徐 旭， 洪 昊， 喬韡華， 史嘉瑋， 董念國

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院心臟大血管外科，武漢 430022

目前臨床上廣泛使用的戊二醛交聯(lián)的生物瓣膜具有良好的力學性能，但是由于戊二醛的細胞毒性，戊二醛瓣膜常因再細胞化困難而導(dǎo)致瓣膜衰敗[1]。組織工程瓣膜具有良好的生物相容性，能夠在體內(nèi)發(fā)生組織重塑，有望成為下一代瓣膜替代物。去細胞瓣膜是目前常用的組織工程瓣膜支架，具有天然的瓣膜結(jié)構(gòu)，有利于細胞的粘附、生長和增殖[2]。但是去細胞瓣膜力學性能弱，無法承受心臟內(nèi)巨大的血流壓力。聚乙二醇-海藻酸鈉水凝膠具有良好生物相容性，其雙交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使水凝膠具有良好的韌性。但是單純的聚乙二醇-海藻酸鈉水凝膠構(gòu)建組織工程瓣膜支架，難以模擬天然瓣膜復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。因此，我們利用聚乙二醇-海藻酸鈉水凝膠交聯(lián)去細胞瓣膜構(gòu)建新型組織工程瓣膜支架，并對其生物學性能和生物力學性能進行研究。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑與儀器

聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA，700DA)、海藻酸鈉、Irgacure 2959購自上海麥克林公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司；CHAPS、Tris-HCl、TnBP、SB3-10、ASB-14、Benonase購自美國Sigma公司；25%戊二醛購自國藥集團化學試劑有限公司；CCK8試劑盒購自Biosharp公司；豬主動脈瓣葉購自武漢市肉聯(lián)廠；掃描電鏡為荷蘭FEI公司產(chǎn)品；拉力測試儀為美國Instron公司產(chǎn)品。

1.2 聚乙二醇-海藻酸鈉水凝膠預(yù)混液的制備

配置40%(W/W)PEGDA溶液和5%(W/W)海藻酸鈉溶液，將上述PEGDA溶液與海藻酸鈉溶液按照1∶1加入，用磁力攪拌器混合10 min。接著將Irgacure 2959作為光交聯(lián)劑加入上述混合溶液中。

1.3 去細胞瓣膜的制備

配制體系1溶液：含40 mmol/L Tris-HCl(pH=7.8)，2%(W/V)CHAPS，2 mmol/L TnBP；配制體系2溶液：含40 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.8)，2 mmol/L TnBP，2%(W/V)CHAPS，2%(W/V)SB3-10和1%(W/V)ASB-14；配制核酸酶溶液：50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.8)，100 U/mL Benzonase和1 mmol/L MgCl2。新鮮的豬主動脈瓣葉用PBS漂洗30 min。漂洗后的主動脈瓣葉順序置于體系1溶液、體系2溶液、核酸酶溶液中各反應(yīng)24 h，在每次反應(yīng)完成后置于PBS溶液中漂洗24 h，每6 h換1次PBS(上述步驟均在37℃，110 r/min的恒溫搖床上進行)。

1.4 復(fù)合支架瓣膜的制備

將去細胞瓣膜放置在聚乙二醇-海藻酸鈉水凝膠預(yù)混液中靜置10 min，取出放置在波長為365 nm紫外燈下照射20 min(正反兩面各照射10 min)進行光交聯(lián)，然后再置于1 mmol/L CaCl2溶液中交聯(lián)24 h。此瓣膜即為復(fù)合支架瓣膜樣本(復(fù)合支架組)。

1.5 戊二醛瓣膜的制備

將豬主動脈瓣葉放置于PBS溶液中漂洗30 min，隨后放置在0.25%戊二醛溶液中37℃下交聯(lián)24 h。交聯(lián)完成的瓣膜存放在4℃，0.125%戊二醛溶液中。此瓣膜即為戊二醛交聯(lián)瓣膜樣本(戊二醛組)。

1.6 組織學染色

將兩組瓣膜(5片/組)放置在4%多聚甲醛中固定15 min后，復(fù)合支架組行冰凍切片，戊二醛組行石蠟包埋切片。將兩組切片行蘇木精-伊紅(HE)、馬松(Masson)、彈性纖維范吉森(EVG)染色，觀察各組瓣膜組織學染色情況。

1.7 大體和掃描電鏡觀察

將兩組瓣膜置于黑色背景下，拍攝其交聯(lián)后的外觀。將兩組瓣膜(5片/組)分別于梯度濃度的乙醇溶液中脫水后，置于-80℃冰箱過夜。冰凍干燥真空機預(yù)冷后，將瓣膜放置機器內(nèi)干燥12 h。干燥完成后，對瓣膜行噴金處理，即可進行掃描電鏡觀察、拍攝。

1.8 細胞增殖實驗

將兩組瓣膜(5片/組)均裁剪成直徑為6.35 mm的圓片，0.1%過氧乙酸浸泡4 h，PBS漂洗30 min。將經(jīng)上述滅菌處理后的瓣膜片放置于96孔板中，每孔加入200 μL細胞密度為1×104/mL的臍靜脈內(nèi)皮細胞，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。在第1、3、5天時，將瓣膜轉(zhuǎn)移至新的96孔板中，每孔加入200 μL CCK8試劑孵育3 h，用酶標儀測量每孔溶液在450 nm處的吸光度值(A)。

1.9 生物力學性能測試

將兩組瓣膜(5片/組)分別沿著瓣膜的長軸裁剪成3 mm × 15 mm的矩形，將矩形瓣膜片固定在拉力測試儀的夾片上，以5 mm/min的速度拉伸瓣膜。記錄每片瓣膜的楊氏模量、最大應(yīng)力和最大應(yīng)變。

1.10 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 組織學染色

組織學染色顯示復(fù)合支架組中去細胞瓣膜脫細胞完全，無細胞殘留；膠原蛋白和彈性蛋白保留完好；聚乙二醇-海藻酸鈉水凝膠均勻地結(jié)合在去細胞瓣膜表面。戊二醛組膠原蛋白排列結(jié)構(gòu)更加致密，彈性蛋白保留完全(圖1)。

黑色箭頭標注為聚乙二醇-海藻酸鈉水凝膠；標尺長度：100 μm圖1 兩組瓣膜的組織學染色Fig.1 Histological staining of valve tissues in two groups

2.2 大體和掃描電鏡觀察

兩組瓣膜大體觀顯示戊二醛組瓣膜發(fā)黃和輕微皺縮，而復(fù)合支架組中所用聚乙二醇-海藻酸鈉水凝膠未使去細胞膜的顏色和形狀發(fā)生明顯改變。電鏡結(jié)果顯示戊二醛組表面致密，而復(fù)合支架組表面呈現(xiàn)粗糙的微結(jié)構(gòu)(圖2)。

圖2 兩組瓣膜的掃描電鏡和大體觀察Fig.2 Scanning electron micrographic result and general observation of the two groups

2.3 細胞增殖

復(fù)合支架組瓣膜表面的細胞生長良好，細胞數(shù)量隨培養(yǎng)天數(shù)增加而不斷增加。而戊二醛組瓣膜表面細胞生長狀況較差，細胞數(shù)量隨培養(yǎng)天數(shù)的增加呈下降趨勢(圖3)。

與復(fù)合支架組比較，**P<0.01圖3 HUVECs在兩組瓣膜表面數(shù)量隨培養(yǎng)時間的變化Fig.3 Changes in number of HUVECs on the surface of valves in the two groups over time

2.4 力學性能

戊二醛組在楊氏模量和最大應(yīng)力方面明顯高于復(fù)合支架組(均P<0.05)。在最大應(yīng)變上，復(fù)合支架組顯著強于戊二醛組(P<0.05)(圖4)。

與復(fù)合支架組比較，*P<0.05 **P<0.01圖4 兩組瓣膜的生物力學性能比較Fig.4 Comparison of biomechanical properties between the two groups

3 討論

組織工程瓣膜具有組織再生和自我更新的能力，能夠提高瓣膜替代物的使用壽命。未來，組織工程瓣膜將有可能取代目前臨床常用的戊二醛生物瓣。

聚乙二醇水凝膠因具有良好細胞相容性，無免疫原性以及類似軟組織的三維結(jié)構(gòu)而被廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域[3]。既往有研究將聚乙二醇水凝膠與去細胞瓣膜交聯(lián)促進細胞生長，但結(jié)果表明聚乙二醇水凝膠交聯(lián)去細胞瓣膜后，去細胞瓣膜的生物力學性能并未得到提高[4]。另有研究發(fā)現(xiàn)由聚乙二醇和海藻酸鈉構(gòu)成的互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠具有良好的彈性和力學強度[5]。因此，本研究將聚乙二醇-海藻酸鈉水凝膠與去細胞瓣膜進行交聯(lián)構(gòu)建新型組織工程瓣膜支架，并對其生物學和生物力學性能進行研究。有研究表明疏松多孔的結(jié)構(gòu)更有利于營養(yǎng)物質(zhì)與代謝產(chǎn)物的交換，更利于細胞的生長[6]。本研究組織學染色結(jié)果顯示復(fù)合支架瓣膜內(nèi)結(jié)構(gòu)較戊二醛瓣膜更加疏松多孔，這說明復(fù)合支架瓣膜較戊二醛瓣膜更有利于細胞生長。同時，我們可以觀察到去細胞瓣膜表面結(jié)合上了聚乙二醇-海藻酸鈉水凝膠，其結(jié)合的方式可能是瓣膜上的氨基與水凝膠上丙烯酸酯雙鍵發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)[7]。這說明聚乙二醇-海藻酸鈉水凝膠能與去細胞瓣膜產(chǎn)生緊密結(jié)合。既往研究表明瓣膜皺縮可能會導(dǎo)致瓣膜替代物衰敗。本研究中兩組瓣膜大體觀顯示戊二醛交聯(lián)的瓣膜有些許皺縮，這將促進瓣膜的衰敗[8]；而復(fù)合支架瓣膜中聚乙二醇-海藻酸鈉水凝膠沒有對瓣膜顏色和形狀產(chǎn)生明顯影響。既往有研究表明粗糙的微結(jié)構(gòu)表面將有利于細胞的粘附和增殖[9]。本研究掃描電鏡結(jié)果顯示復(fù)合支架瓣膜表面更加粗糙，而戊二醛組瓣膜表面致密和平整，提示復(fù)合支架瓣膜更有利于細胞的粘附和增殖。本研究細胞增殖實驗表明復(fù)合支架組較戊二醛組瓣膜表面細胞生長狀態(tài)好，而且隨著培養(yǎng)時間的延長，復(fù)合支架組細胞數(shù)量不斷增加，但戊二醛組細胞數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢。這證實了復(fù)合支架瓣膜內(nèi)部的疏松結(jié)構(gòu)和表面粗糙的微結(jié)構(gòu)促進了細胞的生長，同時也說明聚乙二醇-海藻酸鈉水凝膠具有良好的生物相容性，對細胞沒有毒性。戊二醛組細胞生長不良，其原因可能因為戊二醛對細胞的毒性，以及致密的瓣膜結(jié)構(gòu)不利于細胞的增殖[10]。

本研究通過楊氏模量和最大應(yīng)力來評價瓣膜的生物力學性能，結(jié)果顯示戊二醛瓣膜組均優(yōu)于復(fù)合支架組。而在最大應(yīng)變上，復(fù)合支架組優(yōu)于戊二醛組。已有研究表明，聚乙二醇-海藻酸鈉構(gòu)成的互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠具有良好的彈性，當水凝膠受到外力時，以離子鍵結(jié)合的海藻酸鈉網(wǎng)絡(luò)分開以抵消外力產(chǎn)生的機械能；當外力消失時，以共價鍵結(jié)合的聚乙二醇鏈可使水凝膠回復(fù)原有形狀[5]。因此，復(fù)合支架瓣膜中的聚乙二醇-海藻酸鈉水凝膠使去細胞瓣膜具有良好的形變能力。瓣膜的開和關(guān)決定心臟內(nèi)血流的方向，瓣膜的開和關(guān)的過程不僅需要瓣膜具有良好的力學強度，還需要其具有好的應(yīng)變性能[11]。本研究結(jié)果顯示，復(fù)合支架組在最大應(yīng)變上較戊二醛組有顯著優(yōu)勢。

綜上所述，由聚乙二醇-海藻酸鈉水凝膠交聯(lián)去細胞瓣膜構(gòu)建的新型組織工程瓣膜支架具有良好的生物相容性與生物力學性能，具有成為下一代瓣膜替代物的潛能。接下來，我們將進一步研究此復(fù)合瓣膜支架在體內(nèi)的生物相容性，并進一步改善此復(fù)合瓣膜支架的生物力學強度。