徐中馳，劉春玲，林欣，高坤，牛茹歌

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210023；2.江蘇省中醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇南京 210004；3. 江蘇省中醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇南京 210004）

造影劑腎病是指在排除其他病因的情況下，接受血管內(nèi)注射造影劑后72 h 內(nèi)出現(xiàn)腎功能損傷，血肌酐較基線水平升高≥25%或＞44 mmol/L[1]。隨著造影劑在心臟冠狀動(dòng)脈介入診療領(lǐng)域和放射診斷技術(shù)中的廣泛應(yīng)用，造影劑腎病的發(fā)病率顯著增加，已成為醫(yī)院內(nèi)獲得性腎損傷的第三大主要原因[2]。既往研究表明，造影劑腎病與經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后發(fā)生長(zhǎng)期重大不良事情的風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)，包括腎衰竭和心血管事件[3]。目前對(duì)造影劑腎病的預(yù)防，尚缺乏特異性的治療方案。

黃蜀葵花是腎臟疾病常用的清利藥之一。其中黃酮類化合物是其主要活性成分[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，黃蜀葵花黃酮類化合物具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗氧化、保護(hù)腎小管和腎小球損傷等作用[5-6]。N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）是氧自由基的直接清除劑，在防治造影劑腎病中發(fā)揮重要作用。本文以NAC 為陽(yáng)性藥，旨在探究黃蜀葵花總黃酮（total flavones of A.manihot,TFA）干預(yù)碘普羅胺誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞（human kidney-2, HK2）損傷的作用機(jī)制，為防治造影劑腎病提供新的治療手段和思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源

HK2 細(xì)胞購(gòu)自廣州賽庫(kù)生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑胎牛血清、DMEM/F12 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司），活性氧（reactive oxygen species, ROS）檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞裂解液（RIPA 裂解液）、BCA 蛋白定量試劑盒、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、DAPI 染色液、抗熒光淬滅液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），碘普羅胺（碘濃度為370 mgI/mL）（德國(guó)拜耳醫(yī)藥保健有限公司），TUNEL 凋亡檢測(cè)試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），抗ASK1 抗體、山羊抗兔IgG HRP、山羊抗鼠IgG HRP、山羊抗兔IgG Fluor488 結(jié)合物（江蘇親科生物研究中心有限公司），抗p-ASK1 抗體、抗P38 MAPK 抗體、抗磷酸P38 MAPK 抗體、抗JNK 抗體、抗磷酸SAPK/JNK 抗體、抗Caspase-3 抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司），Bcl-2 抗體、Bax 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。

1.2.2 主要儀器凝膠成像儀、電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），正置熒光顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek 公司），F(xiàn)orma 二氧化碳CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Thermo 公司），F(xiàn)ACSCelesta 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）。

1.3 黃蜀葵花總黃酮制備過程

黃蜀葵花總黃酮由江蘇省中醫(yī)院制劑科提取。中藥黃蜀葵花500 g 完全浸泡在8 000 mL 75%乙醇中1 h，將混合物加熱到90℃并持續(xù)1 h?；旌衔镞^濾后，在60℃環(huán)境中蒸發(fā)成粉狀，滅菌稱量后置于干燥環(huán)境中備用[4，7]?？傸S酮在生藥中的平均含量為4.992%，標(biāo)準(zhǔn)偏差系數(shù)值為0.160%，該工藝合理，穩(wěn)定可行[8]。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將HK2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，并放置在37℃、5%二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱中孵育。用碘普羅胺（0 mgI/mL、37 mgI/mL、74 mgI/mL、111 mgI/mL、148 mgI/mL、185 mgI/mL）和TFA（0.0 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.6 mg/mL、1.0 mg/mL、1.4 mg/mL）孵育HK2 細(xì)胞，12 h 后檢測(cè)細(xì)胞活性，根據(jù)結(jié)果篩選出碘普羅胺誘導(dǎo)HK2 細(xì)胞損傷和TFA 干預(yù)細(xì)胞損傷的最佳濃度。利用TFA 干預(yù)碘普羅胺孵育的HK2 細(xì)胞，將細(xì)胞分空白組、模型組（111 mgI/mL碘普羅胺）、TFA 組（0.6 mg/mL TFA）、TFA+模型組（111 mgI/mL 碘普羅胺+0.6 mg/mL TFA）、NAC 組（10 mmol/L NAC）、NAC+ 模型組（111 mgI/mL 碘普羅胺+10 mmol/L NAC）。陽(yáng)性藥NAC 濃度設(shè)置由前期實(shí)驗(yàn)及相關(guān)參考文獻(xiàn)結(jié)果獲得[9]。

1.5 方法

1.5.1 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK2 細(xì)胞接種于96 孔板中，按照上述分組每孔加入100 μL 試劑孵育12 h。用無血清培養(yǎng)基配置10% CCK-8 工作液，每孔加入100 μL CCK-8 工作液，孵育1 h 后用光譜儀測(cè)量450 nm 波長(zhǎng)處光密度。細(xì)胞存活率以對(duì)照的百分比表示。

1.5.2 ROS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ROS水平用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA（1∶1 000），使終濃度為10 μmol/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入稀釋好的DCFH-DA，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，置于倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.5.3 Annexin V-FITC 染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HK2 細(xì)胞凋亡將HK2 細(xì)胞接種于96 孔板中，各組孵育12 h 后吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）洗滌，加入Annexin V-FITC 試劑和PI 試劑染色，室溫下避光靜置15 min，隨即在熒光顯微鏡下觀察。

PBS 洗滌細(xì)胞，胰蛋白酶消化3 min，加入含血清培養(yǎng)基終止消化。每個(gè)樣品均離心后棄上清液。加入500 μL 1×結(jié)合緩沖液使細(xì)胞懸浮，每管加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI。冰上避光孵育10 min，用FACSCelesta 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.5.4 TUNEL染色檢測(cè)HK2細(xì)胞凋亡TUNEL 染色試劑盒用于評(píng)估凋亡細(xì)胞的存在。將HK2 細(xì)胞在4%多聚甲醛中固定20 min，用0.5% Triton X-100在PBS中滲透5 min，PBS清洗。加入TUNEL染色液，37℃孵育1 h，PBS 洗滌細(xì)胞。每孔加入DAPI 染色液，黑暗中孵育5 min后去除染色液，PBS洗滌細(xì)胞，最后在正置熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞。

1.5.5 Western blotting 檢測(cè)凋亡蛋白表達(dá)將HK2細(xì)胞按2.5×105個(gè)/mL 的密度接種于6 孔板中，按實(shí)驗(yàn)分組提取蛋白。用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。提取的細(xì)胞蛋白裂解產(chǎn)物用SDS-PAGE 凝膠分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，放入對(duì)應(yīng)一抗，置于4℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔或小鼠IgG 二抗，室溫孵育1 h，滴加ECL 化學(xué)發(fā)光液顯影，用Chemidoc 成像系統(tǒng)顯示條帶。以GAPDH 作為內(nèi)對(duì)照。用Image Lab 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

1.5.6 免疫熒光法檢測(cè)HK2 細(xì)胞p-ASK1 熒光表達(dá)在12 孔板內(nèi)放置細(xì)胞玻片，將HK2 細(xì)胞接種于12孔板中。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，按上述分組進(jìn)行刺激。加入4%多聚甲醛，室溫固定20 min，用0.5% Triton X-100 通透5 min，PBS 清洗，加入含5%BSA 的PBS，室溫封閉1 h，加入p-ASK1 配置的一抗，4℃孵育過夜，加入PBS 配置的熒光二抗，室溫孵育1 h，滴加DAPI 染色液10 min，抗熒光淬滅劑封片。使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 碘普羅胺誘導(dǎo)HK2細(xì)胞損傷

加入0 mgI/mL、37 mgI/mL、74 mgI/mL、111 mgI/mL、148 mgI/mL、185 mgI/mL 碘普羅胺的HK2 細(xì)胞活性分別為（100.00±0.00）%、（78.61±1.61）%、（56.06±2.01）%、（47.86±1.83）%、（41.56±1.15）%、（33.69±2.53）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=638.026，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：0 mgI/mL碘普羅胺的HK2 細(xì)胞活性最高（P＜0.05），加入37 mgI/mL、74 mgI/mL、111 mgI/mL、148 mgI/mL、185 mgI/mL 碘普羅胺的HK2 細(xì)胞活性依次降低（P＜0.05），表明細(xì)胞活性呈濃度依賴性降低。根據(jù)結(jié)果采用111 mgI/mL 碘普羅胺作為碘普羅胺誘導(dǎo)HK2細(xì)胞損傷的模型復(fù)制濃度。

2.2 TFA對(duì)HK2細(xì)胞活性的影響

加入0.0 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.6 mg/mL、1.0 mg/mL、1.4 mg/mL TFA 的HK2 細(xì)胞活性分別為（100.22±0.27）%、（101.74±2.15）%、（103.02±1.29）%、（109.17±2.890）%、（90.82±3.47）%、（18.17±5.48）%，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.839，P=0.143）?？紤]TFA 0.6 mg/mL 時(shí)細(xì)胞活性較高，將其作為干預(yù)碘普羅胺誘導(dǎo)HK2 細(xì)胞損傷的最佳濃度。

2.3 氧化應(yīng)激介導(dǎo)碘普羅胺對(duì)HK2細(xì)胞的損傷

免疫熒光法結(jié)果顯示，ROS 隨時(shí)間增加逐漸升高，表明碘普羅胺以時(shí)間依賴性的方式促進(jìn)ROS的生成。見圖1。

圖1 不同時(shí)間碘普羅胺誘導(dǎo)HK2細(xì)胞損傷 （×200）

2.4 TFA抑制碘普羅胺誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞產(chǎn)生ROS

免疫熒光法結(jié)果顯示，模型組綠色熒光強(qiáng)度高于空白組；使用TFA 和NAC 處理后熒光強(qiáng)度顯著降低，表明TFA 減少了碘普羅胺誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞ROS的產(chǎn)生。見圖2。

圖2 各組HK2細(xì)胞ROS的生成 （×200）

2.5 TFA對(duì)碘普羅胺誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

空白組、模型組、TFA 組、TFA+模型組、NAC 組、NAC+ 模型組HK2 細(xì)胞活性分別為（100.67±0.95）%、（51.07±1.09）%、（97.52±1.49）%、（74.72±2.10）%、（106.61±2.90）%、（90.73±3.98）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=311.295，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：空白組、TFA 組與NAC 組HK2細(xì)胞活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；TFA+模型組、NAC+模型組HK2 細(xì)胞活性高于模型組（P＜0.05），提示TFA 對(duì)碘普羅胺誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。

2.6 TFA 對(duì)碘普羅胺誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-FITC 及TUNEL 染色結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組熒光強(qiáng)度明顯增高；TFA 組、NAC 組與空白組比較無明顯差異；與模型組比較，TFA+模型組和NAC+模型組細(xì)胞熒光強(qiáng)度降低（見圖3、4）。其結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致（見圖5）。

圖3 TFA干預(yù)碘普羅胺誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞凋亡 （Annexin V-FITC染色×200）

圖4 TFA干預(yù)碘普羅胺誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞凋亡 （TUNEL染色×400）

圖5 各組HK2細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

Western blotting 檢測(cè)結(jié)果表明，空白組、模型組、TFA 組、TFA+模型組、NAC 組、NAC+模型各組Bcl-2/Bax、Cleaved caspase-3/Caspase-3 蛋白比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與空白組比較，模型組Bcl-2/Bax 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），Cleaved caspase-3/Caspase-3 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，TFA+模型組和NAC+模型組Bcl-2/Bax 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），Cleaved caspase-3/Caspase-3 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），表明TFA 減少了碘普羅胺誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞凋亡。見表1和圖6。

圖6 各組HK2細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)

表1 各組HK2細(xì)胞凋亡蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表1 各組HK2細(xì)胞凋亡蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

注：①與空白組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別空白組模型組TFA組TFA+模型組NAC組NAC+模型組F 值P 值pJNK/JNK蛋白1.017±0.030 3.944±0.256①1.532±0.274 1.801±0.440②1.262±0.178 1.697±0.487②32.520 0.000 Bcl-2/Bax蛋白1.386±0.125 0.454±0.155①1.380±0.053 1.217±0.058②1.381±0.269 1.215±0.315②10.805 0.000 Cleaved caspase-3/Caspase-3蛋白1.044±0.023 2.630±0.487①1.073±0.194 0.928±0.283②0.830±0.186 0.830±0.152②20.976 0.000 pP38/P38蛋白0.854±0.219 2.123±0.404①0.912±0.104 0.935±0.085②0.802±0.048 0.966±0.128②18.510 0.000

2.7 TFA 通過干預(yù)ASK1-MAPKs 減少碘普羅胺誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞凋亡

免疫熒光法結(jié)果表明，與空白組比較，模型組p-ASK1 熒光表達(dá)明顯增強(qiáng)；TFA 組、NAC 組與空白組比較，熒光表達(dá)無明顯差異；TFA+模型組、NAC+模型組的p-ASK1 熒光強(qiáng)度較模型組減弱。見圖7。

圖7 各組HK2細(xì)胞p-ASK1熒光表達(dá) （免疫熒光法×400）

Western blotting 檢測(cè)結(jié)果表明，空白組、模型組、TFA 組、TFA+模型組、NAC 組、NAC+模型組pP38/P38、pJNK/JNK 蛋白比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與空白組比較，模型組pP38/P38、pJNK/JNK 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，TFA+模型組和NAC+模型組pP38/P38、pJNK/JNK 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），提示TFA 干預(yù)碘普羅胺誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞凋亡與抑制ASK1-MAPKs 通路有關(guān)。見表1和圖6。

3 討論

造影劑腎病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為造影劑腎病是腎血管和腎小管相互作用的結(jié)果，氧化應(yīng)激和炎癥是其主要病理生理機(jī)制[10]。造影劑會(huì)引起滲透性利尿，增加液體的排出，使腎小管重吸收增加，增加氧耗，加重髓質(zhì)的缺血缺氧[11]。有研究結(jié)果表明，ROS 在造影劑引起的腎損害中發(fā)揮重要作用[12]。缺氧會(huì)促進(jìn)ROS 的產(chǎn)生，ROS 促進(jìn)腎臟氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腎小管細(xì)胞損傷[9,13]。

ASK1 是MAP3Ks 家族成員之一[14]。多種應(yīng)激損傷可以激活A(yù)SK1。ASK1 響應(yīng)各種壓力，如氧化應(yīng)激、鈣超載、炎癥信號(hào)等[15]，在凋亡、壞死、炎癥和纖維化中發(fā)揮重要作用[16]。ROS 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是ASK1 依賴性的[17]。越來越多的證據(jù)表明，ROSASK1 信號(hào)通路廣泛參與細(xì)胞凋亡過程[18-20]。ASK1激活JNK 和P38 MAPK，在細(xì)胞因子和應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中構(gòu)成一個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)通路，主要通過線粒體依賴的Caspase 激活來執(zhí)行凋亡，并受到Bcl-2 家族成員在內(nèi)的不同凋亡信號(hào)機(jī)制的嚴(yán)格調(diào)控[21-22]。造影劑誘導(dǎo)ROS 過量產(chǎn)生，通過ASK1-MAPKs 途徑激活Caspase-3，破壞HK2 線粒體酶活性，誘導(dǎo)線粒體膜電位下降，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[23]。

黃蜀葵花為錦葵科黃蜀葵的干燥花冠，其性甘、寒，歸腎、膀胱經(jīng)，具有清利濕熱、消腫解毒功效。高效液相色譜分析鑒定出黃蜀葵花有蘆丁、金絲桃苷、楊梅素、槲皮素等多種黃酮類化合物。臨床研究顯示，黃蜀葵花及其制劑能防治造影劑腎病[24-26]。ROS 過量生成可誘發(fā)氧化應(yīng)激，提示預(yù)防性使用抗氧化劑可干預(yù)造影劑腎病。

本研究結(jié)果顯示，碘普羅胺孵育的HK2 細(xì)胞ROS 呈時(shí)間依賴性升高，細(xì)胞活性明顯降低。Annexin V-FITC 和TUNEL 染色、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示碘普羅胺誘導(dǎo)HK2 細(xì)胞凋亡，Bcl-2、Bax 及Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)也支持該結(jié)果。TFA 干預(yù)后，上述現(xiàn)象都顯著減少，其結(jié)果與陽(yáng)性藥NAC干預(yù)趨勢(shì)相同，提示TFA 減輕碘普羅胺誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞凋亡。其次，本研究還發(fā)現(xiàn)TFA 可降低p-ASK1熒光表達(dá)，并下調(diào)P38、JNK 蛋白磷酸化表達(dá)水平，表明TFA 干預(yù)碘普羅胺誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞凋亡可能與抑制ROS-ASK1-MAPKs 信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，黃蜀葵花可以減少碘普羅胺誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與黃蜀葵花抑制ROSASK1-MAPKs 信號(hào)通路激活有關(guān)。