史 冊(cè) 張偉華 劉艷梅

肺癌屬于臨床常見(jiàn)惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，肺癌中80%以上屬于非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，早期 NSCLC患者術(shù)后5年總生存率可達(dá)86%，然而肺癌早期診斷較為困難，大部分NSCLC確診時(shí)已到晚期階段，5年生存率甚至在10%以下[1]?？p隙連接是細(xì)胞間信息交換重要通道，縫隙連接細(xì)胞間通訊在組織生長(zhǎng)、組織器官內(nèi)細(xì)胞間協(xié)調(diào)穩(wěn)定維持等諸多方面均具有重要作用[2]?？p隙連接蛋白(connexin,Cx)是由連接蛋白基因編碼的一組蛋白質(zhì)，作為縫隙連接基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)參與細(xì)胞生長(zhǎng)到死亡全部過(guò)程，包括生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖、分化、代謝和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定維持等[3]。Cx43屬于間隙連接蛋白家族主要成員，主要在心肌組織、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等中表達(dá)，可作為縫隙連接結(jié)構(gòu)與功能基礎(chǔ)[4]。細(xì)胞縫隙連接蛋白的表達(dá)水平則提示細(xì)胞間通迅功能強(qiáng)弱，如細(xì)胞縫隙連接蛋白少則提示該細(xì)胞功能較獨(dú)立或缺乏信息交通，所以Cx表達(dá)異常所致的細(xì)胞縫隙連接功能缺陷可能和多種腫瘤惡性增殖與轉(zhuǎn)化相關(guān)[5]?；诖耍狙芯糠治鯪SCLC患者癌組織Cx43表達(dá)水平，分析其表達(dá)與疾病臨床病理、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床的早期診斷、治療及預(yù)后判斷提供分子學(xué)依據(jù)，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取本院2013年12月至2017年12月收治的NSCLC行手術(shù)治療的患者76例，其中男性42例，女性34例；年齡41～79歲，平均(65.81±6.47)歲；吸煙史：有29例，無(wú)47例；病理類(lèi)型：鱗癌57例，腺癌19例；TNM分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期30例，Ⅲ期27例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無(wú)42例，有34例。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診為NSCLC；②可接受隨訪(fǎng)；③經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位或腫瘤類(lèi)型；②合并骨髓、血液、免疫疾病；③合并心腦血管疾??；④合并嚴(yán)重感染；⑤近3個(gè)月內(nèi)接受過(guò)放化療或外科手術(shù)。

1.3 檢測(cè)方法

標(biāo)本4 μm厚連續(xù)切片，60 ℃條件烘烤20 min，二甲苯脫蠟后梯度酒精連續(xù)脫水，PBS清洗(3次)，去離子水沖洗，室溫下，3%H2O2阻斷10 min，PBS清洗(3次)，抗原熱修復(fù)，PBS清洗(3次)。浸于10%的BSA中，室溫下孵育5 min，非特異性位點(diǎn)封閉，加一抗，4 ℃孵育，PBS清洗(3次)。滴加HRP標(biāo)記SP，43 ℃孵育30 min，PBS清洗(3次)，DAB顯色 10 min，PBS清洗，蘇木精溶液復(fù)染，鹽酸酒精分化，脫水10 min，封片觀察。

1.4 染色結(jié)果判斷

由兩位病理科醫(yī)師通過(guò)光學(xué)顯微鏡分析切片各位點(diǎn)，確定蛋白表達(dá)，閱片者均在對(duì)研究對(duì)象一般資料不了解的前提下獨(dú)立閱片和分析，對(duì)于判定結(jié)果意見(jiàn)存在分歧的切片，協(xié)商討論達(dá)成一致。高倍鏡下選取5個(gè)視野，保證每一視野中可觀察到的細(xì)胞數(shù)在200個(gè)以上，Cx43陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，依陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度與比例判定Cx43蛋白表達(dá)結(jié)果[6]：著色程度：無(wú)(0分)，淡黃(1分)，棕黃(2分)，棕褐(3分)；陽(yáng)性細(xì)胞比例：陰性(0分)，1%～25%(1分)，>25%～50%(2分)，>50%～75%(3分)，>75%～100%(4分)；染色分級(jí)為著色程度與陽(yáng)性細(xì)胞比例乘積，<6分為低表達(dá)，≥6分代表高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)與率(%)表示，組間采用χ2檢驗(yàn)比較；采用Logistic回歸分析影響Cx43蛋白在NSCLC癌組織中的表達(dá)水平的因素，通過(guò)Kaplain-Maier方法描繪生存曲線(xiàn)，計(jì)算Cx43蛋白高表達(dá)與低表達(dá)患者生存率，并用Log-rank檢驗(yàn)，P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cx43蛋白在NSCLC癌組織中的表達(dá)

NSCLC癌組織中Cx43蛋白高表達(dá)率為35.53%(27/75)，低于癌旁組織的76.32%(58/76)(χ2=25.649，P<0.05)。

2.2 NSCLC癌組織中Cx43蛋白表達(dá)與臨床病理特征參數(shù)的關(guān)系

性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、病理類(lèi)型與NSCLC患者癌組織中Cx43蛋白表達(dá)水平無(wú)關(guān)(P>0.05)；低分化、臨床分期Ⅲ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者Cx43蛋白高表達(dá)率均低于中高分化、臨床分期Ⅰ期或Ⅱ期、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 NSCLC癌組織中Cx43蛋白表達(dá)與臨床病理特征參數(shù)的關(guān)系/例

2.3 影響NSCLC癌組織中Cx43蛋白表達(dá)的Logistic回歸分析

將上述因素差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義項(xiàng)納入多因素Logistic回歸模型，以Cx43蛋白表達(dá)作為因變量，Cx43蛋白(高表達(dá)=0，低表達(dá)=1)，以上述差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義項(xiàng)作為自變量，并進(jìn)行賦值，分化程度(高分化=0，中分化=1，低分化=2)、臨床分期(Ⅰ期=0，Ⅱ期=1，Ⅲ期=2)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(未發(fā)生=0，發(fā)生=1)，Logisitic回歸分析顯示分化程度低、臨床分期高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致Cx43蛋白低表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表2。

表2 影響NSCLC癌組織中Cx43蛋白表達(dá)的Logistic回歸分析

2.4 NSCLC癌組織中Cx43蛋白表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系

隨訪(fǎng)3年，根據(jù)患者隨訪(fǎng)情況，繪制3年無(wú)進(jìn)展生存曲線(xiàn)和總生存曲線(xiàn)，如圖1、圖2。Cx43蛋白高表達(dá)者3年無(wú)進(jìn)展生存率與總生存率分別為：66.67%(18/27)、77.78%(21/27)，高于Cx43蛋白低表達(dá)者的42.86%(21/49)、51.02%(25/49)(P<0.05)。

圖1 3年無(wú)進(jìn)展生存分析

圖2 3年總生存分析

3 討論

肺癌大多數(shù)起源于支氣管黏膜或腺體，因此又被稱(chēng)為原發(fā)性支氣管肺癌，是全球發(fā)病率與死亡率相對(duì)較高的癌癥類(lèi)型。肺癌病因較多，包括吸煙、職業(yè)暴露、空氣污染、飲食不良以及遺傳易感性等。近年來(lái)，NSCLC發(fā)病率增加，且以老年人群為主，NSCLC癌細(xì)胞生長(zhǎng)分裂速度較為緩慢，擴(kuò)散轉(zhuǎn)移一般較晚，因?yàn)樵缙诨颊甙Y狀一般不明顯[7]。

相鄰細(xì)胞間信息與能量物質(zhì)交換對(duì)于細(xì)胞新陳代謝、增殖、分化等生理過(guò)程均十分重要，該過(guò)程主要通過(guò)細(xì)胞間間隙連接通訊實(shí)現(xiàn)[8]。間隙連接通訊結(jié)構(gòu)與功能異常參與多種疾病尤其是腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。間隙連接普遍存在于動(dòng)物組織中，位于細(xì)胞相鄰面，是相鄰細(xì)胞溝通的跨膜通道。目前哺乳動(dòng)物連接蛋白家族包括 21種跨膜蛋白，依據(jù)家族基因編碼蛋白質(zhì)分子量命名，如Cx26、Cx32、Cx43等[9]。近年來(lái)研究表明[10]Cx在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)為降低甚至缺失，而其周?chē)徴＜?xì)胞縫隙連接蛋白功能正常，Cx表達(dá)上調(diào)或縫隙連接蛋白功能改善可抑制腫瘤發(fā)生或逆轉(zhuǎn)其表型。Cx43屬于抑癌基因，和惡性腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，惡性腫瘤Cx基因抑制，常處于失活狀態(tài)，隨Cx43表達(dá)下降和缺失，可導(dǎo)致連接通信功能減退，細(xì)胞間信號(hào)傳遞、增殖分化受到影響，導(dǎo)致人體內(nèi)環(huán)境紊亂，腫瘤細(xì)胞惡性演變[11]。

Liu G等[12]研究發(fā)現(xiàn)，基因轉(zhuǎn)染技術(shù)誘導(dǎo)Cx 基因表達(dá)后可明顯抑制轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)及腫瘤形成。相關(guān)研究表明，Cx43異常表達(dá)與腎臟腫瘤、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮平滑肌肉瘤、前列腺癌等的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究中NSCLC患者癌組織Cx43高表達(dá)率低于癌旁組織，表明Cx43蛋白表達(dá)率降低也是NSCLC發(fā)生的原因之一。在腫瘤細(xì)胞中，Cx43 表達(dá)的降低或缺失使細(xì)胞間通訊出現(xiàn)異常，機(jī)體對(duì)細(xì)胞的監(jiān)視與調(diào)控力減弱，細(xì)胞過(guò)度克隆生長(zhǎng)，Cx43表達(dá)升高促進(jìn)間隙連接蛋白組裝，增加細(xì)胞間信號(hào)交流，控制細(xì)胞之間的生長(zhǎng)[13]。郭愛(ài)萍等[14]研究利用免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)，Cx43染色強(qiáng)度及陽(yáng)性率隨肺癌分化程度下降而呈現(xiàn)出降低趨勢(shì)。本研究進(jìn)一步分析Cx43蛋白表達(dá)水平與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示Cx43蛋白表達(dá)水平與鱗癌和腺癌病理類(lèi)型以及腫瘤大小無(wú)相關(guān)性，但與癌組織分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有一定的關(guān)系，Cx43蛋白表達(dá)隨著分化程度降低、臨床分期增高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Cx43在NSCLC癌組織中的表達(dá)呈降低趨勢(shì)，提示Cx43蛋白可能參與NSCLC的進(jìn)展。Cx43通過(guò)細(xì)胞間連接的穩(wěn)定性維持，參與到細(xì)胞增殖調(diào)控、凋亡及細(xì)胞間信號(hào)和刺激傳遞等，使腫瘤細(xì)胞重新恢復(fù)細(xì)胞連接通訊，達(dá)到抑制腫瘤發(fā)展的目的[15]。本研究對(duì)76例NSCLC患者3年生存率進(jìn)行分析，應(yīng)用Kaplan-Meier法分析Cx43蛋白表達(dá)水平與NSCLC預(yù)后之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示NSCLC癌組織中Cx43蛋白低表達(dá)的患者，其3年總生存率與無(wú)進(jìn)展生存率均低于Cx43蛋白高表達(dá)者，說(shuō)明Cx43蛋白表達(dá)水平與NSCLC患者生存時(shí)間有關(guān)，Cx43蛋白表達(dá)水平可被用作判斷 NSCLC患者預(yù)后的指標(biāo)。

綜上所述，Cx43蛋白在NSCLC癌組織中的表達(dá)下調(diào)，與NSCLC的發(fā)生及組織分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，Cx43蛋白表達(dá)是NSCLC 患者總生存期的預(yù)后生物分子標(biāo)志物，Cx43蛋白低表達(dá)可預(yù)示患者不良預(yù)后。