左漢恒， 李銀平△， 黃劍鋒， 朱文雅， 肖善花， 黃紹烈

(1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)監(jiān)護(hù)室，山東 濟(jì)寧 272013； 2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院a.超聲科；b.腎內(nèi)科； c.心內(nèi)科，南昌 330006)

心肌缺血/再灌注損傷引起心肌細(xì)胞死亡包括壞死和凋亡兩種方式。在缺血/再灌注損傷的早期以細(xì)胞凋亡為主，后期以壞死為主，梗死灶的周邊以細(xì)胞凋亡為主，中央部分以壞死為主[1]。在心肌缺血/再灌注早期應(yīng)用天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific protease, Caspase)抑制劑能減少細(xì)胞凋亡[2]。在缺血-再灌注16 h內(nèi)危險(xiǎn)區(qū)的心肌5%～30%發(fā)生細(xì)胞凋亡，梗死區(qū)及其周?chē)募【鶗?huì)發(fā)生凋亡，應(yīng)用Caspase抑制劑能減少21%～52%的梗死面積[3]。甘草酸預(yù)處理能抑制大鼠心肌缺血再灌注心肌B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl2-Associated X的蛋白質(zhì)(Bax)表達(dá)，進(jìn)而減少心肌細(xì)胞凋亡[4]。

脂肪酸合成酶(Fas)又名CD95或APO-1,是細(xì)胞凋亡信號(hào)受體,通過(guò)與Fas配體(FasL)結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。Fas/FasL凋亡通路在心臟缺血/再灌注心肌細(xì)胞凋亡中起到重要作用, 抑制其表達(dá)能減少心肌細(xì)胞凋亡[5]。血脂康主要成分為洛伐他汀[6]。本課題組前期研究[7]發(fā)現(xiàn)，血脂康減少大鼠急性缺血-再灌注心肌Fas/FasL mRNA的表達(dá)。LIU等[8]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠模型心肌缺血再灌注過(guò)程中Fas/FasL誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。ZHANG等[9]研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。然而，有研究[10]發(fā)現(xiàn)，他汀類(lèi)藥物通過(guò)抑制Ras信號(hào)通路，增強(qiáng)人造血腫瘤細(xì)胞中Bim和p27的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，本實(shí)驗(yàn)探討血脂康能否抑制SD大鼠心肌缺血/再灌注心肌細(xì)胞Fas/FasL表達(dá)，從而最終抑制心肌細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 血脂康原粉北大維信生物科技有限公司惠贈(zèng)，DeadEndTMColorimetric TUNEL System Kit 購(gòu)自美國(guó)Promega公司，抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物與分組 健康SD成年大鼠，體質(zhì)量200～250 g，在南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)科部飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK(京)2016-0009 ]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)(No.110364200100066481)，實(shí)驗(yàn)經(jīng)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(NO：20071876)。

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為5組，各8只。假手術(shù)組：雙蒸水2 mL·d-1灌胃1周；模型對(duì)照組：雙蒸水2 mL·d-1灌胃1周；甲羥戊酸組：甲羥戊酸150 mg·kg-1·d-1溶于雙蒸水2 mL灌胃1周；血脂康組：血脂康2.8 g·kg-1·d-1，用雙蒸水2 mL配成懸液灌胃1周；血脂康+甲羥維酸組：血脂康2.8 g·kg-1·d-1聯(lián)合甲羥戊酸150 mg·kg-1·d-1溶于雙蒸水2 mL配成懸液灌胃1周。

1.2.2 缺血-再灌注模型復(fù)制 根據(jù)本課題組前期發(fā)表文獻(xiàn)方法復(fù)制在體心臟缺血-再灌注模型[5]，簡(jiǎn)要步驟如下。

腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉。氣管切開(kāi)插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)(頻率60次·min-1，呼/吸=1∶1.5,壓力0.04 MPa)。沿胸骨旁左側(cè)0.5 cm剪開(kāi)皮膚、皮下組織，于左側(cè)第四肋間鈍性分離，剪斷第4肋，打開(kāi)胸腔，在距左心耳根部下方2 mm處帶4-0手術(shù)絲線(xiàn)無(wú)創(chuàng)手術(shù)圓針進(jìn)針，肺動(dòng)脈圓錐旁出針，進(jìn)針深度1.0～1．5 mm，寬2～3 mm，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支 (假手術(shù)組只穿線(xiàn)不結(jié)扎)，結(jié)扎前放2根4號(hào)雙股手術(shù)絲線(xiàn)。結(jié)扎30 min后解開(kāi)活結(jié)，拉動(dòng)2根4號(hào)絲線(xiàn)，使左前降支血流再通120 min。描記肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：心電圖R波增寬、增高；結(jié)扎遠(yuǎn)端的左心室變蒼白、室壁運(yùn)動(dòng)減弱[11]。

1.2.3 原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 再灌注120 min后在同一部位垂直心室長(zhǎng)軸取左心室組織，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%中性甲醛溶液固定，制作常規(guī)石蠟切片，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照DeadEndTMColorimetric TUNEL System 試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，具體步驟如下。

左心室心肌組織經(jīng)自動(dòng)脫水機(jī)脫水、二甲苯透明、組織浸蠟和石蠟包埋后，制作4 μm的石蠟切片。石蠟切片65 ℃恒溫箱內(nèi)烤片60 min；二甲苯脫蠟兩次，每次5 min；室溫下依次體積分?jǐn)?shù)100%乙醇、體積分?jǐn)?shù)85%乙醇、體積分?jǐn)?shù)70%乙醇和體積分?jǐn)?shù)50%乙醇各3 min組織切片水合；在室溫下用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85% NaCl浸洗5 min,再用PBS液在室溫下浸洗5 min；室溫下質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液(溶于PBS液中)溶液固定15 min；室溫下切片在PBS液中浸泡5 min，重復(fù)一次，每片切片加100 μL蛋白酶K(20 μg·mL-1)室溫孵育20 min；室溫下在PBS液中浸洗5 min，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛重復(fù)固定5 min；室溫下PBS浸洗5 min，重復(fù)一次；陽(yáng)性對(duì)照切片加用100 μL/切片DnaseⅠ緩沖液5 min，去除緩沖液，再每片加100 μL溶于DNaseⅠ緩沖液的DNaseⅠ(5 U·mL-1)，室溫下孵育10 min，去離子水洗3次，再用PBS液浸洗5 min,隨后步驟相同，但應(yīng)分開(kāi)處理。除去切片上過(guò)多的水，每片加100 μL平衡液,室溫下平衡10 min；加100 μL rTdT反應(yīng)混合液到每片組織切片上，用塑料蓋玻片覆蓋，37 ℃孵育60 min，陰性對(duì)照不含有rTdT，用去離子水代替;室溫下浸入2×SSC中15 min以終止反應(yīng)；PBS浸洗5 min，再重復(fù)2次；室溫下浸在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的過(guò)氧化氫溶液中5 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶；室溫下PBS浸洗5 min，3次；每個(gè)切片加100 μL 1∶500的streptavidin HRP(用PBS稀釋)，室溫孵育30 min；在PBS液中浸洗5 min，3次；每個(gè)玻片加100 μL DAB液，避光顯影10 min，在光學(xué)顯微鏡下觀察背景呈淺黃色時(shí)用去離子水沖洗終止反應(yīng)；蘇木精襯染；晾干玻片，常規(guī)樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察：TUNEL陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕黃色，正常心肌細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)色[12]。應(yīng)用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)采集圖像并計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性凋亡心肌細(xì)胞和總心肌細(xì)胞數(shù)。采用雙盲的方法，每只大鼠觀察4張切片，每張切片計(jì)數(shù)4個(gè)高倍視野(×200)下的TUNEL陽(yáng)性凋亡心肌細(xì)胞和總心肌細(xì)胞數(shù)。計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)=TUNEL陽(yáng)性心肌細(xì)胞/總心肌細(xì)胞×100%。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 運(yùn)用Trizol法提取大鼠心肌組織的總RNA，用Nano Drop超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度后進(jìn)行定量。

將RNA(x μL)加DEPC水(8-x μL)混合后，加入5×PrimeScript RT Master Mix(2 μL)制成10 μL逆轉(zhuǎn)錄體系，行逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)：25 ℃，5 min； 42 ℃，30 min；85 ℃，5 min；最后12 ℃。運(yùn)用SYBR GREEN法行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：95 ℃，3 min；95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算，以18 s作為內(nèi)參。

1.2.5 蛋白免疫印跡 運(yùn)用RIPA裂解液添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% PMSF裂解大鼠心肌組織，運(yùn)用BCA Protein Assay Kit測(cè)定總蛋白濃度。

將蛋白上清液和5×Loading buffer(4∶1)混勻后，用100 ℃水浴5 min，待溫度冷卻后放置-20 ℃儲(chǔ)存。配制所需濃度的SDS凝膠，將等量總蛋白上樣，經(jīng)凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉2 h。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉按1∶1 000比例配置相關(guān)一抗，于4 ℃搖床孵育一抗過(guò)夜。次日，用TBST清洗(每次10 min，洗3次)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉按1∶10 000比例配置相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h。用TBST清洗，最后使用ECL發(fā)光試劑盒在顯色儀中曝光顯影，蛋白條帶使用Image J軟件進(jìn)行灰度值測(cè)量，用β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞凋亡 TUNEL陽(yáng)性凋亡心肌細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕褐色，非凋亡心肌細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)色。

假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞偶有凋亡，TUNEL陽(yáng)性心肌細(xì)胞(3.84±1.64)%。缺血-再灌注損傷引起心肌細(xì)胞凋亡增加，模型對(duì)照組TUNEL陽(yáng)性心肌(30.27±6.52)%，同假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。血脂康預(yù)處理能減少缺血-再灌注損傷引起的心肌細(xì)胞凋亡[血脂康組(17.84±4.55)%vs模型對(duì)照組，P<0.001]，但仍比假手術(shù)組心肌細(xì)胞凋亡增多(血脂康組vs假手術(shù)組，P<0.001)。甲羥戊酸減弱血脂康對(duì)缺血-再灌注心肌細(xì)胞凋亡的抑制[血脂康+甲羥戊酸組(28.32±6.17)%vs血脂康組，P<0.001；血脂康+甲羥戊酸組vs模型對(duì)照組，P=0.481]，而單獨(dú)甲羥戊酸預(yù)處理對(duì)缺血-再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡無(wú)影響[甲羥戊酸組(31.93±6.82)%vs模型對(duì)照組，P=0.549]。見(jiàn)圖1。

2.2 心肌組織實(shí)時(shí)熒光定量Fas、FasL mRNA表達(dá)

模型對(duì)照組凋亡基因mRNA表達(dá)水平同假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血脂康組與模型對(duì)照組相比能減少凋亡基因mRNA表達(dá)水平(P<0.01)；血脂康+甲羥戊酸組可以逆轉(zhuǎn)血脂康組的保護(hù)效應(yīng)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組心肌組織實(shí)時(shí)熒光定量Fas、FasL mRNA表達(dá)比較

2.3 蛋白免疫印跡法檢測(cè)心肌組織Fas、FasL 蛋白表達(dá) 模型對(duì)照組凋亡蛋白表達(dá)水平同假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血脂康組與模型對(duì)照組相比可減少凋亡蛋白表達(dá)水平(P<0.01)；血脂康+甲羥戊酸組可以逆轉(zhuǎn)血脂康組的保護(hù)效應(yīng)(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

注：a:假手術(shù)組；b:血脂康+甲羥戊酸組;c:甲羥戊酸組;d:模型對(duì)照組;e:血脂康組;f:陰性對(duì)照；g:陽(yáng)性對(duì)照。TUNEL-陽(yáng)性心肌細(xì)胞即凋亡細(xì)胞呈棕褐色(見(jiàn)箭頭所示)，正常非凋亡心肌細(xì)胞細(xì)胞核呈藍(lán)色。

表2 缺血-再灌注損傷心肌Fas/FasL蛋白表達(dá)比較

注：a:假手術(shù)組;b:模型對(duì)照組;c:血脂康組;d:血脂康+甲羥戊酸組;e:甲羥戊酸組。

3 討論

血脂康為粳米接種特殊紅曲菌，采用現(xiàn)代生物制藥工藝發(fā)酵、精制而成，主要成分為無(wú)晶型結(jié)構(gòu)的洛伐他汀等13種同系物，含有8%的不飽和脂肪酸、甾醇和少量黃酮類(lèi)物質(zhì)等[6]，與化學(xué)合成的洛伐他汀相比，血脂康所含洛伐他汀結(jié)晶度較低，體內(nèi)溶出度高[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血/再灌注引起SD大鼠心肌細(xì)胞凋亡增加，血脂康預(yù)處理能明顯抑制SD大鼠缺血/再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡。應(yīng)用甲羥戊酸拮抗血脂康中的洛伐他汀發(fā)現(xiàn)血脂康抑制SD大鼠缺血/再灌注心肌細(xì)胞凋亡作用減弱，提示血脂康中的主要成分洛伐他汀起抑制心肌細(xì)胞凋亡作用，與張曉捷等[14]研究發(fā)現(xiàn)一致。張曉捷等[14]研究發(fā)現(xiàn)，洛伐他汀預(yù)處理后，大鼠心肌缺血/再灌注時(shí)心肌細(xì)胞凋亡減少，心功能明顯改善。ZHANG等[9]研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。然而，他汀類(lèi)藥物在影響腫瘤細(xì)胞凋亡中得到相反的結(jié)果。FUJIWARA等[10]研究發(fā)現(xiàn)，他汀類(lèi)藥物通過(guò)降低線(xiàn)粒體跨膜電位、增加 Caspase-9和Caspase-3的活化、增強(qiáng)Bim表達(dá)以及通過(guò)抑制Ras/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和 Ras/哺乳動(dòng)物靶標(biāo)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1期來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，缺血/再灌注使大鼠心肌Fas/FasL mRNA表達(dá)增加, 血脂康預(yù)處理后能抑制缺血/再灌注心肌Fas/FasL mRNA的表達(dá)[7]。本實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證，血脂康抑制缺血/再灌注大鼠心肌Fas和FasL mRNA的表達(dá)，同時(shí)可抑制Fas和FasL蛋白的生成。Fas/FasL通路在缺血/灌注心肌細(xì)胞凋亡中起到重要作用，缺血/再灌注時(shí)心肌Fas/FasL表達(dá)增加，抑制Fas/FasL表達(dá)可減少心肌細(xì)胞凋亡。LEE等[5]研究發(fā)現(xiàn)，淋巴組織增生病小鼠(Fas無(wú)功能)同野生型小鼠相比，缺血/再灌注時(shí)心肌細(xì)胞凋亡減少63.8%，梗死面積減少62.3%。LIU等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在缺血和再灌注時(shí)間延長(zhǎng)后的心肌缺血/再灌注中，心肌細(xì)胞凋亡增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡和Fas/FasL參與心臟缺血/再灌注的發(fā)病，阻斷細(xì)胞凋亡或Fas/FasL表達(dá)是預(yù)防和治療心臟缺血/再灌注損傷的一種方法。

總之，血脂康抑制缺血/再灌注大鼠心肌細(xì)胞Fas/FasL凋亡通路，進(jìn)而抑制缺血/再灌注心肌細(xì)胞凋亡，其抑制心肌細(xì)胞凋亡的主要成分為洛伐他汀。