席羽，周冬梅，2，趙錛活，3，安軍，李偉，2

甲狀腺癌（thyroid cancer，TC）是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在全球惡性腫瘤發(fā)病率中排第9位［1-3］。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是TC 中最常見的類型，約占所有甲狀腺癌的80%［4-6］。二磷酸腺苷核糖基化因子6（ADP-ribosylation factor 6，ARF6）是Ras 超家族中的一個小分子GTP 結(jié)合蛋白，屬于ARF 亞家族成員，在哺乳動物的組織中廣泛表達并且具有高度保守性［7］。目前研究表明，ARF6 蛋白的活化和高表達與乳腺癌、胰腺癌、肺癌等多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關［8］。然而ARF6在PTC中的作用尚未見報道。

2020年6月至2021年1月，本研究探討了ARF6對PTC 細胞B-CPAP 增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響及其可能的信號通路。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑人甲狀腺乳頭狀癌細胞株BCPAP 購自中國科學院細胞庫；Control、shARF6、3×Flag-Vector 及3×Flag-ARF6 質(zhì)粒購自湖南長沙優(yōu)寶生物公司；RPMI-1640 細胞培養(yǎng)液購自武漢塞維爾公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；EdU 試劑盒購自銳博生物；CCK-8試劑購自美國ApexBio 公司；Transwell 小室購自無錫耐思生物科技有限公司；ARF6、細胞外調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、p-ERK1/2、上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）及基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、β肌動蛋白（β-actin）抗體和相應二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司；ECL 發(fā)光液購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) B-CPAP 細胞使用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基。細胞密度約80%時傳代，吸棄細胞培養(yǎng)基，使用PBS 洗1 遍，加入0.25%胰酶消化液，細胞開始變圓后，除去胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基進行吹打混勻，傳代比例為1∶3。常規(guī)置于37 ℃，5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2.2 ARF6 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的建立將ARF6 核心質(zhì)粒和2 種輔助質(zhì)粒按2∶1∶1 的比例共轉(zhuǎn)染293T細胞，72 h 后收集上清慢病毒。利用試劑盒檢測病毒滴度。將對數(shù)生長期的B-CPAP細胞鋪于6孔板，密度50%，貼壁后加入適當慢病毒，同時按照1∶1 000 加入polybrene 侵染試劑，12 h 后換液，48 h 觀察熒光，加入嘌呤霉素進行篩選，最終得到穩(wěn)定表達Control和shARF6的細胞系。引物如下：

shARF6#1 正向引物：gatccGGAACAAGGAAATGCGGATCCTTCAAGAGAGGATCCGC-ATTTCCTT -GTTCCTTTTTTg；

shARF6#1 反向引物：aattcAAAAAAGGAACAAGGAAA-TGCGGATCCTCTCTTGAAGGATCCG -CATTTCCTTGTTCCg；

shARF6#2 正向引物：ga-tccGCAAGACAACAATCCTGTACATTCAAGAGATGTACAGGATT-GTTGTCTT-GCTTTTTTg；

shARF6#2 反向引物：aattcAAAAAAGCAAGACAACAATCCTGTACAT-CTCTTGAATGTACAG-GATTGTTGTCTTGCg；

shARF6#3 正向引物：gatccGGACGTA-GGATGAAGAGAAAGTTCAAGAGA-CTTTCTCTTCATCCTACGTCCTTTTTTg；

shARF6#3 反向引物：aattcAAAAAAGGACGTAGGATGAAGAGAAAGTCTCTTGAACTTTCTCTTCATCCTACGTCCg。

1.2.3 瞬時轉(zhuǎn)染將對數(shù)生長期的細胞鋪于6孔板中，密度約80%。取1.5 mL 無菌離心管加入100μL轉(zhuǎn)染緩沖液，加入適量質(zhì)粒后混勻。再取另一只1.5 mL 無菌離心管加入100μL 轉(zhuǎn)染緩沖液，加入轉(zhuǎn)染試劑后混勻，轉(zhuǎn)染試劑體積（μL）：質(zhì)粒質(zhì)量（μg）=3∶1。隨后將兩管中的液體融合混勻，室溫靜置20 min。隨后加入到細胞中放入培養(yǎng)箱，6 h后換液。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting） 將提取的蛋白進行SDS-PAGE 電泳，電轉(zhuǎn)后用3% BSA 封閉，在4 ℃環(huán)境下進行一抗孵育過夜（ARF6 濃度1∶1 000、ERK1/2 濃度1∶500、p-ERK1/2 濃度1∶500、E-cadherin 濃度1∶1 000、MMP-9 濃度1∶500、β-actin濃度1∶5 000），用1×TBST 清洗3 次，每次10 min，然后在室溫下二抗孵育2 h（濃度1∶4 000），用1×TBST清洗3 次，每次10 min。最后在暗室進行底物反應，并通過化學發(fā)光系統(tǒng)檢測目的蛋白的表達水平。灰度值通過Image J軟件進行檢測。

1.2.5 EdU 實驗將對數(shù)生長期細胞以4×103～1×105細胞/孔接種于96 孔板。充分貼壁后EdU 試劑A標記2 h；棄培養(yǎng)基清洗后4%多聚甲醛固定細胞30 min，棄固定液；2 g/L 甘氨酸中和多聚甲醛5 min，棄甘氨酸；0.5% Triton-X-100 打孔10 min；清洗后用新鮮制備的Apollo 混合液避光染色30 min；0.5% Triton-X-100 清洗10 min；甲醇清洗5 min；1×Hoechst33342 反應液避光染核30 min；隨后立即避光觀測。

1.2.6 CCK-8 實驗將對數(shù)生長期細胞以1×103～1×104細胞/孔接種到96 孔板，每孔體積200 μL，以完全培養(yǎng)基為對照，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從第2 天起每天同一時間加入20 μL 的CCK-8 試劑，細胞培養(yǎng)箱中反應4 h。酶標儀于波長450 nm 檢測光密度。

1.2.7 Transwell 實驗在24 孔板中放入轉(zhuǎn)移培養(yǎng)皿（Transwell，培養(yǎng)皿直徑6.5 mm，微孔徑8.0 μm），將基質(zhì)膠Matrigel 鋪在轉(zhuǎn)移培養(yǎng)皿上室，凝固后取對數(shù)生長期的細胞重懸于無血清1640培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)濃度至1×106細胞/毫升，取100μL 細胞懸液加入上室，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)下室加600μL含10%的胎牛血清的1640 培養(yǎng)基。于37 ℃，5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。用棉簽輕輕擦去膜上細胞，甲醇固定30 min，0.5%結(jié)晶紫染色5 min，在每張膜中央部分和周圍部分各隨機取3個視野拍攝，計數(shù)膜下細胞，以膜下細胞的數(shù)量多少表示侵襲能力。遷移實驗為不添加基質(zhì)膠Matrigel，其余步驟相同。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ARF6 沉默細胞系的構(gòu)建用Western blotting測定了3 種shARF6 質(zhì)粒在293T 細胞中對ARF6 蛋白的沉默效率，shARF6#1、shARF6#2、shARF6#3 組的ARF6 蛋白表達水平分別為Control 組的（0.41±0.04）、（1.07±0.09）、（1.15±0.04），shARF6#1 組ARF6蛋白表達水平的降低差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。因此，我們選擇shARF6#1 質(zhì)粒進行后續(xù)試驗，通過慢病毒技術構(gòu)建穩(wěn)定沉默ARF6 的B-CPAP 慢病毒細胞系。通過熒光觀察陽性細胞所占比例在80%以上；Western blotting 檢測結(jié)果顯示B-CPAPshARF6#1 細胞系中ARF6 的蛋白表達水平為對照組的（31.22±0.83）%，表明穩(wěn)定沉默ARF6 的慢病毒細胞系構(gòu)建成功。見圖1。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測B-CPAP細胞中ARF6沉默細胞系的表達：A為檢測三種沉默ARF6質(zhì)粒的表達情況；B為檢測B-CPAP細胞系的ARF6表達情況

2.2 沉默ARF6 抑制B-CPAP 細胞的增殖和轉(zhuǎn)移EdU 實驗結(jié)果顯示，shARF6#1組EdU 陽性細胞的比例為（33.75±1.50）%，對照組為（39.65±2.21）%。將對照組標化為1 后進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示與對照組相比shARF6#1 組EdU 陽性細胞比例明顯下降（P＜0.05）。

CCK-8實驗顯示，在第1、2、3、4、5天，shARF6#1組的OD 值分別為（0.46±0.01）、（0.50±0.01）、（0.55±0.02）、（0.60±0.02）和（0.66±0.03），而對照組的OD值分別為（0.44±0.01）、（0.54±0.01）、（0.64±0.02）、（0.75±0.03）和（0.83±0.03）。將第一天吸光度標化為1 后進行統(tǒng)計可知，shARF6#1 組的增殖活性顯著低于對照組（P＜0.05）。

Transwell實驗結(jié)果顯示，shARF6#1組侵襲細胞數(shù)為（614.66±18.52）個，其對照組侵襲細胞數(shù)為（898.38±38.94）個。將對照組標化為1進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示shARF6#1 組的侵襲細胞數(shù)明顯低于其對照組（P＜0.05）。shARF6#1 組遷移細胞數(shù)為（588.67±18.02）個，其對照組遷移細胞數(shù)為（922.32±34.91）個。將對照組標化為1 進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示shARF6#1 組的遷移細胞數(shù)明顯低于其對照組（P＜0.05）。

2.3 過表達ARF6 促進B-CPAP 細胞的增殖和轉(zhuǎn)移瞬時轉(zhuǎn)染外源性3×Flag-ARF6 質(zhì)粒，Western blotting 檢測轉(zhuǎn)染效率見圖2。在B-CPAP 細胞中瞬轉(zhuǎn)過表達ARF6 的質(zhì)粒24 h 后進行相關實驗。EdU實驗結(jié)果顯示，3×Flag-ARF6 組EdU 陽性細胞數(shù)的比例為（46.53±4.09）%，對照組為（36.89±2.27）%。將對照組標化為1 后進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示與對照組相比，3×Flag-ARF6 組EdU 陽性細胞數(shù)明顯增多（P＜0.05）。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測B-CPAP細胞中ARF6過表達效率

CCK-8 實驗顯示，在第1、2、3、4、5 天，3×Flag-ARF6 組的OD 值分別為（0.48±0.01）、（0.66±0.01）、（0.81±0.02）、（0.93±0.02）和（1.06±0.03），而對照組的OD 值分別為（0.45±0.01）、（0.55±0.01）、（0.63±0.01）、（0.73±0.02）和（0.81±0.02）。將第一天吸光度標化為1后進行統(tǒng)計可知，3×Flag-ARF6組的增殖活性明顯高于對照組（P＜0.05）。

Transwell 實驗結(jié)果顯示，3×Flag-ARF6 組侵襲細胞數(shù)為（943.68±24.69）個，其對照組侵襲細胞數(shù)為（758.42±10.78）個。將對照組標化為1進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示3×Flag-ARF6 組的侵襲細胞數(shù)明顯高于其對照組（P＜0.05）。3×Flag-ARF6 組遷移細胞數(shù)為（974.68±23.68）個，其對照組遷移細胞數(shù)為（726.32±27.04）個。將對照組標化為1 進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示3×Flag-ARF6 組的遷移細胞數(shù)明顯高于其對照組（P＜0.05）。

2.4 ARF6 對p-ERK1/2、E-cadherin 和MMP-9 蛋白水平的調(diào)控情況 Western blotting 結(jié)果顯示，與Control 組相比，shARF6#1 組MMP-9 蛋白水平降低（P＜0.05），E-cadherin 蛋白水平升高（P＜0.05），p-ERK1/2蛋白水平降低（P＜0.05）。過表達ARF6時結(jié)果相反（MMP-9，P＜0.05；E-cadherin，P＜0.05；p-ERK1/2，P＜0.05）。見表1、表2、圖3。

表1 蛋白印跡法檢測沉默二磷酸腺苷核糖基化因子6（ARF6）后細胞外調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）及基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）蛋白表達水平/±s

表1 蛋白印跡法檢測沉默二磷酸腺苷核糖基化因子6（ARF6）后細胞外調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）及基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）蛋白表達水平/±s

組別Control組shARF6#1組t值P值樣本量×重復次數(shù)2×3 2×3 MMP-9/β-actin 0.78±0.09 0.30±0.08 9.76 0.000 E-cadherin/β-actin 0.62±0.15 1.23±0.11 8.03 0.000 p-ERK1/2/β-actin 1.11±0.05 0.21±0.07 25.63 0.000 ERK1/2/β-actin 1.10±0.06 1.11±0.04 0.34 0.741

表2 蛋白印跡法檢測過表達二磷酸腺苷核糖基化因子6（ARF6）后細胞外調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、上皮型鈣黏蛋白（E cadherin）及基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）蛋白表達水平/±s

表2 蛋白印跡法檢測過表達二磷酸腺苷核糖基化因子6（ARF6）后細胞外調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、上皮型鈣黏蛋白（E cadherin）及基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）蛋白表達水平/±s

組別3×Flag-Vector組3×Flag-ARF6組t值P值樣本量×重復次數(shù)2×3=6 2×3=6 MMP-9/β-actin 0.50±0.05 0.94±0.03 18.48 0.000 E-cadherin/β-actin 0.95±0.09 0.30±0.11 11.20 0.000 p-ERK1/2/β-actin 0.65±0.07 1.27±0.08 14.29 0.000 ERK1/2/β-actin 1.01±0.05 1.12±0.06 3.45 0.006

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）、細胞外調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）蛋白及其磷酸化水平的調(diào)控：A為蛋白質(zhì)印跡法檢測沉默ARF6后MMP-9，E-cadherin，p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表達水平；B為蛋白質(zhì)印跡法檢測過表達ARF6后MMP-9，E-cadherin，p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表達水平

3 討論

PTC 是最常見的甲狀腺惡性腫瘤［4-5，9］，近幾十年來國內(nèi)外PTC 的發(fā)病率和死亡率都呈逐漸上升趨勢［4-5，9］。PTC 的臨床癥狀缺乏典型性，腫瘤體積通常不大，且生長速度緩慢，極易被忽視［10］。早期PTC 病人預后良好，而晚期PTC 病人的5 年生存率僅為59%左右［11］。部分類型的PTC 侵襲能力強，且有去分化傾向，可能發(fā)展為低分化或未分化癌，預后極差［12］。因此，研究PTC 發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找對應的分子靶標，可以為PTC 的治療提供理論依據(jù)。

ARF6 是ADP-核糖基化因子（ARF）家族的一員，其通過調(diào)節(jié)細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)運和細胞內(nèi)肌動蛋白的組裝參與細胞分裂、黏附、生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等細胞生命活動［8，13］。大量研究表明，ARF6 在多種腫瘤中高表達并參與調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如乳腺癌、胰腺癌、肺癌等［8，14-18］。在乳腺癌細胞中，ARF6 可招募AMAP1，進而結(jié)合間質(zhì)特異性蛋白EPB41L5，促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和局部粘附動力學，導致乳腺癌細胞的侵襲和遷移能力增強［19-20］。同時，ARF6 和AMAP1是KRAS和TP53突變的主要靶點，可促進胰腺癌的侵襲［15］。另外，在非小細胞型肺癌中ARF6的蛋白表達量明顯升高，可作為潛在的生物標志物［21］。但目前為止，ARF6 在PTC 發(fā)生發(fā)展中的作用尚無報道。在本研究中，我們通過EdU、CCK-8和Transwell實驗證明：在甲狀腺乳頭狀癌細胞B-CPAP中，ARF6 可促進B-CPAP 細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。因此，我們推測ARF6 在PTC 發(fā)生發(fā)展的過程中起著重要的作用，可能成為PTC 的一個潛在的生物學標志物，但其相關調(diào)控機制尚不清楚。

接著，我們通過Western blotting實驗對ARF6調(diào)控B-CPAP 細胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的機制進行了初步的探討。ERK1/2 是絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）超家族中的一員，其異常激活與細胞增殖、侵襲和遷移密切相關［22］。研究表明，Verteporfin 通過ERK1/2 信號通路抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖和細胞周期［23］。MMP-9 是腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因子之一，主要參與細胞外基質(zhì)的降解，對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有促進作用［24］。已有研究表明MMP-9 與甲狀腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關［25］。Ecadherin 是經(jīng)典鈣黏蛋白家族的一員，通過促進粘附連接的溶解進而調(diào)控腫瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和遷移，其表達下降或缺失可促進惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移［26］。研究表明，E-cadherin 低表達、Ezrin 高表達與PTC 的侵襲轉(zhuǎn)移有關［27］。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，沉默ARF6 后ERK1/2 的磷酸化水平、MMP-9 的表達量降低、E-cadherin 的表達量升高，而過表達ARF6時結(jié)果相反。據(jù)此，我們推測，ARF6 調(diào)節(jié)B-CPAP細胞增殖和轉(zhuǎn)移可能與促進ERK1/2 的磷酸化水平、增加MMP-9 的表達及抑制E-cadherin 的表達有關，但其具體機制仍有待進一步探索。

綜上所述，ARF6 可以促進甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，其機制可能與ARF6 激活ERK1/2、促進MMP-9 表達及抑制E-cadherin 表達有關，推測ARF6 有望成為甲狀腺乳頭狀癌分子靶向治療及預后評估的一個潛在的生物學標志物。