趙 丹， 羅俏俏， 王 欣， 王成濤，*

(1.北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心， 北京 100048；2.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心， 北京 100048)

腐乳與豆豉、醬油、豆醬并稱我國(guó)四大傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品、發(fā)酵調(diào)味品[1-2]。腐乳已有一千余年的歷史[3]，其味道鮮美、質(zhì)構(gòu)細(xì)膩、營(yíng)養(yǎng)豐富。在我國(guó)，腐乳的生產(chǎn)遍布南北各地，因添加配料不同，規(guī)格大小不一，品種與名稱繁多。各地腐乳的制作原理和發(fā)酵過程大致相同，即在一定環(huán)境條件下，豆腐坯經(jīng)自然或人工接種微生物，產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶等豐富高活性酶系，大豆蛋白酶解為鮮味氨基酸、呈味肽等，湯汁輔料中微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化為低分子醛、酮、酯等，形成腐乳的特征香氣和滋味成分[4]。

高鹽含量是中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵腐乳的重要特征。研究發(fā)現(xiàn)，高鹽飲食與高血壓、心臟病、腎臟疾病和腦出血的誘發(fā)有直接關(guān)系[5]，因此傳統(tǒng)發(fā)酵腐乳的低鹽化已成為發(fā)酵豆制品行業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)。由于食鹽在腐乳發(fā)酵和貯藏過程中可抑制腐敗菌、致病菌的生長(zhǎng)與存活，具有調(diào)味、助鮮等作用[6-7]，因此腐乳低鹽化面臨著諸多挑戰(zhàn)，尤其是在保障食品安全性及獨(dú)特風(fēng)味形成方面。

腐乳發(fā)酵產(chǎn)生的大量游離氨基酸是其特征風(fēng)味成分。腐乳發(fā)酵微生物的氨基酸代謝過程中，氨基酸經(jīng)脫羧酶催化脫羧反應(yīng)生成生物胺[6-7]。腐乳中可能含有組胺、色胺、腐胺、尸胺、酪胺、β-苯乙胺、精胺和亞精胺等生物胺，其中組胺、酪胺被認(rèn)為安全風(fēng)險(xiǎn)性較高[7-9]，食用含過量組胺的食物可造成食物不耐受，甚至可致食物中毒、偏頭痛[8-9]；食用富含過量酪胺的食品，會(huì)增加高血壓風(fēng)險(xiǎn)，也可導(dǎo)致偏頭痛[8-10]。腐乳中的生物胺已成為威脅大眾健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)因素，同時(shí)也是制約腐乳產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。

近年來，關(guān)于發(fā)酵豆制品、黃酒等食品中的生物胺形成與調(diào)控已有一些報(bào)道[9-13]。這些研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵食品中生物胺的生成需要滿足一定條件，即存在底物游離氨基酸、氨基酸脫羧酶及其產(chǎn)酶微生物，且具備并存的環(huán)境因素[9-11]。Chin等[10]研究不同鹽含量面醬發(fā)酵過程中生物胺的變化，發(fā)現(xiàn)3.5%～5.5%的食鹽可抑制組胺生成；Jia等[11]研究構(gòu)建適宜微生物群落，并將其應(yīng)用于降鹽豆瓣醬發(fā)酵；Zhao等[12]發(fā)現(xiàn)，接種發(fā)酵劑肉狀葡萄球菌、乳酸小球菌，對(duì)減少蠶豆醬發(fā)酵過程中生物胺的形成，效果良好；馬艷麗等[6,13]認(rèn)為，在腐乳后酵湯料中添加乳酸菌可有效抑制生物胺增加，腐乳開蓋后不同貯藏溫度下青方腐乳生物胺含量與pH值呈正相關(guān)；Li等[14]研究表明，生姜粉等香辛料可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)、降低生物胺含量。邢旋等[15]研究發(fā)現(xiàn)，添加強(qiáng)化戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)M28，可顯著降低黃酒中生物胺含量。

腐乳發(fā)酵過程中產(chǎn)生的生物胺，可通過單胺氧化酶降解生成乙醛、氨和過氧化氫[16]，因此提高單胺氧化酶活力，有利于減少腐乳發(fā)酵過程中生物胺的積累[17]。腐乳中單胺氧化酶主要來源于前發(fā)酵接種的毛霉和環(huán)境微生物，后發(fā)酵過程中湯汁微生物生長(zhǎng)及分泌，尤其后發(fā)酵過程中湯汁輔料決定了其微生物群落演替和相關(guān)酶系活性變化，進(jìn)而影響了腐乳中生物胺的降解與積累。目前，影響腐乳發(fā)酵過程中生物胺積累的因素及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律尚缺乏深入研究。本研究擬探討腐乳湯汁輔料中食鹽、酒精與pH值對(duì)腐乳發(fā)酵過程中單胺氧化酶活性及生物胺積累的影響，解析其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以期為低鹽化腐乳開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆腐坯、雅致毛霉，紹興咸亨食品股份有限公司。精制碘鹽、檸檬酸、乳酸、食用酒精、香辛料、紅曲粉，市售。丹磺酰氯、氫氧化鈉、碳酸鈉、生物胺標(biāo)準(zhǔn)品等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

LC- 20AT型高效液相色譜儀，日本島津公司；Alpha 2- 4 Ldplus型真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)CHRIST凍干機(jī)有限公司；SL- 650D型超聲波細(xì)胞破碎儀，南京順流儀器有限公司；恒溫水浴鍋，山東華魯電熱儀器有限公司；SpectraMax 13型連續(xù)波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices；PH400型精密pH計(jì)，安萊立思儀器科技(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1腐乳樣本制備

1)腐乳前發(fā)酵。在PDA平板上，于26 ℃培養(yǎng)毛霉48～72 h，滅菌蒸餾水沖洗過濾制備孢子懸液。將切塊均勻的豆腐坯(3 cm×3 cm×1 cm)碼放在籠屜內(nèi)，前后左右間距1 cm左右，毛霉孢子懸液均勻噴灑于豆腐坯表面，恒溫培養(yǎng)箱溫度26 ℃，空氣濕度85%～95%，培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)至白色菌絲包圍豆腐坯，涼花30 min后搓毛，制成腐乳毛坯。

2)腐乳后發(fā)酵。將毛坯分兩層均勻碼放于玻璃瓶中，灌入發(fā)酵湯料，用少量酒精擦拭封口進(jìn)行后發(fā)酵。在傳統(tǒng)腐乳制備工藝基礎(chǔ)上，本研究改良了腐乳制備工藝：毛坯未經(jīng)分層撒鹽腌制過程，直接灌入發(fā)酵湯料，于18～22 ℃進(jìn)行后發(fā)酵。發(fā)酵湯料配方為香辛料粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、紅曲粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%～4%，并通過控制食鹽、食用酒精、檸檬酸添加量，調(diào)節(jié)發(fā)酵湯汁的鹽含量、酒精含量與pH值。

1.3.2湯汁輔料腌制條件的設(shè)定

1)研究pH值對(duì)腐乳后發(fā)酵過程影響時(shí)，湯汁中食鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%、酒精的體積分?jǐn)?shù)為15%，pH值為4.5、5.0、5.5；2)研究食鹽對(duì)腐乳發(fā)酵過程影響時(shí)，湯汁中酒精的體積分?jǐn)?shù)為15%、pH值為5.5，鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、5%、7%；3)研究酒精對(duì)腐乳發(fā)酵過程影響時(shí)，湯汁中食鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%，pH值為5.5，酒精的體積分?jǐn)?shù)為15%、20%、25%，將鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%、酒精體積分?jǐn)?shù)為15%、pH值為5.5的腐乳湯汁作為對(duì)照組，該條件是傳統(tǒng)腐乳生產(chǎn)常見發(fā)酵條件。

1.3.3腐乳后發(fā)酵過程中單胺氧化酶活力檢測(cè)

根據(jù)生物胺氧化酶活力的定義：以混合生物胺為底物，1 min引起吸光值(ΔOD470)變化0.01所需要的酶量為一個(gè)酶活單位，U。參照文獻(xiàn)[16]檢測(cè)單胺氧化酶的活性。稱取2 g充分研磨的腐乳樣品置于7 mL離心管中，加入4 mL預(yù)冷PBS(0.1 mol/L、pH值為7.0)，漩渦震蕩15 min，離心取濾液進(jìn)行破碎。通過超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行冰浴超聲破碎30 min(破碎5 s，間隔5 s)，破碎功率為500 W，吸取上清液即為單胺氧化酶提取液。

1.3.4腐乳中生物胺含量的測(cè)定

樣品前處理：腐乳樣品凍干72 h并粉碎成粉，取1 g凍干腐乳粉于50 mL離心管中，然后加入10 mL 0.1 mol/L HCl，用16 000 r/min攪拌分離器均質(zhì)1 min，8 000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清液備用。采用柱前衍生高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，衍生方法參照文獻(xiàn)[17]的方法，采用丹磺酰氯柱前衍生法。

高效液相色譜檢測(cè)條件[17]：色譜柱Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，柱溫箱40 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，紫外檢測(cè)器254 nm，流動(dòng)相0.1 mol/L乙酸胺緩沖溶液(A相)，乙腈純?nèi)芤?B相)；梯度洗脫程序見表1。

圖1 不同湯汁輔料的腐乳發(fā)酵過程中單胺氧化酶活力的變化Fig.1 Changes of monoamine oxidase activity in Sufu with different soup accessories during fermentation

表1 梯度洗脫程序

混合標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精確稱取組胺、色胺、酪胺、腐胺、尸胺五種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品各50 mg，用0.1 mol/L HCl溶解，定容至50 mL，制備成生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液待用。將儲(chǔ)備液用0.1 mol/L的HCl配制成生物胺質(zhì)量濃度分別為500、380、250、100、50、30、10、5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。衍生結(jié)束后，用0.45 μm微孔濾膜過濾，經(jīng)高效液相分析后以各生物胺質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各檢測(cè)指標(biāo)均進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，采用OriginPro 2018軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并繪圖，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)確定數(shù)據(jù)間的差異性，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 湯汁輔料對(duì)腐乳后發(fā)酵過程中單胺氧化酶活力的影響

食鹽、酒精、pH值對(duì)腐乳后發(fā)酵過程中單胺氧化酶活力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖1(a)可見，食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%～7%，發(fā)酵初期(前30 d)單胺氧化酶活性呈下降趨勢(shì)，發(fā)酵中后期(40～80 d)活力回升。按食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)排序，單胺氧化酶活力從大到小依次為7%組、5%組、3%組，且鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%組酶活力顯著高于其余兩組(P<0.05)，提示后發(fā)酵過程中微生物可分泌單胺氧化酶，且相對(duì)高鹽環(huán)境有利于保持單胺氧化酶穩(wěn)定性。這可能與在低鹽環(huán)境下，腐乳發(fā)酵過程中的微生物更易代謝產(chǎn)酸，從而抑制單胺氧化酶的產(chǎn)酶量與活力有關(guān)。圖1(b)中，15%酒精組的單胺氧化酶活力高于其余兩組(P<0.05)，說明高酒精含量可能對(duì)單胺氧化酶活力產(chǎn)生了抑制作用。圖1(c)中，不同pH值條件下，單胺氧化酶活性基本呈現(xiàn)發(fā)酵初期下降、中后期活力回升趨勢(shì)，說明發(fā)酵微生物提高了單胺氧化酶活力；發(fā)酵后期，pH值越低，腐乳單胺氧化酶活力越低，說明低酸環(huán)境降低酶解活力，這一結(jié)果與楊春艷[16]的研究中認(rèn)為單胺氧化酶是一種堿性酶的推論一致。

2.2 湯汁輔料對(duì)腐乳后發(fā)酵過程中生物胺積累的影響

2.2.1食鹽的影響

采用高效液相色譜法分別測(cè)定了腐乳后發(fā)酵過程中不同種類生物胺含量，分析湯汁中食鹽對(duì)生物胺積累的影響(圖2)。由圖2可見，在不同食鹽濃度下，腐乳后發(fā)酵過程中生物胺總量及組胺、色胺、腐胺含量基本呈先升高的趨勢(shì)，其中組胺積累量隨后發(fā)酵過程逐漸升高趨勢(shì)更為明顯，尸胺積累量呈現(xiàn)逐漸減少趨勢(shì)，酪胺含量低且較穩(wěn)定。發(fā)酵20 d后各實(shí)驗(yàn)組組胺均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，尤其食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、5%組，組胺升高趨勢(shì)顯著高于其余組(P<0.05)；而3%、5%食鹽組，色胺和腐胺積累量均持續(xù)上升，7%食鹽組的色胺和腐胺積累量持續(xù)下降。3%食鹽組生物胺積累總量尤其突出，達(dá)到13.2 mg/g，其中組胺積累量高達(dá)8.2 mg/g，表明低鹽濃度下，腐乳中生物胺積累量升高，說明腐乳降鹽后需要考慮生物胺升高的風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)合圖1(a)分析，發(fā)酵30 d后，7%食鹽組單胺氧化酶活力持續(xù)升高，且顯著高于3%、5%食鹽組，表明單胺氧化酶對(duì)組胺、色胺、腐胺等不同生物胺的降解活力作用是不同的，這是導(dǎo)致不同種類生物胺含量差異的原因。

圖2 添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)食鹽的腐乳發(fā)酵過程中生物胺積累量的變化Fig.2 Changes of biogenic amine content during fermented processing of Sufu with different mass fractions of salt

2.2.2酒精的影響

圖3為湯汁中酒精對(duì)腐乳發(fā)酵過程中生物胺積累量影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖3表明，在后發(fā)酵過程中，15%～25%酒精濃度腐乳樣品中生物胺總量基本呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。腐乳樣品中組胺為主要生物胺組分，酪胺含量最低，這與Qiu等[18]的研究結(jié)果一致。分析發(fā)酵80 d時(shí)腐乳樣品的生物胺含量，高酒精濃度可抑制生物胺積累，當(dāng)酒精體積分?jǐn)?shù)大于20%時(shí)，對(duì)腐乳中腐胺、組胺、尸胺的生成抑制作用顯著；15%酒精組的樣本中色胺含量最低，結(jié)合圖1(b)分析，這可能與15%酒精組的單胺氧化酶活力高，加速了色胺降解有關(guān)。

圖3 添加不同體積分?jǐn)?shù)酒精的腐乳發(fā)酵過程中生物胺積累量的變化Fig.3 Changes of biogenic amine content during fermented processing of Sufu with different volume fractions of alcohol

2.2.3pH值的影響

圖4為不同pH值條件下腐乳中生物胺含量變化情況。由圖4可見，在腐乳后酵過程中生物胺總量及其不同種類生物胺量基本呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中pH值為 4.5組和pH值為 5.0組，在發(fā)酵20 d時(shí)生物胺總量呈現(xiàn)峰值，峰值出現(xiàn)時(shí)間早于pH值為 5.5組；pH值為5.5組，發(fā)酵45 d時(shí)出現(xiàn)峰值，且其峰值更高(達(dá)到6.8 mg/g)。從生物胺種類看，腐乳發(fā)酵積累的生物胺主要為組胺和色胺，發(fā)酵80 d時(shí)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到1.55、1.58 mg/g。結(jié)合圖1(c)分析，pH值為5.5組腐乳中單胺氧化酶活力最高，而該條件下生物胺積累量最高，表明低pH值環(huán)境對(duì)生物胺積累的抑制作用遠(yuǎn)大于單胺氧化酶的降解作用。發(fā)酵80 d時(shí)，pH值5.5組的色胺含量顯著低于其余兩組(P<0.05)，說明酸性環(huán)境對(duì)色胺無抑制作用或微生物發(fā)酵改變了湯料pH值，抑制了產(chǎn)生物胺微生物生長(zhǎng)繁殖及生物胺積累。

圖4 不同pH值的腐乳發(fā)酵過程中生物胺積累量的變化Fig.4 Changes of biogenic amine content during fermented processing of Sufu with different pH values

2.3 不同食鹽濃度湯汁的腐乳發(fā)酵過程中生物胺積累量與降鹽策略分析

圖5 不同食鹽、酒精濃度和pH條件下腐乳發(fā)酵過程中生物胺積累量的變化Fig.5 Changes of biogenic amine accumulation in Sufu fermented processing under different concentration of salt, alcohol and pH value

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，進(jìn)一步分析湯汁食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%～7%與調(diào)節(jié)不同pH值、酒精濃度配合時(shí)，腐乳后發(fā)酵生物胺積累量的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。圖5(a)中，當(dāng)食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，pH值為4.5與酒精體積分?jǐn)?shù)為25%的組，發(fā)酵過程中生物胺積累量顯著低于其余兩組(P<0.05)；圖5(b)中，當(dāng)食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，pH值為4.5與酒精體積分?jǐn)?shù)為25%的組，發(fā)酵前20 d生物胺積累更迅速，其余兩組20～45 d積累更快；圖5(c)中當(dāng)食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時(shí)，pH值為4.5與酒精體積分?jǐn)?shù)為25%的組，發(fā)酵前20 d生物胺積累量迅速達(dá)到峰值，顯著早于其余兩組到達(dá)峰值的時(shí)間。這些現(xiàn)象表征了腐乳后發(fā)酵過程中微生物演替及其單胺氧化酶對(duì)生物胺積累與降解的影響。

比較圖5中發(fā)酵80 d結(jié)束時(shí)各實(shí)驗(yàn)組生物胺積累量，當(dāng)pH值為5.5與酒精體積分?jǐn)?shù)為15%時(shí)，7%、5%和3%食鹽組樣品中生物胺積累量分別為4.86、6.62、13.15 mg/g；當(dāng)pH值為4.5與酒精體積分?jǐn)?shù)為25%時(shí)，7%、5%和3%食鹽組樣品的生物胺積累量分別為3.25、4.83、10.54 mg/g。研究結(jié)果表明，在相同食鹽濃度時(shí)，提高湯汁酒精濃度，降低其pH值有利于減少生物胺積累；腐乳降鹽后增加了生物胺積累的風(fēng)險(xiǎn)，降鹽的同時(shí)通過提高湯汁酒精濃度，降低pH值等綜合措施有利于降低生物胺積累的風(fēng)險(xiǎn)，因此開發(fā)低鹽化腐乳，降鹽的同時(shí)需要結(jié)合其他綜合措施消除食品安全風(fēng)險(xiǎn)。馬艷麗等[6,13]發(fā)現(xiàn)，腐乳后酵湯料添加乳酸菌可有效抑制生物胺積累；Zhao等[12]接種肉狀葡萄球菌、乳酸小球菌，可減少蠶豆醬發(fā)酵過程中生物胺形成，效果良好。類似綜合措施可應(yīng)用于低鹽化腐乳開發(fā)，該方面嘗試有待深入開展。

3 結(jié) 論

本研究探討了湯汁輔料對(duì)腐乳發(fā)酵過程中單胺氧化酶活力及生物胺積累的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：腐乳發(fā)酵過程中單胺氧化酶活性與生物胺積累量呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)性，腐乳湯汁的食鹽、酒精及pH值影響腐乳產(chǎn)品的生物胺積累及其組胺、色胺、腐胺、尸胺等種類組成，其中組胺、色胺為腐乳的主要生物胺組分，酪胺含量很低；在相同食鹽濃度時(shí)，提高湯汁酒精濃度、降低pH值有利于減少腐乳產(chǎn)品生物胺含量。在湯汁中食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%～7%、酒精體積分?jǐn)?shù)為15%～25%、pH值為4.5～5.5時(shí)，腐乳發(fā)酵前30 d呈現(xiàn)單胺氧化酶活性下降，發(fā)酵中后期(40～80 d)活性回升。生物胺總量及組胺、色胺積累量呈現(xiàn)先升高，45 d后逐漸降低趨勢(shì)；發(fā)酵20～45 d時(shí)，生物胺積累總量呈現(xiàn)峰值，基本維持在6.5 mg/g以下，以后逐漸降低；發(fā)酵80 d結(jié)束時(shí)，各組腐乳中生物胺積累量均為2.0～4.8 mg/g，組胺和色胺積累量為0.6～1.8 mg/g，但3%食鹽組生物胺積累較高。本研究表明，低鹽化腐乳開發(fā)，降鹽的同時(shí)需要配合提高酒精濃度、降低pH值的綜合措施，以提高其食品安全性及風(fēng)味品質(zhì)。