楊雪，馮志星，馬海濱，任雪燕，單珊，韓海平

喉癌是一種呼吸道最為常見的惡性腫瘤之一，在我國喉癌約占頭頸部惡性腫瘤發(fā)病率的14%，約占全身癌癥的1%～5%［1-2］。盡管隨著醫(yī)療技術(shù)水平的進(jìn)步，在臨床上針對喉癌的治療方式有了一定的提高，但喉癌患者預(yù)后依舊效果不佳，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量［3］。miR-107 作為微小核糖核酸（microRNAs，miRNA）家族一員，已被證實在多種腫瘤組織中存在異常表達(dá)，參與了包括胃癌、結(jié)直腸癌和卵巢癌等多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程［4-6］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為調(diào)節(jié)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊和聚積的細(xì)胞器，在病理刺激下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能會受到影響，未折疊蛋白和錯誤折疊蛋白過度聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)［7］。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時，蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）作為感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號的跨膜蛋白被激活，活化轉(zhuǎn)錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4）持續(xù)過表達(dá)，提高分子伴侶水平，使得細(xì)胞適應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)［8-9］。本研究自2020年2—7 月檢測miR-107 在喉癌Hep-2 細(xì)胞中的表達(dá)，探討miR-107 調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對細(xì)胞增殖和凋亡影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料實驗細(xì)胞：Hep-2 喉癌細(xì)胞株由中國科學(xué)院（上海）細(xì)胞庫提供。

實驗試劑及材料：RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清由美國Hylcon 公司提供，MTT、Trizol 試劑、SYBR@Green RT—PCR 試劑盒、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自Sigma-Aldrich 公司，miR-107 寡聚核苷酸、PCR 引物合成均由上海生工生物有限公司完成，兔抗人凋亡抑制蛋白單克隆抗體購自美國Abcam 公司，兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體、山羊抗兔IgG二抗均購自美Bioword公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 Hep-2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染將Hep-2 細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37 ℃、5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，每2 天進(jìn)行一次傳代。參考Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行操作，空白組不做任何干預(yù)，將miR-107類似物（miR-107 mimics）和陰性對照（negative control）片段轉(zhuǎn)染至mimics組和NG組細(xì)胞中，其中轉(zhuǎn)染濃度為60 nmol/L。轉(zhuǎn)染后在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，收集生長狀況良好，處于對數(shù)生長期時的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實驗操作。

1.2.2 RT-PCR 檢測各組Hep-2 細(xì)胞中miR-107 相對表達(dá)量取處于轉(zhuǎn)染48 h的Hep-2喉癌細(xì)胞通過Trizol 試劑提取得到轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，應(yīng)用SYBRGreen 實時熒光定量PCR 法，對miR-107 的表達(dá)進(jìn)行熒光定量分析。熱循環(huán)反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s 共40個循環(huán)。選擇U6 作為miR-107 的內(nèi)參，所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt值法計算各組細(xì)胞中miR-107的相對表達(dá)量。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測各組Hep-2 細(xì)胞中PERK 及ATF4 蛋白的表達(dá)取處轉(zhuǎn)染48 h 的Hep-2 喉癌細(xì)胞，加入裂解液以提取各種細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。每孔加入50μg 蛋白溶液進(jìn)行電泳分離后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，4 ℃冰箱孵育過夜，用兔抗人單克隆一抗（工作濃度1∶5 000）室溫下孵育2 h，再用過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（工作濃度1∶5 000）室溫下孵育30 min，以GAPDH 為內(nèi)參，用Bandscan 5.0軟件進(jìn)行半定量分析。

1.2.4 四甲基偶氮唑鹽（MTT）法測定Hep-2細(xì)胞的增殖能力取對數(shù)生長期的Hep-2 細(xì)胞以2 000 個/孔接種于96 孔板，每組6 個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染12、24、36 h后每孔加入5 g/L MTT 20μL，37 ℃孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加二甲基亞砜150 μL 低速振蕩10 min，置酶標(biāo)儀于570 nm 測定各孔的吸光度。吸光度值越高則意味著細(xì)胞越多。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡用轉(zhuǎn)染48 h 后的各組細(xì)胞，經(jīng)預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗后，重懸收集細(xì)胞，并用PBS 洗滌3 次。加入Annexin V-FITC 混勻，在室溫條件下避光染色20 min，再加入PI，在一小時內(nèi)使用流式細(xì)胞儀觀察各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用±s表示，方差齊的多組均值比較采用用單因素方差分析，多組間兩兩比較行LSD 法，方差不齊的多組均值采用秩和檢驗分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hep-2細(xì)胞中miR-107相對表達(dá)量轉(zhuǎn)染48 h后，RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，三組轉(zhuǎn)染細(xì)胞miR-107相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.50，P=0.003）。與mimics 組（15.32±1.94）比較，NG 組（0.97±0.02）、空白組miR-107 相對表達(dá)量（0.96±0.03）均降低（P＜0.05）。

2.2 Hep-2 細(xì)胞中PERK 和ATF4 蛋白的相對表達(dá)量三組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的PERK 和ATF4 蛋白表達(dá)水平均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與mimics 組相比較，NG 組和空白組的PERK 和ATF4 蛋白相對表達(dá)量均降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖1、表1。

圖1 三組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中PERK和ATF4蛋白的表達(dá)

表1 三組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）及活化轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）蛋白相對表達(dá)量的比較/±s

表1 三組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）及活化轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）蛋白相對表達(dá)量的比較/±s

注：①與mimics組相比較，P＜0.05。

組別mimics組NG組空白組F值P值重復(fù)次數(shù)666 PERK 0.53±0.07 0.18±0.05①0.19±0.05①70.35＜0.001 ATF4 0.75±0.06 0.28±0.04①0.29±0.04①183.77＜0.001

2.3 miR-107 對Hep-2 細(xì)胞的增殖能力的影響MTT 分析結(jié)果顯示，mimics 組、NG 組和空白組細(xì)胞的增殖能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與mimics 組比較，在12、24、36 h 后NG 組、空白組Hep-2 細(xì)胞增殖能力均有顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 三組轉(zhuǎn)染細(xì)胞在570 nm光密度（OD）值比較/±s

表2 三組轉(zhuǎn)染細(xì)胞在570 nm光密度（OD）值比較/±s

組別mimics組NG組空白組F值P值重復(fù)次數(shù)6 66 miR-107 12 h 0.12±0.02 0.18±0.02 0.19±0.02 21.44＜0.001 24 h 0.24±0.04 0.39±0.04 0.41±0.05 28.38＜0.001 36 h 0.37±0.04 0.61±0.05 0.63±0.05 59.14＜0.001

2.4 miR-107對Hep-2細(xì)胞凋亡的影響三組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=102.32，P＜0.05）。與mimics 組（10.18±0.93）%比較，NG 組（4.33±0.68）%和空白組細(xì)胞凋亡率（4.55±0.78）%均降低（P＜0.05），NG 組細(xì)胞凋亡率與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

喉癌作為頭頸部較為常見的惡性腫瘤之一，并且發(fā)病率在近年來有上升趨勢。有研究［10］認(rèn)為，喉癌的發(fā)生可能與吸煙、飲酒及空氣污染等因素有關(guān)，且存在多種因素相互作用，但目前對其具體發(fā)病機制尚未明確，臨床上喉癌的預(yù)后效果不佳。因此，喉癌發(fā)病機制及喉癌治療靶點的研究對于喉癌的臨床診治具有重要意義。

近年來有研究表明，miRNA 能夠通過多種機制對癌癥的發(fā)生、發(fā)展起到調(diào)控作用［11］。研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織中miR-107 表達(dá)明顯降低，過表達(dá)的miR-107 通過Notch 信號通過能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞A549 的增殖、侵襲和遷移能力［12］，賈振亞等［13］研究也發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-107的表達(dá)能夠明顯抑制Hep-2細(xì)胞的增殖。在本次研究中，取喉癌Hep-2 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-107mimics、negative control 片段，目的在于促進(jìn)Hep-2 細(xì)胞中miR-107 表達(dá)，實驗結(jié)果顯示，與mimics 組相比較，NG 組、空白組miR-107 相對表達(dá)量均降低，結(jié)果提示轉(zhuǎn)染成功，可以利用此細(xì)胞用于后續(xù)實驗的探討。MTT 結(jié)果顯示，成功上調(diào)miR-107 表達(dá)的mimics 組Hep-2 細(xì)胞在12、24、36 h后的增殖能力均低于NG 組、空白組，并且隨時間的增加差異愈加明顯；另一方面，與mimics 組相比較，NG 組和空白組的細(xì)胞凋亡率均降低。這一結(jié)果提示miR-107 與喉癌Hep-2 細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)，當(dāng)miR-107 過表達(dá)時，能夠抑制喉癌Hep-2 細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞在缺氧、氧化應(yīng)激等各種因素刺激下，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)為折疊蛋白及錯位折疊蛋白聚集，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)節(jié)能力失控進(jìn)而導(dǎo)致其功能紊亂的狀態(tài)［14］。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號存在時，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上跨膜蛋白的PERK 被激活，發(fā)生二聚化和磷酸化，同時大多數(shù)mRNA 的翻譯受到抑制，蛋白質(zhì)的合成減少；而ATF4 mRNA表達(dá)得到促進(jìn)，ATF4過表達(dá)能夠促進(jìn)Bcl-2 家族蛋白失衡，引發(fā)與細(xì)胞凋亡、氧化還原反應(yīng)等有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄翻譯［8，15］。有研究表明，上調(diào)ATF4 的表達(dá)能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡［16］。本次研究發(fā)現(xiàn)，與mimics 組相比較，NG 組和空白組的PERK 和ATF4蛋白相對表達(dá)量均降低，這一結(jié)果提示了PERK和ATF4參與了喉癌的發(fā)展過程。

綜上所述，miR-107的表達(dá)與喉癌Hep-2細(xì)胞增殖及凋亡有關(guān)，上調(diào)miR-21 能夠抑制喉癌Hep-2 細(xì)胞增殖、促進(jìn)喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡，其作用機制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)，在一定程度上為喉癌臨床治療提供了理論參考。此外，本研究也存在一定的不足之處，如只采用了喉癌Hep-2細(xì)胞實驗，后續(xù)還可通過動物實驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行補充，進(jìn)一步探討miR-107對喉癌的具體作用及其機制。