質(zhì)被分解為小分子的游離氨基酸與多肽，不但提高了食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還決定了發(fā)酵食品的滋味與風(fēng)味物質(zhì)的形成[6-11]。毛霉豆豉因具有獨(dú)特的多種生理活性物質(zhì)與獨(dú)特的風(fēng)味，且具有一定的藥用價(jià)值與食用價(jià)值，深受消費(fèi)者的歡迎。

毛霉型豆豉是我國(guó)傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵制品，一直深受人們的喜愛(ài)[12]。且大豆在微生物作用下不僅能很好地保留大豆原有的營(yíng)養(yǎng)成分，而且在其他微生物(如乳酸菌、酵母菌)的發(fā)酵過(guò)程中能產(chǎn)生一定量的大豆異黃酮、大豆抗氧化肽、大豆低聚糖、活性酶和亞麻酸等活性成分，具有抗癌、抗氧化、降血脂、調(diào)理腸胃等生理功能[13-14]。豆豉發(fā)酵過(guò)程中還原糖、氨基酸、風(fēng)味物質(zhì)等變化規(guī)律和特點(diǎn)有利于分析其產(chǎn)品品質(zhì)形成的機(jī)理。目前，四川太和豆豉產(chǎn)品品質(zhì)形成機(jī)理還未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)將總狀毛霉(Mucorracemosus)、米曲霉、總狀毛霉與米曲霉混合后以及接種于黃豆中，通過(guò)測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)期的還原糖、總酸、氨基態(tài)氮，再通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)法測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)期豆豉中風(fēng)味物質(zhì)含量的變化。探討不同菌種在太和豆豉發(fā)酵過(guò)程中基本成分的發(fā)酵規(guī)律，從而為進(jìn)一步推廣高品質(zhì)的毛霉型太和豆豉提供可靠的研究數(shù)據(jù)支持，為毛霉豆豉工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供研究數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

總狀毛霉M-THF-02：已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；米曲霉3.042：購(gòu)于山東沂源康源生物科技有限公司。

黃豆：產(chǎn)地黑龍江省訥河市。

硝酸銀、氫氧化鈉、甲醛、三氯乙酸、乳酸鈉、葡萄糖等試劑(均為分析純)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、麥麩培養(yǎng)基：成都鴻盛達(dá)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

試驗(yàn)儀器見(jiàn)表1。

表1 主要儀器設(shè)備一覽表Table 1 The main instruments and equipment

續(xù) 表

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同菌種豆豉的制備

純種毛霉豆豉的制作：大豆除雜→清洗→浸泡→常壓蒸煮→冷卻→接種→前發(fā)酵(25 ℃、72 h)→拌和(10%食鹽、1%白酒、)→入池后發(fā)酵(常溫發(fā)酵時(shí)間300 d以上)→成品。

米曲霉豆豉的制作：大豆除雜→清洗→浸泡→常壓蒸煮→冷卻→接種→前發(fā)酵(28 ℃、42 h)→拌和(10%食鹽、1%白酒)→入池后發(fā)酵(常溫發(fā)酵時(shí)間200 d以上)→成品。

米曲霉與毛霉混合發(fā)酵豆豉的制作：大豆除雜→清洗→浸泡→常壓蒸煮→冷卻→接種→前發(fā)酵(前期發(fā)酵溫度為25 ℃，48 h，后期發(fā)酵溫度為28 ℃)→拌和(10%食鹽、1%白酒)→入池后發(fā)酵(常溫發(fā)酵時(shí)間250 d以上)→成品。

將上述制備好的豆豉每隔30 d取樣測(cè)定其氨基態(tài)氮、總酸、還原糖含量以及風(fēng)味物質(zhì)含量。

1.3.2 理化指標(biāo)的測(cè)定

1.3.2.1 豆豉中還原糖含量的測(cè)定

以葡萄糖的含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：y=0.5002x-0.001，相關(guān)系數(shù)R2=0.9996 。采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定豉曲的還原糖含量。

1.3.2.2 豆豉中氨基酸態(tài)氮、總酸含量的測(cè)定

參照GB 5009.235—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》，采用甲醛法測(cè)定氨基酸態(tài)氮與總酸含量。

1.3.2.3 豆豉中香味物質(zhì)的提取方法

香味物質(zhì)采用頂空固相微萃取技術(shù)進(jìn)行提取[15]，取不同發(fā)酵時(shí)期的豆豉樣品5.0 g于20 mL的頂空瓶?jī)?nèi)，蓋上瓶蓋，置于60 ℃恒溫水浴鍋中平衡20 min，采用固相微萃取裝置將萃取頭手動(dòng)插入頂空瓶中，頂空吸附20 min后，直接將萃取頭注入氣相色譜儀進(jìn)樣口處，在230 ℃條件下脫附5 min。

1.3.2.4 香味物質(zhì)的分析鑒定方法

采用氣相色譜-質(zhì)譜分析法(GC-MS)對(duì)提取出來(lái)的香味物質(zhì)進(jìn)行分析。

氣相色譜(GC)條件：采用 DB-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，用氦氣作載氣，流速為1.0 mL/min。升溫程序：色譜柱起始柱溫40 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升到230 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜(MS)條件：采集方式：全掃描，質(zhì)量采集范圍 40～400 m/z；電離方式：電子轟擊(EI)；發(fā)射能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：230 ℃。

1.3.2.5 豆豉香味物質(zhì)分析定量方法

采用面積歸一法定量，通過(guò)豆豉中各組分的峰面積與各組分峰面積總和的比值來(lái)表示，按下式計(jì)算各個(gè)組分的相對(duì)含量：

式中：Ci為待測(cè)組分i的含量；Ai為待測(cè)組分i的峰面積；Si為各組分峰面積之和。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種豆豉發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)的變化

由圖1～圖3中3種不同菌種豆豉在發(fā)酵過(guò)程中的變化趨勢(shì)可以看出，3種豆豉在發(fā)酵過(guò)程中總酸與氨基態(tài)氮的含量都呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，而還原糖的生成速率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，其主要有兩方面的原因：一方面，由于微生物的生長(zhǎng)，消耗速率增加，從而導(dǎo)致豆豉還原糖含量降低[16]；另一方面，由于豆豉本身在發(fā)酵過(guò)程中環(huán)境所帶微生物代謝糖類等物質(zhì)形成乳酸和乙酸等有機(jī)酸，這也是導(dǎo)致還原糖含量降低的原因[17]。3種豆豉在常溫發(fā)酵過(guò)程中，氨基態(tài)氮含量、總酸含量由高到低的順序?yàn)槊浊苟刽?毛霉與米曲霉混合發(fā)酵豆豉>毛霉豆豉；其主要原因是毛霉菌種與米曲霉發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酶活力不同，毛霉豆豉主要以酸性蛋白酶為主；米曲霉豆豉主要以產(chǎn)生中性蛋白酶為主，這些主要成分的差異也有可能導(dǎo)致這3種豆豉口味不同，毛霉豆豉的風(fēng)味明顯高于米曲霉豆豉。

a

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c

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2.2 不同菌種發(fā)酵豆豉中香味物質(zhì)分析結(jié)果

圖4 不同菌種發(fā)酵豆豉香味物質(zhì)總離子流圖Fig.4 Total ion flow diagram of flavor compounds in fermented black beans fermented by different strains

表2 不同菌種發(fā)酵豆豉香味物質(zhì)對(duì)比Table 2 Comparison of flavor compounds in fermented black beans fermented by different strains

續(xù) 表

續(xù) 表

由圖5和圖6可知，豆豉1號(hào)共檢測(cè)出55種香味物質(zhì)，其中烴類10種，占總相對(duì)含量的2.83%；醇類10種，占總相對(duì)含量的37.03%；醚類1種，占總相對(duì)含量的0.44%；酮類2種，占總相對(duì)含量的0.24%；醛類6種，占總相對(duì)含量的8.05%；酸類1種，占總相對(duì)含量的3.45%；酯類20種，占總相對(duì)含量的46.98%；吡咯類1種，占總相對(duì)含量的0.13%；吡嗪類2種，占總相對(duì)含量的0.76%；其他類2種，占總相對(duì)含量的0.10%。豆豉2號(hào)共檢測(cè)出64種香味物質(zhì)，其中烴類20種，占總相對(duì)含量的3.7%；醇類11種，占總相對(duì)含量的25.73%；醚類1種，占總相對(duì)含量的9.51%；酮類1種，占總相對(duì)含量的0.07%；醛類6種，占總相對(duì)含量的6.20%；酸類2種，占總相對(duì)含量的4.08%；酯類21種，占總相對(duì)含量的50.54%；吡咯類1種，占總相對(duì)含量的0.04%；吡嗪類1種，占總相對(duì)含量的0.12%。豆豉3號(hào)共檢測(cè)出76種香味物質(zhì)，其中烴類26種，占總相對(duì)含量的18.54%；醇類10種，占總相對(duì)含量的17.35%；醚類3種，占總相對(duì)含量的17.62%；酮類2種，占總相對(duì)含量的1.03%；醛類10種，占總相對(duì)含量的6.98%；酯類22種，占總相對(duì)含量的37.91%；吡咯類1種，占總相對(duì)含量的0.45%；其他類2種，占總相對(duì)含量的0.11%。

圖5 不同菌種發(fā)酵豆豉中不同種類香味物質(zhì)相對(duì)含量統(tǒng)計(jì)圖Fig.5 Statistical chart of relative content of different flavor compounds in fermented black beans fermented by different strains

圖6 不同菌種發(fā)酵豆豉中不同種類香味物質(zhì)種數(shù)統(tǒng)計(jì)圖Fig.6 Statistical chart of species number of differentflavor compounds in fermented black beans fermented by different strains

這3種不同菌種發(fā)酵的豆豉主要的香味物質(zhì)種類為烴類、醇類、醚類、酮類、醛類、酯類和吡咯類；3種豆豉香味物質(zhì)種類占比最高的均為酯類。

2.3 不同菌種發(fā)酵豆豉中主體香味物質(zhì)分析

為了進(jìn)一步分析3種不同菌種發(fā)酵的豆豉香味物質(zhì)的差異，選取每種豆豉中檢測(cè)到的香味物質(zhì)相對(duì)含量≥1%的物質(zhì)單獨(dú)剔除進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同菌種發(fā)酵豆豉主體香味物質(zhì)分析Table 3 Analysis of main flavor compounds in fermented black beans fermented by different strains

由圖7可知，3種豆豉主體香味物質(zhì)種數(shù)分別為14，19，17種，主體物質(zhì)總相對(duì)含量分別為84.49%、93.38%和92.27%。

圖7 不同菌種發(fā)酵豆豉主體香味物質(zhì)總相對(duì)含量和種數(shù)分析Fig.7 Analysis of total relative content and species number of main flavor compounds in fermented black beans fermented by different strains

3種豆豉所含主體香味物質(zhì)種類均包括烴類、醇類、醛類和酯類，除此以外，豆豉1號(hào)所含主體香味物質(zhì)種類還包括醚類，豆豉2號(hào)包括醚類和酸類，豆豉3號(hào)包括酸類。(+)-檸檬烯為3種樣品共有的烴類主體香味物質(zhì)，(+)-檸檬烯具有類似檸檬的香味；芳樟醇為3種樣品共有的醇類主體香味物質(zhì)，芳樟醇具有鈴蘭香氣；苯甲醛和苯乙醛為3種樣品共有的醛類主體香味物質(zhì)，其中苯甲醛具有苦杏仁、櫻桃及堅(jiān)果香，苯乙醛具有類似風(fēng)信子的香氣，稀釋后具有水果的甜香氣；己酸乙酯、苯乙酸乙酯、十六酸乙酯和安息香酸乙酯為3種樣品共有的酯類主體香味物質(zhì)，其中己酸乙酯具有酒曲香、菠蘿香型的香氣，苯乙酸乙酯具有濃烈而甜的蜂蜜香氣，十六酸乙酯具有微弱蠟香、果爵和奶油香氣，安息香酸乙酯具有水果氣味。

綜上所述，3種豆豉所含主體香味物質(zhì)種類均包括烴類、醇類、醛類和酯類，除此以外，豆豉1號(hào)所含主體香味物質(zhì)種類還包括醚類，豆豉2號(hào)包括醚類和酸類，豆豉3號(hào)包括酸類。豆豉1號(hào)呈現(xiàn)出較濃的茴香、酒曲香和稍淡的檸檬香、鈴蘭香以及淡淡的水果香、油脂香；豆豉2號(hào)呈現(xiàn)出較濃的微帶果香的酒香和稍淡的茴香、酒曲香以及淡淡的果香和鈴蘭香；豆豉3號(hào)呈現(xiàn)出濃郁的酒香和稍淡的酒曲香、辛辣蘋果白蘭地香氣以及淡淡的水果香和青草香。

3 結(jié)論

本文以毛霉豆豉、米曲霉豆豉、毛霉+米曲霉型豆豉為研究對(duì)象，研究3種不同菌種對(duì)太和豆豉中的還原糖、總酸、氨基態(tài)氮理化指標(biāo)的影響，以及進(jìn)行發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)變化的測(cè)定。結(jié)果顯示：3種不同菌種對(duì)在豆豉發(fā)酵1～7個(gè)月過(guò)程中，米曲霉豆豉、毛霉豆豉、米曲霉+毛霉豆豉中的總糖含量呈逐漸下降的趨勢(shì)，而總酸與氨基態(tài)氮的含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；其主要原因是豆豉在后發(fā)酵過(guò)程中在蛋白水解酶的作用下將蛋白質(zhì)與多肽進(jìn)一步分解為游離氨基酸。采用GC-MS測(cè)定3種不同菌種發(fā)酵的太和豆豉中的揮發(fā)性成分，其中在毛霉豆豉中檢測(cè)出76種揮發(fā)性成分，米曲霉豆豉中有55種揮發(fā)性成分，米曲霉+毛霉豆豉中有64種揮發(fā)性成分，3種豆豉中最主要的成分包括烴類、醇類、醚類、酮類、醛類、酯類和吡咯類。毛霉豆豉的風(fēng)味物質(zhì)明顯高于米曲霉豆豉與毛霉+米曲霉豆豉，其原因可能是毛霉豆豉發(fā)酵周期長(zhǎng)，成熟期較長(zhǎng)，其酶主要產(chǎn)酸性蛋白酶，而米曲霉以中性蛋白酶為主；但其品質(zhì)與口感明顯高于米曲霉豆豉，這也是消費(fèi)者喜歡毛霉豆豉的原因。通過(guò)對(duì)不同菌種在太和豆豉發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)分析以及風(fēng)味物質(zhì)的分析，從而對(duì)太和豆豉的發(fā)酵過(guò)程有了進(jìn)一步的了解，同時(shí)也為豆豉發(fā)酵過(guò)程奠定了理論基礎(chǔ)。研究表明，傳統(tǒng)發(fā)酵食品如泡菜、豆醬、醬油等食品的風(fēng)味物質(zhì)主要取決于發(fā)酵過(guò)程中酵母菌與乳酸菌的作用[18-19]。對(duì)豆豉發(fā)酵后菌群研究表明，乳酸菌與酵母在豆豉發(fā)酵后也占主體地位，而且對(duì)豆豉色澤、香味起著重大的意義[20]。太和豆豉風(fēng)味的形成是微生物代謝及食物組分相互作用的結(jié)果，其微生物菌群的變化和各種風(fēng)味物質(zhì)形成的機(jī)理還需進(jìn)一步探討與研究，以期為指導(dǎo)豆豉的工業(yè)化與規(guī)模化生產(chǎn)提供更多的理論基礎(chǔ)。