范正超，尹航，劉建震，朱曉黎，李崇斌

臨床肺外結(jié)核病占結(jié)核病的10%，泌尿生殖系結(jié)核占肺外結(jié)核病的30%～40%，尤以腎結(jié)核最為多見，是僅次于淋巴結(jié)核病的第二大肺外結(jié)核病，結(jié)核病發(fā)病率和死亡率均居我國傳染病之首［1-2］。病理學(xué)診斷是確診腎結(jié)核的重要手段，主要采用組織學(xué)蘇木素-伊紅（HE）染色及抗酸染色進行診斷。但由于組織學(xué)改變（肉芽腫性炎癥）有時不典型，有些其他細菌感染性病變?nèi)绶墙Y(jié)核分枝桿菌感染、真菌感染等亦可引起類似病理變化，鑒別診斷困難［3-4］，因此結(jié)核病的病原學(xué)診斷一直為人們所關(guān)注，其是感染性疾病的最終確診手段。結(jié)核病原學(xué)診斷有抗酸染色、結(jié)核桿菌培養(yǎng)、結(jié)核桿菌核酸基因檢測等?？顾崛旧\斷結(jié)核病的靈敏度低，且不能有效區(qū)分非結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)桿菌、諾卡菌屬、軍團菌屬等抗酸染色陽性菌［5-6］；結(jié)核桿菌培養(yǎng)雖然診斷準確性高，但存在培養(yǎng)周期長、延誤藥物治療等問題［7］。近年來基因檢測技術(shù)發(fā)展迅速，為上述問題的解決提供了新的思路，如實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)在尿標本中可以檢測微量結(jié)核分枝桿菌特異基因序列，可為腎結(jié)核診斷提供更敏感、快速的依據(jù)［8］，但目前兩種方法的比較國內(nèi)報道僅見于痰涂片，兩項技術(shù)應(yīng)用在腎組織標本中的研究較少。故本研究應(yīng)用實時熒光定量PCR 檢測技術(shù)在腎結(jié)核組織切片中檢測結(jié)核分枝桿菌特異基因序列，并與抗酸染色檢測技術(shù)進行對比，評估熒光定量PCR 技術(shù)聯(lián)合抗酸染色技術(shù)在腎結(jié)核病理診斷中的應(yīng)用價值，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2013 年6 月至2019 年6 月河北省胸科醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除、病理科保存的腎病石蠟包埋標本65 例，以病理診斷結(jié)果為分類標準，將術(shù)后明確診斷為腎結(jié)核的30 例納入陽性組（腎結(jié)核病組），其中男12 例，女18 例；病變位于左側(cè)14 例，右側(cè)16 例；年齡范圍為30～65 歲，年齡中位數(shù)為50.5（40.5，59.25）歲。術(shù)前均診斷為活動性無功能腎結(jié)核（患側(cè)），行后腹腔鏡或開放手術(shù)腎切除術(shù)，術(shù)后病理診斷均為腎結(jié)核。將同一時段因腎外傷、腎腫瘤等行腎切除術(shù)或保留腎單位部分切除術(shù)的35例納入陰性組（非結(jié)核病組），其中腎透明細胞癌15 例，腎盂癌7 例，無功能性腎結(jié)石6 例，腎乳頭狀細胞癌、創(chuàng)傷性腎碎裂傷、無功能性腎積水各2例，囊性腎癌1 例，其中男16 例，女19 例；病變位于左側(cè)15 例，右側(cè)20 例；年齡范圍為30～70 歲，年齡中位數(shù)為50（40，60）歲。術(shù)后病理均診斷為非結(jié)核病。兩組性別、腎臟患側(cè)、年齡等一般資料比較，均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），均有可比性。病人或近親屬對研究方案簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

腎結(jié)核病納入標準：根據(jù)《中國結(jié)核病病理學(xué)診斷專家共識》［9］結(jié)核病病理診斷標準：①慢性肉芽腫伴壞死病變中找到經(jīng)典結(jié)核結(jié)節(jié)；②慢性肉芽腫伴壞死組織中査到抗酸桿菌；③慢性肉芽腫伴壞死病變中未見經(jīng)典結(jié)核結(jié)節(jié)或抗酸桿菌，但臨床細菌學(xué)或影像學(xué)檢查支持結(jié)核診斷，并且抗結(jié)核治療有效；以上三條具備其中一條即可。

1.2 儀器與方法

1.2.1 試劑及儀器抗酸染色試劑盒購自南京一基生化科技有限公司；石蠟包埋組織DNA 提取試劑盒、結(jié)核分枝桿菌核酸測定試劑盒均購自成都博奧晶芯生物科技有限公司。熒光定量PCR 儀，型號ABI 7500，為我院分子實驗室提供。

1.2.2 抗酸染色檢測石蠟組織標本切片厚4μm，常規(guī)二甲苯脫蠟并水洗。具體染色方法略，參見堿性復(fù)紅法（Ziehl-Neelsen）染色法［10］。結(jié)果判定：抗酸菌呈紅色桿狀，其他組織細胞或細菌呈藍色。

1.2.3 DNA 提取及PCR 擴增檢測 （1）所有石蠟組織標本連續(xù)切片5μm×10 張，置于消毒好的1.5 mL離心管中。（2）按照DNA 提取試劑說明書操作步驟提取組織標本DNA。（3）DNA 擴增：按照結(jié)核分枝桿菌核酸測定試劑盒說明書要求進行。PCR 反應(yīng)條件：92 ℃1 min→60 ℃1 min→72 ℃1 min，30 個循環(huán)。在72 ℃進行熒光檢測。每批檢測標本均設(shè)置內(nèi)標陽性對照。檢驗結(jié)果判定：Ct＜40 且擴增曲線呈典型S型為陽性，Ct≥40或無擴增曲線為陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法利用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，定量數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布者采用兩組樣本比較的秩和檢驗（Mann-Whitney U），定性數(shù)據(jù)采用兩組樣本比較的χ2檢驗，不滿足χ2檢驗條件時選擇確切概率法，以α＝0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR 檢測及抗酸染色的檢測結(jié)果

本研究熒光定量PCR 檢測結(jié)核分枝桿菌內(nèi)標陽性對照曲線呈S形且Ct值＜40，結(jié)核分枝桿菌特異基因擴增曲線呈典型S 型且Ct＜40 者為陽性，否則為陰性?？顾崛旧珯z測中呈亮紅色桿狀、略彎曲、串珠狀成堆或散在分布者為結(jié)核分枝桿菌（圖1A），陰性為淺藍色背景下不能檢出亮紅色桿菌（圖1B）。

2.2 熒光定量PCR 檢測與抗酸染色檢測的結(jié)果

本研究腎結(jié)核病組中抗酸染色陽性16例，假陰性14例，靈敏度53.3%；非結(jié)核病組中假陽性2 例，其中腎盂癌、無功能性腎積水各1例，進一步復(fù)查抗酸染色腎盂癌1例陰性，無功能性腎積水者仍為陽性，再進一步行結(jié)核分枝桿菌PCR 基因檢測為陰性，考慮為腎積水合并NTM 感染，余33 例均陰性，特異度為94.3%。熒光定量PCR 檢測腎結(jié)核病組中陽性25例，假陰性5 例，靈敏度為83.3%；非結(jié)核病組中假陽性1例，為患有腎透明細胞癌者，再進一步行PCR檢測復(fù)查結(jié)果轉(zhuǎn)為陰性，考慮為標本污染。非結(jié)核病組中陰性34 例，特異度為97.1%。熒光定量PCR檢測的靈敏度較抗酸染色檢測的靈敏度高，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.24，P=0.012）。熒光定量PCR 檢測的特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值均高于抗酸染色檢測的結(jié)果，但兩者比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。熒光定量PCR 檢測的準確性高于抗酸染色檢測的準確性，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.47，P=0.019），見表1，2。

表1 納入熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)與抗酸染色檢測結(jié)果/例

2.3 熒光定量PCR 聯(lián)合抗酸染色在腎組織結(jié)核分枝桿菌檢測的結(jié)果本研究抗酸染色與熒光定量PCR 聯(lián)合診斷腎結(jié)核，其中腎結(jié)核病組中陽性29例，假陰性1 例，靈敏度為96.7%；非結(jié)核病組中假陽性2 例，陰性33 例，特異度為94.3%。抗酸染色和熒光定量PCR 的靈敏度、陰性預(yù)測值、準確性均明顯高于抗酸染色、熒光定量PCR 單獨檢測值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合檢測的特異度、陽性預(yù)測值低于熒光定量PCR 單獨檢測值，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3，4。

表2 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)與抗酸染色檢測腎結(jié)核病原體的準確度比較/%

表3 納入熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)和抗酸染色聯(lián)合檢測的結(jié)果/例

3 討論

PCR 技術(shù)是一項革命性的分子生物學(xué)技術(shù)，該技術(shù)由Mullis 于1983 年發(fā)明，用于體外擴增特定DNA 片段，很快發(fā)展成生命科學(xué)研究不可或缺的手段。1989 年Hance 等將PCR 技術(shù)用于檢測臨床標本中的結(jié)核桿菌，為結(jié)核感染的病原學(xué)診斷提供了新的途徑。熒光定量PCR 技術(shù)進一步實現(xiàn)了從定性到定量的飛躍，具有特異度高、靈敏度高、定量準確、簡單易行等優(yōu)點［11-14］。

結(jié)核分枝桿菌是人類結(jié)核病的病原菌，因此常將尋找病原菌作為結(jié)核疾病診斷的金標準。對于腎結(jié)核，尿結(jié)核桿菌培養(yǎng)最有診斷價值，但靈敏度變化較大（10.7%～90%），且存在培養(yǎng)周期長、延誤治療等問題；尿沉渣抗酸染色檢測存在靈敏度低（42.1%～52.1%），易污染，不能有效排除其他抗酸染色陽性菌干擾（如包皮垢分枝桿菌）等問題［15-16］。尿結(jié)核分枝桿菌DNA 檢測對結(jié)核桿菌具有較高的靈敏度。國外有研究報道以尿結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性為金標準，PCR 檢測尿結(jié)核分枝桿菌的靈敏度達95.6%，特異度達98.1%，而國內(nèi)有研究報道的靈敏度為80%，特異度為78.5%［17-18］。因尿標本中存在某些擴增抑制藥物或標本易被污染等問題，使得該檢查易出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果。因此尿結(jié)核分枝桿菌DNA 檢測結(jié)果必須結(jié)合培養(yǎng)、影像學(xué)或活檢標本的組織學(xué)檢查結(jié)果方能確立診斷。

表4 抗酸染色、熒光定量PCR及抗酸染色和熒光定量PCR對腎結(jié)核病原體檢測準確度的比較/%

相對在腎結(jié)核病人尿液標本的結(jié)核分枝桿菌病原菌檢測研究報道，我們在本研究中采用對腎結(jié)核組織標本病原菌檢測靈敏度較高的熒光定量PCR 和抗酸染色技術(shù)，以臨床確診的無功能腎結(jié)核的腎臟切除標本（病理診斷為結(jié)核病）為陽性對照，以非腎結(jié)核病變的腎臟切除標本（病理診斷排除結(jié)核?。殛幮詫φ眨謩e研究、比較兩種檢測方法單獨應(yīng)用的檢測準確度和兩個指標聯(lián)合應(yīng)用平行檢測在腎結(jié)核病理診斷中的應(yīng)用價值。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)：（1）熒光定量PCR 技術(shù)在腎結(jié)核確診病例組織切片中檢測的靈敏性為83.3%，與文獻報道的在尿沉渣液體標本中檢測的靈敏度80.0%～95.6%有一定差距，提示熒光定量PCR 檢測靈敏度在不同介質(zhì)標本（液體、固體組織）中有差別，臨床應(yīng)用中應(yīng)注意相關(guān)區(qū)別?？紤]可能原因如下：①與結(jié)核病病灶是否處于活動期有關(guān)，尿標本熒光定量PCR 檢測多用于臨床診斷，大多數(shù)病例結(jié)核病處于活動期，細菌量大，而本研究中手術(shù)切除的腎結(jié)核均已行充分抗結(jié)核治療，病灶組織中的細菌量大幅度降低，導(dǎo)致陽性率下降；②石蠟組織標本經(jīng)固定、脫水等處理過程影響，結(jié)核桿菌DNA 的檢出率降低，這需要進一步的實驗論證。（2）腎組織熒光定量PCR 檢測的靈敏性較抗酸染色檢測的靈敏度提高30.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。腎組織熒光定量PCR 檢測的準確率也明顯高于抗酸染色的檢測結(jié)果，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，充分提示在腎結(jié)核病理診斷中，熒光定量PCR 技術(shù)較抗酸染色技術(shù)在病原學(xué)檢測方面具有更大的應(yīng)用價值。（3）在本研究中，我們進一步探索了抗酸染色聯(lián)合熒光定量PCR 檢測在腎結(jié)核組織標本中檢測的準確度，我們發(fā)現(xiàn)兩種指標聯(lián)合檢測的靈敏性、陰性預(yù)測值、準確性均明顯高于單獨任何一種檢測的指標值，充分提示抗酸染色檢測聯(lián)合熒光定量PCR 檢測在腎結(jié)核病理診斷中擁有更好的檢測準確度。在本研究陰性組（非結(jié)核病組）中熒光定量PCR 檢測假陽性1 例，經(jīng)復(fù)測轉(zhuǎn)為陰性，提示與在石蠟標本處理、DNA 提取過程中標本間污染有關(guān)，需進一步加強實驗室的清潔、消毒工作，提高檢測過程的質(zhì)量控制標準。非結(jié)核病組中抗酸染色檢測假陽性2 例，腎盂癌1 例，無功能性腎積水1 例，進一步復(fù)查抗酸染色腎盂癌1 例轉(zhuǎn)為陰性，考慮與標本之間污染有關(guān)外；無功能性腎積水者仍為陽性，再進一步行結(jié)核分枝桿菌PCR 基因檢測轉(zhuǎn)為陰性，考慮為腎積水合并NTM 感染，再次提示抗酸染色檢測不能有效區(qū)分非結(jié)核分枝桿菌（如包皮垢分枝桿菌）、諾卡菌屬、軍團菌屬等抗酸染色陽性菌感染，抗酸染色陽性者可進一步行熒光定量PCR 檢測或結(jié)核桿菌培養(yǎng)區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌，提高檢測的特異度。

本研究陽性組（腎結(jié)核病組）中組織熒光定量PCR 檢測陽性25 例，其中12 例抗酸染色陽性，13 例抗酸染色陰性，分析可能原因：抗酸染色檢測的靈敏度低于熒光定量PCR 的檢測結(jié)果，在行充分抗癆治療后組織標本結(jié)核菌量水平明顯降低的情況下，抗酸染色的靈敏度會進一步降低，假陰性率升高。腎結(jié)核組中抗酸染色檢測陽性16例，其中例熒光定量PCR 檢測陽性12 例，4 例陰性，考慮可能原因：抗酸染色陽性標本中存在擴增反應(yīng)抑制物，抑制PCR擴張，導(dǎo)致熒光定量PCR 檢測出現(xiàn)假陰性。筆者查閱最近文獻，以抗酸染色聯(lián)合熒光定量PCR 技術(shù)檢測腎結(jié)核組織標本用于病理診斷的研究報道較少，兩種方法聯(lián)合檢測文獻亦較少，且以熒光定量PCR聯(lián)合痰涂片抗酸染色為主。本文研究結(jié)果提示熒光定量PCR 檢測聯(lián)合抗酸染色檢測可提高腎結(jié)核組織標本病原體檢測的靈敏性、陰性預(yù)測值和準確性，在腎結(jié)核的病理診斷中具有良好的應(yīng)用價值。

但本研究有一定的局限性，首先本研究為單中心、小樣本研究，研究結(jié)果缺乏廣泛的代表性，需進一步擴大研究中心、增加樣本量；其次，本研究未行組織標本的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，檢測方法指標的比較缺乏一定的說服力，需在下一步研究中改進。

（本文圖1見插圖5-2）