王云霞，張苗苗，謝志民

茵梔黃口服液是2019年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽檢品種，具有清熱解毒，利濕退黃，用于肝膽濕熱所致的黃疸，癥見面目悉黃、胸肋脹痛等；由茵陳提取物12 g、梔子提取物6.4 g、黃芩苷40 g 和金銀花提取物8 g按照工藝制成1 000 mL，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中制法項(xiàng)規(guī)定添加有0.3%的苯甲酸鈉作為防腐劑［1］，以防止茵梔黃口服液在儲(chǔ)存過程中發(fā)生霉變，2015 年版《中國(guó)藥典》（四部）通則0181 合劑［2］項(xiàng)下規(guī)定苯甲酸的用量不得超過0.3%，添加防腐劑過少起不到防腐作用，口服液在儲(chǔ)存過程中會(huì)變質(zhì)，添加過量防腐劑，容易導(dǎo)致人體攝入防腐劑過多，會(huì)對(duì)人體造成一定危害，過量攝入苯甲酸和苯甲酸鈉，會(huì)造成肝毒性及腎毒性，有研究表明還會(huì)造成染色體分裂異常甚至致癌，故苯甲酸和苯甲酸鈉的過量攝食是不合適的［3］，這就必須嚴(yán)格控制工藝，嚴(yán)格控制處方中的加入量，防止少加，多加及亂加別的防腐劑，才能保證藥品的安全有效。

目前檢測(cè)防腐劑方法主要有高效液相色譜法［4-12］和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［13］。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法所用儀器較昂貴，不易普及，為了滿足普通實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)需求，本實(shí)驗(yàn)擬采用變換波長(zhǎng)高效液相色譜法，篩選出6種防腐劑作為目標(biāo)物，并對(duì)來自全國(guó)抽檢的32 批次茵梔黃口服液進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，為茵梔黃口服液的安全性評(píng)價(jià)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent科技有限公司）；SPD-M10AVP 二極管陣列檢測(cè)器（日本島津公司）；BT124S 型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.1.2 藥品與試劑 32 批次樣品均為國(guó)家評(píng)價(jià)性抽檢樣品，均來自于北京華潤(rùn)高科天然藥物有限公司（獨(dú)家產(chǎn)品，最早生產(chǎn)批號(hào)2721247，生產(chǎn)日期是2017 年10 月；最晚生產(chǎn)批號(hào)181216，生產(chǎn)日期是2018年12月，1個(gè)規(guī)格：10毫升/支，服用劑量為一次10 mL）。

苯甲酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品鑒定研究院，批號(hào)100419-201703，含量99.9%）、山梨酸鉀對(duì)照品（中國(guó)食品藥品鑒定研究院，批號(hào)101075-201602，含量99.7%）、羥苯甲酯對(duì)照品（中國(guó)食品藥品鑒定研究院，批號(hào)100278-201705，含量100.0%）、羥苯乙酯對(duì)照品（中國(guó)食品藥品鑒定研究院，批號(hào)100847-201604，含量99.9%）、羥苯丙酯對(duì)照品（中國(guó)食品藥品鑒定研究院，批號(hào)100444-201804，含量99.6%）、羥苯丁酯對(duì)照品（中國(guó)食品藥品鑒定研究院，批號(hào)110792-200503，含量100.0%）；乙腈、甲醇均為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液（B）（用磷酸調(diào)pH值3.7）（V/V），梯度洗脫（洗脫程序詳見表1）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；紫外檢測(cè)器；苯甲酸以228 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)，山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯及羥苯丁酯以255 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)；進(jìn)樣體積10μL。

表1 梯度洗脫順序

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取苯甲酸、山梨酸鉀、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯適量，分別加50% 甲醇制成240、80、10、10、10、10 mg/L的溶液，即得。

1.2.2.2 供試品溶液的制備精密吸取樣品1 mL，置50 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

1.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)精密稱取山梨酸鉀對(duì)照品215.24 mg、羥苯甲酯對(duì)照品22.88 mg、羥苯乙酯對(duì)照品22.72 mg、羥苯丙酯對(duì)照品19.88 mg、羥苯丁酯20.88 mg，置同一50 mL 量筒中，加茵梔黃口服液（批號(hào)181206）使溶解至40 mL，搖勻，即得茵梔黃口服液模擬陽性樣品，精密吸取茵梔黃口服液模擬陽性樣品、茵梔黃口服液陰性樣品（未加防腐劑），分別按照“1.2.2.2”項(xiàng)下制備茵梔黃口服液模擬陽性樣品供試品溶液及茵梔黃口服液陰性樣品供試品溶液。精密吸取以上2 種溶液及“1.2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，相鄰色譜峰的分離度均大于1.5；苯甲酸的理論塔板數(shù)為20 655、山梨酸的理論塔板數(shù)為20 417、羥苯甲酯的理論塔板數(shù)為19 988、羥苯乙酯的理論塔板數(shù)為193 447、羥苯丙酯的理論塔板數(shù)為442 048、羥苯丁酯的理論塔板數(shù)為165 648；陰性無干擾；同時(shí)對(duì)生產(chǎn)批號(hào)2721247，生產(chǎn)日期為2017 年10月；生產(chǎn)批號(hào)272538，生產(chǎn)日期為2018年4月；生產(chǎn)批號(hào)272848，生產(chǎn)日期為2018 年6 月的三批次產(chǎn)品也做了加標(biāo)模擬陽性試驗(yàn)，目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰均能很好分離且無干擾。以二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定，茵梔黃口服液模擬陽性樣品中6種防腐劑色譜峰的紫外吸收?qǐng)D譜與對(duì)照品溶液色譜峰的紫外吸收?qǐng)D譜一致。結(jié)果見圖1。

圖1 茵梔黃口服液HPLC圖：A為對(duì)照品，B為模擬陽性樣品，C為陰性樣品

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 線性關(guān)系考察精密稱取羥苯甲酯對(duì)照品10.18 mg、羥苯乙酯對(duì)照品10.02 mg、羥苯丙酯對(duì)照品9.97 mg、羥苯丁酯對(duì)照品10.29 mg，置同一50 mL量瓶中，加50%甲醇使溶解至刻度，搖勻，作為對(duì)羥基苯甲酸酯類的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液；精密稱取苯甲酸對(duì)照品12.35 mg、山梨酸鉀對(duì)照品16.14 mg，置同一25 mL 量瓶中，精密加入對(duì)羥基苯甲酸酯類的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液10 mL，用50% 甲醇使溶解，并加至刻度，搖勻，作為6 號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取6 號(hào)對(duì)照品溶液5 mL，置10 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為5 號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取5 號(hào)對(duì)照品溶液5 mL，置10 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為4 號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取4 號(hào)對(duì)照品溶液5 mL，置10 mL 量瓶中，加50% 甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為3 號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取3號(hào)對(duì)照品溶液5 mL，置10 mL 量瓶中，加50% 甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為2號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取2號(hào)對(duì)照品溶液5 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為1 號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取1號(hào)對(duì)照品溶液5 mL，置10 mL 量瓶中，加50% 甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為0號(hào)對(duì)照品溶液。吸取上述7種不同質(zhì)量濃度溶液各10μL注入液相色譜儀，按“1.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定。以進(jìn)樣質(zhì)量（C，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和線性范圍見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及線性范圍

1.2.4.2 精密度試驗(yàn)精密吸取“1.2.4.1”項(xiàng)下1、3、6 號(hào)對(duì)照品溶液各10μL，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果，6 種防腐劑峰面積的RSD 均小于0.6 %（n=6），表明儀器精密度良好。

1.2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)由本實(shí)驗(yàn)室的兩名實(shí)驗(yàn)員取“1.2.3”項(xiàng)下的茵梔黃口服液模擬陽性樣品在不同時(shí)間按照“1.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試液，用“1.2.4.1”項(xiàng)下3 號(hào)對(duì)照品溶液作為對(duì)照，用不同儀器按“1.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果6 種防腐劑的含量的RSD 均小于0.90%（n=12），表明該方法的重復(fù)性良好。

1.2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取“1.2.4.3”項(xiàng)下茵梔黃口服液模擬陽性供試品溶液（第一次實(shí)驗(yàn)員制備的供試液），放置0、2、4、8、12、16、20、24 h 后按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，6 種防腐劑峰面積的RSD 均小于0.6%（n=8），表明該樣品在24 h內(nèi)有很好的穩(wěn)定性。

1.2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)精密稱取苯甲酸對(duì)照品62.85 mg、山梨酸鉀對(duì)照品91.64 mg、羥苯甲酯對(duì)照品14.13 mg、羥苯乙酯對(duì)照品13.08 mg、羥苯丙酯對(duì)照品12.48 mg、羥苯丁酯對(duì)照品15.37 mg，置同一50 mL 量瓶中，加50%甲醇使溶解至刻度，搖勻，作為加樣對(duì)照品溶液。精密吸取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下的模擬陽性樣品1 mL，6 份，分別置100 mL 量瓶中，分別精密加入上述對(duì)照品溶液2 mL，加50%甲醇使溶解至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取“1.2.4.1”項(xiàng)下3 號(hào)對(duì)照品溶液作為對(duì)照，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果6種防腐劑平均加樣回收率分別為100.69%、98.44%、101.21%、104.18%、103.95%、103.55%，RSD 分別為0.24%、0.29%、0.72%、0.71%、0.44%、0.34%（n=6）結(jié)果見表3。

表3 6種防腐劑的回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

1.2.4.6 最低方法檢出限和定量限精密稱取羥苯甲酯對(duì)照品9.07 mg、羥苯乙酯對(duì)照品4.39 mg，置5 mL 量瓶中，加50%甲醇溶解至刻度，搖勻，作為1號(hào)儲(chǔ)備溶液；精密稱取羥苯丙酯對(duì)照品7.99 mg、羥苯丁酯對(duì)照品6.58 mg、山梨酸鉀對(duì)照品5.39 mg，置50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解至刻度，搖勻，作為2號(hào)儲(chǔ)備溶液；精密稱取苯甲酸對(duì)照品8.04 mg，置50 mL量瓶中，精密加入1 號(hào)儲(chǔ)備溶液3 mL、2 號(hào)儲(chǔ)備溶液3 mL，加50%甲醇溶解至刻度，搖勻，作為1 號(hào)加樣對(duì)照品溶液。精密量取1 號(hào)加樣對(duì)照品溶液1.5 mL，置5 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為2 號(hào)加樣對(duì)照品溶液。精密量取“1.2.3”項(xiàng)下模擬陰性樣品1 mL，4 份，分別置50 mL 量瓶中，分別精密加入上述1號(hào)對(duì)照品溶液0.7 mL、1.3 mL和2號(hào)對(duì)照品溶液0.7 mL、1.3 mL，各加50%甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液作為定量限和檢測(cè)限供試品溶液。按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按色譜峰峰高與基線噪聲的比值計(jì)算，基線噪音3 倍量峰高時(shí)的含量為最低檢出限、基線噪音10倍量峰高時(shí)的含量為最低定量限。結(jié)果苯甲酸的最低檢出限為0.600 ng，最低定量限為2.400 ng；山梨酸鉀的最低檢出限為0.015 ng，最低定量限為0.140 ng；羥苯甲酯的最低檢出限為0.025 ng，最低定量限為0.330 ng；羥苯乙酯的最低檢出限為0.090 ng，最低定量限為0.270 ng；羥苯丙酯的最低檢出限為0.010 ng，最低定量限為0.040 ng；羥苯丁酯的最低檢出限為0.022 ng，最低定量限為0.080 ng。

2 結(jié)果

對(duì)抽檢的32 批次茵梔黃口服液按照“1.2.2.2”項(xiàng)制備方法制備供試液，按照“1.2.2.1”項(xiàng)濃度配制對(duì)照品溶液濃度，按“1.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，32批均檢出苯甲酸，含量范圍2.393 0～2.591 9 g/L，32批均未檢出其他5種防腐劑。對(duì)于苯甲酸限度的確定，根據(jù)2015 年版《中國(guó)藥典》（四部）通則0181合劑項(xiàng)下規(guī)定苯甲酸的用量不得超過0.3%，根據(jù)茵梔黃口服液處方及工藝，每1 000 毫升加苯甲酸鈉3 g，換算為苯甲酸2.54 g，按照工藝偏差±10%計(jì)算，暫擬定每1 mL 含苯甲酸鈉以苯甲酸計(jì)，應(yīng)為2.29～2.79 mg。

3 討論

3.1 波長(zhǎng)的確定在進(jìn)行液相色譜法測(cè)定時(shí)，一般選取目標(biāo)物的最大吸收波長(zhǎng)來進(jìn)行檢測(cè)，此時(shí)檢測(cè)靈敏度最高，但在多組分測(cè)定時(shí)單一波長(zhǎng)很難滿足測(cè)定需求，故選用變換波長(zhǎng)法。用二極管陣列檢測(cè)器通過全波長(zhǎng)光譜掃描得出苯甲酸的最大吸收為228 nm，山梨酸的最大吸收為252 nm，羥苯甲酯的最大吸收為255 nm，羥苯乙酯的最大吸收為255 nm，羥苯丙酯的最大吸收為255 nm，羥苯丁酯的最大吸收為256 nm，除苯甲酸外，其余5種成分最大吸收波長(zhǎng)差距不大，為了減少變換波長(zhǎng)的頻次，并且對(duì)山梨酸檢測(cè)波長(zhǎng)在252 nm 和255 nm、羥苯丁酯檢測(cè)波長(zhǎng)在256 nm和255 nm下的峰面積進(jìn)行比較，差異不大，最終進(jìn)行組合，確定了6種防腐劑的最大吸收，確定了正文中的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 色譜條件的確定在預(yù)試驗(yàn)中，筆者分別選用了等度洗脫和梯度洗脫兩種類型進(jìn)行試驗(yàn)，等度流動(dòng)相有甲醇-0.15%乙酸銨（20∶80，V/V）、甲醇-乙腈-0.15%乙酸銨（10∶5∶80，V/V/V），結(jié)果是基線較平，出峰過快，苯甲酸和山梨酸色譜峰不能完全分離，達(dá)不到改變波長(zhǎng)的要求，目標(biāo)物色譜峰出峰時(shí)間漂移。梯度洗脫程序①：流動(dòng)相（A）甲醇-（B）0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調(diào)pH 值3.5），程序（V/V）0～30 min（A）20%→80%，（B）80%→20%，30～40 min

（A）80%，（B）20% ，梯度洗脫程序②：流動(dòng)相（A）甲醇-（B）0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調(diào)pH 值3.5），程序（V/V）0～40 min（A）20%→80%，（B）80%→20%，40～50 min（A）80%，（B）20%，結(jié)果是山梨酸和羥苯甲酯的色譜峰完全重合，無法分析；梯度洗脫程序③：流動(dòng)相（A）甲醇-（B）0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調(diào)pH 值3.7），程序（V/V）0～40 min（A）

20%→80%，（B）80%→20%，40～50 min（A）80%，（B）20%，結(jié)果對(duì)照色譜峰能夠完全分離，供試品色譜峰除羥苯乙酯色譜峰前后有干擾之外，其余均能完全分離，繼續(xù)在此基礎(chǔ)上調(diào)整流動(dòng)相，在49～69 min 期間采用過流動(dòng)相（A）由25%逐步升至50%、由25%逐步升至48%，色譜圖分離效果不如49～69 min（A）44%，（B）56% ，在系統(tǒng)適用性過程中采用在49～69 min（A）43%，（B）57%、（A）45%，（B）55%，均能達(dá)到分離效果，分析原因，4 號(hào)峰左右側(cè)雜質(zhì)峰與4 號(hào)目標(biāo)物極性相似，利用梯度洗脫改變了流動(dòng)相配比，出峰速度不能達(dá)到恒速，故效果不如等度洗脫。最終確定梯度洗脫程序④：流動(dòng)相（A）甲醇-（B）0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調(diào)pH 值3.7），程序（V/V）0～48 min（A）25%，（B）75%，48～49 min（A）25%→44%，（B）75%→56%，49～69 min（A）44%，（B）56%，69～70 min（A）44%→54%，（B）56%→46%，70～102 min（A）54%，（B）46%，102～103 min（A）54%→90%，（B）46%→10%，103～113 min（A）90%，（B）10%，結(jié)果6 種防腐劑峰形對(duì)稱，無干擾，分離度好。與乙酸銨系列流動(dòng)相比，優(yōu)勢(shì)在于流動(dòng)相配置好后，流動(dòng)相的pH 值不會(huì)發(fā)生變化，色譜峰的時(shí)間不會(huì)漂移，在配制流動(dòng)項(xiàng)時(shí)需要注意的是0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液用磷酸調(diào)pH 值時(shí)，一定要準(zhǔn)確用酸度計(jì)調(diào)至3.7，否則山梨酸和羥苯甲酯色譜峰會(huì)完全重合，在此條件下進(jìn)行測(cè)定用三個(gè)廠家色譜柱試驗(yàn)均能達(dá)到較好的分離效果。

3.3 小結(jié)茵梔黃口服液目前所執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)無防腐劑檢測(cè)項(xiàng)，并且本品還會(huì)在新生兒黃疸中使用，考慮到安全性，故建議增加防腐劑檢查項(xiàng)。本實(shí)驗(yàn)建立的方法，6 種防腐劑色譜峰的分離度較高，回收率平行性較好，最大優(yōu)點(diǎn)是正文中的流動(dòng)相可以將目標(biāo)峰與周圍雜質(zhì)峰完全分離，避免造成假陽性結(jié)果，該方法可以為茵梔黃口服液中防腐劑的檢查提供一定的依據(jù)，也可以為其他口服液在防腐劑的檢查中提供一定的參考價(jià)值。