王輝　張亮　周美靜

摘 要：分析基于微生物學(xué)的速食食品致病菌檢驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果，總結(jié)相應(yīng)的檢驗(yàn)方法。采用傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法進(jìn)行檢驗(yàn)。對(duì)兩種檢驗(yàn)方法下的致病菌陽(yáng)性檢出情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算出總陽(yáng)性率。并對(duì)兩組檢驗(yàn)所耗費(fèi)的時(shí)間進(jìn)行記錄，計(jì)算出平均用時(shí)結(jié)果。經(jīng)統(tǒng)計(jì)與組間比較，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法的樣本陽(yáng)性檢出率為11.00%，較傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法的8.00%明顯較高，P<0.05。對(duì)比不同檢驗(yàn)方法下的用時(shí)情況，可得實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法的平均用時(shí)為（2.35±0.12）h，明顯短于傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法的（37.35±0.15）h，P<0.05?；谖⑸飳W(xué)的速食食品致病菌檢驗(yàn)檢過(guò)程中應(yīng)用不同的檢驗(yàn)方法均能獲得一定的檢驗(yàn)結(jié)果，其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法的檢驗(yàn)效果更為理想。

關(guān)鍵詞：速食食品;致病菌;檢驗(yàn);實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法;傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法

中圖分類號(hào)：TS207 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-5922（2022）04-0084-04

Abstract：? To analyze the test results of pathogenic bacteria in fast-food food based on microbiology and summarize the corresponding test methods. Traditional bacterial isolation and culture method and real-time fluorescent quantitative PCR method were used for detection. Count the positive detection of pathogenic bacteria under the two test methods， and calculate the total positive rate. Meanwhile， record the time spent in the two sets of tests， and calculate the average time. According to statistics and comparison between groups， the positive detection rate of real-time fluorescent quantitative PCR method was 11.00%， which was significantly higher than the 8.00% of traditional bacterial isolation and culture method， and P<0.05. Comparing the time under different test methods， the average time of real-time fluorescent quantitative PCR method is （2.35±0.12）h， which is significantly shorter than the （37.35±0.15）h of traditional bacterial isolation and culture method， and P<0.05. In the process of microbiology-based fast food pathogenic bacteria detection， the application of different inspection methods can obtain certain inspection results， and the detection effect of real-time fluorescent quantitative PCR method is more ideal.

Key words：? fast food;pathogenic bacteria;inspection;real-time fluorescent quantitative PCR method;traditional bacterial isolation and culture method

目前，食品安全因?yàn)榕c人們的生活和健康息息相關(guān)，已經(jīng)成為全社會(huì)廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)話題[1]。為了確保食品的安全性，還需要做好相應(yīng)的微生物檢驗(yàn)工作。隨著時(shí)代的發(fā)展，人們的生活水平不斷提高，食品的種類也日漸豐富，相應(yīng)地，食品安全問(wèn)題也更加受到重視。速食食品具有口味繁多、方便快捷等特點(diǎn)，在人們的日常生活中十分常見(jiàn)，帶給大家極大的便利。但是，速食食品也容易受到污染，出現(xiàn)各種致病菌。為此，針對(duì)各種速食食品，還需要重視相關(guān)的致病菌檢驗(yàn)。目前，在檢驗(yàn)過(guò)程中，可以選擇應(yīng)用不同的檢驗(yàn)方法[2]。在本文的研究中，選擇200份含有食源性致病菌的速食食品樣本進(jìn)行隨機(jī)分組，分別采用傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法進(jìn)行檢驗(yàn)。通過(guò)比較不同檢驗(yàn)方法的效果，得出較為合理的檢驗(yàn)方案。

1 材料與方法

1.1 菌株及來(lái)源

此次實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株及其來(lái)源于編號(hào)情況如表1所示。

1.2 試劑和儀器

此次研究中使用的試劑以及儀器種類分別為：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)）;PCR 擴(kuò)增試劑盒（杭州妙麗生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）;沙門氏菌核酸檢測(cè)試劑盒（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)）;副溶血弧菌核酸檢測(cè)試劑盒（廣州深華生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）;金黃色葡萄球菌核酸檢測(cè)試劑盒（上海創(chuàng)坤生物科技有限公司生產(chǎn)）;志賀氏菌核酸檢測(cè)試劑盒（上海滬震生物科技有限公司生產(chǎn)）;單核細(xì)胞增生性李斯特菌核酸檢測(cè)試劑盒（廣州華峰生物科技有限公司生產(chǎn)）;蠟樣芽孢桿菌核酸檢測(cè)試劑盒（上海富勒生物科技有限公司生產(chǎn)）;熒光定量PCR 儀（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)）;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司生產(chǎn)）。B81FD38A-9D7F-4C4C-B2AE-FFE3109EC21C

1.3 方法

1.3.1 傳統(tǒng)分離鑒定方法

采用傳統(tǒng)分離鑒定方式進(jìn)行檢驗(yàn)，包括：前增菌、選擇性增菌、平板分離、生化篩選、血清學(xué)鑒定。在檢驗(yàn)過(guò)程中，根據(jù)分離培養(yǎng)后不同致病菌的化學(xué)組成情況或者代謝產(chǎn)物類型，結(jié)合其不同的生理生化等特性，開(kāi)展生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物毒理實(shí)驗(yàn)，溶血實(shí)驗(yàn)，對(duì)不同的致病菌予以鑒定。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法

（1）菌株基因組DNA 制備

選取不同培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落，嚴(yán)格依照不同細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，按照操作流程，將不同菌株的基因組DNA提取出來(lái)，提取完畢后，置于-20℃條件下凍存?zhèn)溆?，作用是?yáng)性對(duì)照。

（2）樣本前處理與DNA 提取

對(duì)200份速食食品樣品進(jìn)行處理，于無(wú)菌條件下，取25.0 g 食品樣品均質(zhì)，將其添加到已經(jīng)經(jīng)過(guò)滅菌處理的液體培養(yǎng)基（225 mL）中。之后，置于37℃條件下開(kāi)展增菌培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取50 μL 增菌液進(jìn)行DNA 提取。針對(duì)不同菌株的情況，選擇相應(yīng)的核酸檢測(cè)試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，完成檢測(cè)。

（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系及程序

將食品提取的DNA以及不同菌株的DNA 作為模板，利用特異性引物與探針進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。研究PCR 擴(kuò)增梯度循環(huán)反應(yīng)相關(guān)循環(huán)數(shù)與反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度如表2所示。

（4）陽(yáng)性結(jié)果判定

在完成反應(yīng)之后，對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。其中，如果待測(cè)樣品檢測(cè)所得循環(huán)閾值（cyclethreshold，Ct值）小于等于35，且存在明顯的指數(shù)增長(zhǎng)情況，則證明PCR 過(guò)程中出現(xiàn)目標(biāo)DNA 的擴(kuò)增。在空白對(duì)照結(jié)果、陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果、陰性對(duì)照結(jié)果均正常的情況下，可將其判定為陽(yáng)性。如果檢測(cè)所得的Ct 值在35～38的范圍之內(nèi)，則需要重新進(jìn)行PCR 擴(kuò)增操作。對(duì)再次擴(kuò)增后的外源基因Ct 值進(jìn)行觀察，如果該數(shù)值仍然大于35，且存在明顯的指數(shù)增長(zhǎng)現(xiàn)象，在空白對(duì)照結(jié)果、陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果、陰性對(duì)照結(jié)果均正常的情況下，可將其判定為陽(yáng)性。如果經(jīng)過(guò)再次擴(kuò)增操作后，外源基因的Ct 值高于38，在空白對(duì)照結(jié)果、陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果、陰性對(duì)照結(jié)果均正常的情況下，可將其判定為陰性[3]。

1.4 觀察指標(biāo)

對(duì)兩種檢驗(yàn)方法下的致病菌陽(yáng)性檢出情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，相關(guān)的致病菌包括計(jì)算出總陽(yáng)性率。并對(duì)兩組檢驗(yàn)所耗費(fèi)的時(shí)間進(jìn)行記錄，計(jì)算出平均用時(shí)結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對(duì)研究過(guò)程中采集到的各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總，統(tǒng)一導(dǎo)入到統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件 SPSS 21.0中進(jìn)行出處理。研究中涉及到的各種計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)采用 t 檢驗(yàn)，各項(xiàng)計(jì)數(shù)資料的表示方法為例，%，組間檢驗(yàn)采用卡方檢驗(yàn)。檢驗(yàn)后實(shí)現(xiàn)（P< 0.05），則證明組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同檢驗(yàn)方法的陽(yáng)性檢出率統(tǒng)計(jì)比較

經(jīng)統(tǒng)計(jì)與組間比較，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法的樣本陽(yáng)性檢出率為11.00%，較傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法的8.00%明顯較高（P< 0.05），具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示。

2.2 不同檢驗(yàn)方法的平均用時(shí)統(tǒng)計(jì)比較

對(duì)比不同檢驗(yàn)方法下的用時(shí)情況，可得實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法的平均用時(shí)明顯短于傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法（P< 0.05），具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4所示。

3 討論

長(zhǎng)期以來(lái)，食品安全一直都是備受社會(huì)各界關(guān)注的重要課題。食源性疾病是公認(rèn)的、全球首要的食品安全問(wèn)題，也是首要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。食品微生物檢測(cè)的3大指標(biāo)是菌落總數(shù)、大腸菌群、致病菌，食品中常見(jiàn)的致病菌有沙門氏菌，變形桿菌，副溶血性弧菌，致病性大腸桿菌，蠟樣芽孢桿菌，肉毒梭狀芽胞桿菌等。食品中的致病菌、污染物（真菌毒素）對(duì)消費(fèi)者健康危害較大。近年來(lái)，各種致病菌污染所引起的食源性疾病時(shí)有出現(xiàn)，嚴(yán)重威脅到公眾的健康，也造成了一定的經(jīng)濟(jì)損[4]。確保食品安全的關(guān)鍵，在于采取有效的方法，快速篩查受污染的食物。

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，生產(chǎn)模式、生產(chǎn)規(guī)模甚至消費(fèi)習(xí)慣均發(fā)生變化，再加上我國(guó)特有的飲食文化，目前，各種不同類型、不同口味的速食食品在人們的生活中十分常見(jiàn)，給大家的日常生活提供了極大的便利[5]。但是，速食食品的制作、加工、包裝、運(yùn)輸、貯藏等過(guò)程中極易被各種致病菌所侵染，進(jìn)而影響到食品的質(zhì)量和安全，并直接威脅到廣大消費(fèi)者的身體健康，甚至是生命安全。為此，針對(duì)各種速食食品，應(yīng)注意從微生物角度出發(fā)，重視對(duì)其相關(guān)致病菌的檢驗(yàn)和分析。在具體的檢驗(yàn)過(guò)程中，可以選擇應(yīng)用不同的檢驗(yàn)方法。以往在進(jìn)行檢驗(yàn)的時(shí)候，應(yīng)用的大多是傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法[6]。應(yīng)用這一方法進(jìn)行檢驗(yàn)的過(guò)程中，需要結(jié)合檢驗(yàn)需求，對(duì)各種致病菌進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中，不同微生物所需的生長(zhǎng)環(huán)境條件也各不相同，為獲得理想的培養(yǎng)效果，還需要針對(duì)不同微生物的特點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)的培養(yǎng)基選擇和溫度、酸堿度控制等等。例如：腸出血性大腸桿菌0157∶H7可以利用與一般大腸桿菌發(fā)酵山梨醇的特性不同，在SMAC瓊脂上為無(wú)色菌落，而一般大腸桿菌為粉紅色菌落來(lái)鑒別腸出血性大腸桿菌0157∶H7。整個(gè)過(guò)程操作十分繁瑣，復(fù)雜，并需要耗費(fèi)大量的人力、物力。而且，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法下，對(duì)于那些不容易被培養(yǎng)出來(lái)的致病菌，往往難以進(jìn)行檢測(cè)。另外，檢驗(yàn)所耗費(fèi)的時(shí)間也較長(zhǎng)。

目前食物致病菌的檢查通過(guò)增菌培養(yǎng)→分離培養(yǎng)→確認(rèn)試驗(yàn)，整個(gè)過(guò)程需要7～14 d的時(shí)間，周期長(zhǎng)，操作繁瑣，已不適應(yīng)時(shí)代發(fā)展的需要。因此，開(kāi)發(fā)快速、靈敏的食源性致病菌檢測(cè)方法至關(guān)重要。隨著時(shí)代的發(fā)展，各種新型的檢驗(yàn)技術(shù)手段開(kāi)始被開(kāi)發(fā)出來(lái)，并逐漸應(yīng)用到各種食品的致病菌檢驗(yàn)之中。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種快速、靈敏、高通量的方法，目前已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于多種食源性致病菌的快速檢測(cè)之中。熒光定量PCR（Real-Time PCR）技術(shù)即是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。具有應(yīng)用范圍廣、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、特異性和可靠性更強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染性、具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)。細(xì)菌的PCR檢測(cè)流程主要包括核酸提取、擴(kuò)增和檢測(cè)，目前，不同的PCR方法，包括常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)PCR、多重PCR、免疫PCR和微流控PCR等，均有文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用于各種細(xì)菌檢測(cè)。B81FD38A-9D7F-4C4C-B2AE-FFE3109EC21C

在本文的研究過(guò)程中，選擇應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)。該技術(shù)是一種新型的檢驗(yàn)技術(shù)，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法操作繁瑣、準(zhǔn)確度不高，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法是基于基因的方法，比傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法更準(zhǔn)確、快速。與傳統(tǒng)定量檢驗(yàn)不同，傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法只能進(jìn)行重點(diǎn)檢驗(yàn)，而采用全封閉管分析的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)可以借助一定的電腦分析軟件對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地進(jìn)行監(jiān)測(cè)和自動(dòng)定量分析[7]。在檢驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)用該技術(shù)，可以根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物和熒光探針，從細(xì)胞或特定組織中提取總RNA。之后，使用設(shè)計(jì)合成的引物，以一定的樣品為模板，進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，確認(rèn)引物模板的反應(yīng)性能，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行定量分析。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR （qPCR）中，反應(yīng)以循環(huán)中首次檢測(cè)到目標(biāo)擴(kuò)增的時(shí)間點(diǎn)為特征，而非在一定循環(huán)數(shù)后目標(biāo)分子累積的擴(kuò)增量。因此，整個(gè)檢驗(yàn)和分析的過(guò)程十分方便、快捷、高效，極大地提高了檢測(cè)的效率和精密度以及靈敏度。在本文的研究中，選擇應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)速食食品的致病菌情況進(jìn)行檢驗(yàn)。在檢驗(yàn)過(guò)程中，選擇了一些常見(jiàn)的食源性致病菌進(jìn)行研究，包括蠟樣芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、志賀氏菌，以及金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等等。在研究中，對(duì)所獲得的200份速食食品樣品進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)中應(yīng)用不同的檢測(cè)方法，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了分析。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，在樣本陽(yáng)性檢出率方面，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法的樣本陽(yáng)性檢出率為11.00%，較傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法的8.00%明顯較高。這一結(jié)果表明，與傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法相比較，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法可以更好地對(duì)各種陽(yáng)性標(biāo)本予以檢出，檢驗(yàn)的精確度更高。另外，不同檢驗(yàn)方法在所消耗時(shí)間方面也存在一定的差異。此次研究中，對(duì)比不同檢驗(yàn)方法下的用時(shí)情況發(fā)現(xiàn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法的平均用時(shí)為（2.35±0.12）h，明顯短于傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法的（37.35±0.15）h。由此可知，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法是一種高效、方便、快捷的檢驗(yàn)方法，在提高檢驗(yàn)效果的同時(shí)，也可以有效縮短檢驗(yàn)所需時(shí)間，這對(duì)提高實(shí)際工作中的致病菌檢驗(yàn)效率意義重大[8]。但是，在具體的應(yīng)用過(guò)程中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)、也具有一定的缺陷和不足。例如，該方法的檢測(cè)的過(guò)程中很多因素都可能導(dǎo)致定量結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。出現(xiàn)這一情況主要是因?yàn)镻CR 方法的靈敏度較高，可能會(huì)對(duì)已經(jīng)死亡的菌體進(jìn)行擴(kuò)增而導(dǎo)致的。另外，該檢驗(yàn)方式的整體檢測(cè)成本較高，在實(shí)踐中進(jìn)行大面積推廣還存在一定的難度。因此，如何快速有效鑒定各種致病菌，還有待于進(jìn)一步研究和完善。

4 結(jié)語(yǔ)

總之，隨著生活水平的提高，在人們的生活中，對(duì)食品的質(zhì)量安全的關(guān)注度也在逐漸增強(qiáng)。食品不僅僅是充當(dāng)著人們營(yíng)養(yǎng)的主要來(lái)源，還是關(guān)系到人們生活、工作、學(xué)習(xí)的重要角色。是消費(fèi)者和全社會(huì)所共同認(rèn)同和關(guān)注的問(wèn)題之一。所以，對(duì)食品的安全監(jiān)測(cè)對(duì)個(gè)人來(lái)說(shuō)可以有效確保生活質(zhì)量的不斷提高。而如果相關(guān)的檢測(cè)部門采用科學(xué)有效的方法，對(duì)各類食物進(jìn)行認(rèn)真檢測(cè)，就能夠從根本上保證食品衛(wèi)生的安全。通過(guò)本文的分析也了解到，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法耗時(shí)較長(zhǎng)，準(zhǔn)確性也偏低，無(wú)法滿足市場(chǎng)的需求。而應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)則能獲得更為理想的檢驗(yàn)效果。為此，在今后的食品致病菌檢驗(yàn)中，可以積極地嘗試對(duì)這一方法的推廣應(yīng)用。

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