張 銘,張 莉,冉 挺,段緒紅,趙聰格,魏計超,蘇彥雷

1.石家莊平安醫(yī)院藥械科,石家莊 050000;2.廈門大學藥學院,廈門 361102;3.河北中醫(yī)學院藥學院,石家莊 050200;4.解放軍第260醫(yī)院藥械科,石家莊 050041;5.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院,石家莊 050001;6.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八〇醫(yī)院臨床藥學科,石家莊 050082

絡石藤始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為上品,為抗風濕中藥,化學成分包括木質(zhì)素類、黃酮類、萜類、生物堿類等化合物,現(xiàn)代藥理實驗也證實其具有抗炎作用[1-2]。查閱石家莊平安醫(yī)院2019年～2020年治療類風濕的中藥處方,分析后發(fā)現(xiàn)中藥絡石藤的臨床應用頻率較高,此外,一些抗風濕中成藥如通絡開痹片、舒筋活血膠囊等處方中也均含有絡石藤,但絡石藤相關的藥理研究報道多為粗提物,其發(fā)揮抗炎作用的藥效物質(zhì)基礎并未被明確闡釋。本研究選取絡石藤中牛蒡子苷元、牛蒡子苷、絡石苷元B為目標化合物,以炎癥信號轉(zhuǎn)導中的關鍵激酶P38αMAPK 為研究靶點[3-11],參照其抑制劑SB-203580[12-13]、BIRB-796[14-17]與靶酶的分子間相互作用模式,利用分子對接軟件Autodock Vina探究牛蒡子苷元、牛蒡子苷、絡石苷元B與P38αMAPK的分子間作用結合模式。實驗發(fā)現(xiàn),牛蒡子苷元、牛蒡子苷與標靶蛋白活性位點存在較強的相互作用,而絡石苷元B的相互作用較弱以至于不能穩(wěn)定地占據(jù)該活性位點,故絡石苷元B對P38αMAPK 激酶無相關抑制作用。牛蒡子苷元和牛蒡子苷可競爭性阻斷靶酶活性位點與三磷酸腺苷（ATP）的結合,抑制靶酶的生物學活性,從而阻斷P38αMAPK 介導的炎癥通路信號轉(zhuǎn)導,抑制炎癥因子的生成,發(fā)揮抗炎藥理作用,本研究結果與牛蒡子苷元、牛蒡子苷的抗炎藥理實驗結果相一致。牛蒡子苷元和牛蒡子苷應該是中藥絡石藤發(fā)揮抗風濕作用的活性代表成分,二者可能通過抑制P38αMAPK 炎癥通路而發(fā)揮抗炎藥理作用。本研究從分子間相互作用層面闡釋了二者的抗炎機制,研究得出了牛蒡子苷元、牛蒡子苷抗炎藥理作用的一個重要靶點,亦為具有抗炎活性的新型p38α激酶抑制劑的設計提供了新的參考,值得進行深入研究。

1 實驗方法

1.1 小分子配體及靶標蛋白的選擇

在分子對接實驗過程中,選取絡石藤中的牛蒡子苷元、牛蒡子苷、絡石苷元B為分子對接的配體（見圖1）,設定經(jīng)典抑制劑SB-203580、BIRB-796為陽性對照配體,用以驗證對接方法的科學性和可靠性,進行與P38α的分子對接。小分子配體的化學結構見圖1。

圖1 小分子配體的結構Fig.1 The structures of smalll molecule ligands

P38MAPK激酶家族中的α亞型主要與炎癥信號轉(zhuǎn)導有關,是近30多年來研究的一個重要抗炎靶點。P38αMAPK結構中含有多個與底物分子結合的空腔結合位點[18-21],如底物ATP 占據(jù)了靶酶結構中的AB、SB、PB區(qū)域,抑制劑SB-203580則占據(jù)P38αMAPK 的AB區(qū)域、HP Ⅰ疏水區(qū)域、PB 區(qū)域;抑制劑BIRB-796占據(jù)HP Ⅰ疏水區(qū)域、HPⅡ區(qū)域、SP 區(qū)域、PB區(qū)域以及Phe169苯丙基移動大約10?[22]后所暴露的變構疏水口袋,BIRB-796嗎啉環(huán)上氧原子與靶酶Met109形成氫鍵,其脲上的氧原子與Asp168殘基形成氫鍵相互作用,脲中的氫原子與Glu71形成氫鍵相互作用,叔丁基結合在了變構疏水口袋,倘若將BIRB-796的叔丁基換為甲基則活性降低1 000倍以上。靶酶與SB-203580共結晶所得結構為1A9U,稱為DFG-in構象;與BIRB-796 共結晶所得結構為1KV2,稱為DFG-out構象。1A9U 與1KV2是同一蛋白的2 種不同構象,將兩者結構進行三維空間上的疊合,區(qū)別僅在于1KV2較1A9U 多出一個便于底物結合的疏水空腔,即DFG-out構象中Phe169的苯環(huán)從親脂口袋外翻并指向了ATP 結合區(qū)域從而暴露出了變構疏水口袋,DFG 基序所在的活化環(huán)域（A-loop）略微向外翻騰。見圖2。此外,分析發(fā)現(xiàn),HPⅠ疏水區(qū)域由Val38、Ala51·12345678s53、Leu75、Leu104、Thr106等組成[23-25],HPⅡ空腔區(qū)域由Val30、Ala40、Ile84、Leu108、Ala111、Asp112、Met109 等組成[24,26],變構疏水口袋由Leu74、Met78、Val83、Ile141、Ile166 等組成[27]。

圖2 1KV2與1A9U 的三維結構疊合Fig.2 The overlap of three dimensional structure between 1KV2 and 1A9U

考慮配體分子的柔性變化和體積較大,故選定1KV2 為本研究中進行分子對接的靶標蛋白,將BIRB-796、牛蒡子苷元、牛蒡子苷、絡石苷元B 與其進行分子對接研究,此外,將SB-203580與1a9u進行分子對接實驗,2個陽性對照配體的實驗結果分別與原有結合構象進行三維空間的疊合用以驗證對接方法是否具有科學性、可靠性。

1KV2三維結構主要由8個α螺旋、9個β折疊及無規(guī)卷曲組成,有生物學活性作用的位點主要由β折疊及2個螺旋及無規(guī)卷曲組成。蛋白疏水的溝槽位于蛋白的表面,小分子抑制性配體結合于此活性位點妨礙正常底物的進入與結合,從而起到阻斷炎癥信號通路傳導的作用。

1.2 分子對接及運算過程

本實驗的研究方法采用筆者之前報道的實驗方法[28]。

1.2.1 配體處理 利用Chemdraw 14.0處理小分子的結構,采用MM2力場進行能量最小化優(yōu)化保存成mo12格式,用MGLTools1.5.6處理,通過加氫,計算電荷及合并非極性氫后保存成pdbqt文件。

1.2.2 受體處理 從PDB 數(shù)據(jù)庫獲得蛋白三維結構,用MGLTools1.5.6處理蛋白結構,通過加氫、計算電荷、合并非極性氫后保存成pdbqt文件。

1.2.3 利用分子對接軟件Autodock Vina進行對接處理 以蛋白的活性位點（centerx=33.326,centery=33.725,centerz=17.372）為中心,構建一個60×40×60的盒子,通過Vina運算生成pdbqt文件。

1.2.4 結果處理 Py MOL1.7.2.1 軟件打開生成pdbqt文件,并打開1KV2蛋白結構,保存成復合物pdb文件,并進行相關作圖處理與分析。

2 分子對接的結果及分析

2.1 陽性化合物的對接結果

實驗研究結果顯示,SB-203580 和BIRB-796 均結合于原活性位點處,配體BIRB-796的對接構象與原晶體構象疊合時,均方根偏差（RMSD）計算為0.426?,配體SB-203580的對接構象與原晶體構象疊合時RMSD 計算為0.867,均小于2,說明對接結果是相對可靠的。見圖3和圖4。此外,BIRB-796、SB-203580 對接時產(chǎn)生的結合能分別為-11.0、-8.9 kal·mol-1,說明BIRB-796 與P38αMAPK 的結合能力強于SB-203580,這也與實際藥理實驗中BIRB-796對P38α的抑制活性明顯強于SB-203580的實驗結果[27]一致。

圖3 BIRB-796與靶標蛋白1KV2的對接配體對接構象（綠）與原晶體構象（紫）疊合Fig.3 The docking conformation （green）of BIRB-796 with the docking ligand of the target protein 1KV2 overlaps with the original crystal conformation （purple）

圖4 SB-203580與靶標蛋白1A9U 的對接配體對接構象（綠）與原晶體構象（紫）疊合Fig.4 The docking conformation （green）of SB-203580 with the docking ligand of target protein 1A9U overlaps with the original crystal conformation（purple）

2.2 目標化合物對接結果

通過分析Vina對接結果發(fā)現(xiàn),牛蒡子苷元、牛蒡子苷、絡石苷元B 與p38αMAPK 的上述結合位點產(chǎn)生一定的相互作用,小分子配體結合于1KV2蛋白,以pymol作圖,蛋白以cartoon形式顯示,對接結果見圖5。

圖5 牛蒡子苷元（1）、牛蒡子苷（2）、絡石苷元B（3）結合于1KV2的示意圖Fig.5 The binding mode of arctigenin（1）,arctiin（2）,trachelosperogenin B（3）with 1KV2

通過分析Vina對接結果發(fā)現(xiàn),牛蒡子苷元配體主要通過疏水、范德華力結合于1KV2結構中的活性位點,主要與Lys53、Arg70、Glu71、Leu74、Leu75、Met78、Val83、Ile84、Ile146、Ile147、Arg149、His148、Ile166、Leu167、Asp168、Phe169 等氨基酸殘基發(fā)生相互作用（見圖6）,推測牛蒡子苷元占據(jù)了p38α的PB區(qū)域、變構疏水口袋及其他新區(qū)域,與1KV2靶點蛋白對接產(chǎn)生的能量為-8.3 kal·mol-1。

圖6 牛蒡子苷元配體結合1KV2蛋白（a）與結合二維平面（b）示意圖Fig.6 The docking of arctigenin with 1KV2（a）and 2D view of binding mode（b）

牛蒡子苷配體主要通過疏水、范德華力結合于1KV2結構中的活性位點;主要與Tyr35、Leu55、Arg70、Glu71、Leu74、Leu75、Met78、Val83、Ile84、Ile146、Ile147、His148、Arg149、Leu167、Asp168、Phe169、Glu328等氨基酸殘基發(fā)生相互作用（見圖7）,小分子配體的羥基氫和Glu71氧原子形成氫鍵,鍵長為2.7?;糖環(huán)上的氫與Phe169上的氧形成氫鍵,氫鍵鍵長2.5?,推測牛蒡子苷占據(jù)p38α的PB區(qū)域、變構疏水口袋及其他新區(qū)域,對接能量為-8.0 kal·mol-1。

圖7 牛蒡子苷配體結合1KV2蛋白（a）與結合二維平面（b）示意圖Fig.7 The docking of arctiin with 1KV2（a）and 2D view of binding mode（b）

絡石苷元B 配體主要通過疏水、范德華力結合于1KV2結構中的活性位點;主要與Arg67、Arg70、Glu71、Leu74、Leu75、Met78、Val83、Ile84、Ile146、Arg149、His148、Ile166、Leu167和Asp168等氨基酸殘基發(fā)生相互作用（見圖8）,小分子配體的羥基氫和Asp168氧原子形成氫鍵,鍵長為2.1?;與His148上的N 形成氫鍵,鍵長為2.2?,推測絡石苷元B 占據(jù)p38αMAPK 的變構疏水口袋及其他新區(qū)域,對接能量為-4.4 kal·mol-1。

圖8 絡石苷元B配體結合1KV2蛋白（a）與結合二維平面示意圖（b）Fig.8 The docking of collagenin B with 1KV2（a）and 2D view of binding mode（b）

3 結論

P38MAPK（α亞型）是一個國際公認的介導炎癥通路信號傳遞的激酶,至今已有幾十年的研究歷史,對P38α激酶進行抑制可減少炎癥因子生成從而產(chǎn)生抑制機體炎癥反應的作用,例如SB-203580、BIRB-796等P38αMAPK 抑制劑均可在細胞水平降低LPS刺激而誘導多種炎癥因子（包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等）的生成,但多個P38α激酶的強效抑制劑均以臨床試驗失敗而告終,原因在于P38α激酶的生物學作用廣泛,所以P38α激酶的弱作用抑制劑或者其下游炎癥通路的激酶可能應該更適合作為研究抗炎作用的方向。本研究通過分子對接手段發(fā)現(xiàn),牛蒡子苷元和牛蒡子苷均是以非共價鍵結合方式作用于靶蛋白P38α的PB區(qū)域活性位點、變構疏水口袋,均能競爭性的抑制P38α靶酶從而抑制該酶下游底物分子的活化,阻礙炎癥通路信號轉(zhuǎn)導起到抗炎作用,且二者對接結合能與SB-203580相接近,推測牛蒡子苷元和牛蒡子苷對P38αMAPK 的抑制活性極可能與SB-203580相近。絡石苷元B占據(jù)p38α的變構疏水口袋及其他活性位點以外的新區(qū)域,并未作用于ATP的結合活性位點,故對于ATP與p38α激酶的結合無競爭性抑制作用,并且與P38α激酶的結合作用較弱,故推測絡石苷元B 對P38α靶酶無抑制作用。而后續(xù)查閱相關文獻發(fā)現(xiàn),有多個藥理實驗研究證實[29-34],牛蒡子苷元和牛蒡子苷具有抗炎作用,即二者可抑制脂多糖LPS誘導下的巨噬細胞產(chǎn)生的多種炎癥因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等）,藥理實驗結果與筆者的研究結論相一致,但二者發(fā)揮抗炎作用的靶酶及作用機制并未見文獻報道。本研究從分子間相互作用的角度,闡釋了二者抗炎藥理作用的機制,牛蒡子苷元和牛蒡子苷與P38αMAPK 的活性位點存在較好的分子間結合作用,可競爭性阻礙該活性位點與ATP 的結合,能通過抑制P38αMAPK 而發(fā)揮減少炎癥因子生成的抗炎作用,同時也為P38αMAPK 新型抑制劑的設計及進一步的分子結構改造提供了一定的參考價值。新頒布的藥品法也再次強調(diào)了藥品創(chuàng)新的重大意義,并且也指出中醫(yī)藥是現(xiàn)階段創(chuàng)新研究的巨大資源寶庫,故利用現(xiàn)代化技術手段,發(fā)掘中藥藥效物質(zhì)基礎成分,推動藥物創(chuàng)新,這也正是當代科學研究人員應該做的工作。