宋 雪，劉 晗，李昭璇，李八方，侯 虎,

1. 中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003

2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237

止血敷料常用于傷口的基礎(chǔ)治療，以達(dá)到快速止血的目的。然而傳統(tǒng)的止血敷料存在很多問(wèn)題，例如材料來(lái)源單一、止血時(shí)間較長(zhǎng)、易粘連傷口、體內(nèi)降解性較差、力學(xué)性能較差等，已不能滿足傷者們的緊急醫(yī)療需求[1]。因此，針對(duì)傳統(tǒng)醫(yī)用敷料的局限性，開(kāi)發(fā)一種具有良好機(jī)械性能、保水性能和止血性能的新型可吸收醫(yī)用敷料，成為目前生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一[2]。目前，常用的止血材料包含以下幾種：1) 沸石類敷料，具有多孔結(jié)構(gòu)，能夠迅速吸收血液中的水分促進(jìn)凝血，但容易引發(fā)炎癥反應(yīng)；2) 氧化纖維素類敷料，通過(guò)羧基與血紅蛋白中的鐵離子形成凝膠狀物質(zhì)進(jìn)行止血，但在過(guò)程中產(chǎn)生的酸性環(huán)境會(huì)引起神經(jīng)損傷；3) 明膠、膠原和多糖類敷料，生物相容性較高，具有較高的止血活性，是目前研究的熱點(diǎn)，但單獨(dú)使用時(shí)存在機(jī)械性能較差、易脫落等缺點(diǎn)。因此，本研究考慮將不同的天然高分子材料進(jìn)行共混交聯(lián)，改善單一材料的局限性，并發(fā)揮其在止血性能中的復(fù)配協(xié)同作用[3]。

明膠作為一種可吸收的天然生物材料，因具有生物相容性、生物降解性、低免疫原性而受到廣泛關(guān)注[4]。明膠具有良好的止血活性，能夠吸收大量血液，并能激活血小板的附著和凝血因子釋放，封閉創(chuàng)面?zhèn)趯?shí)現(xiàn)快速止血[5]。目前，?；蜇i來(lái)源的明膠止血海綿已應(yīng)用于外科手術(shù)之中[6]。太平洋鱈(Gadus macrocephalus) 是世界上重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，從鱈魚(yú)皮副產(chǎn)物中提取明膠可以避免陸地源疾病和宗教的影響，避免資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。但純明膠海綿存在機(jī)械性能較差、易破損、難止住大傷口出血等缺點(diǎn)，所以要獲得高性能的明膠止血產(chǎn)品，需將其與其他類型的止血材料復(fù)配進(jìn)行改性[7-9]。褐藻來(lái)源的海藻酸鈉是一種由β-1,4-d-甘露糖醛酸和α-1,4-d-古洛糖醛酸構(gòu)成的天然線性共聚物[10]，具有生物降解性好、生物相容性高和易于進(jìn)行化學(xué)改性的優(yōu)點(diǎn)，且具有止血活性以及易于形成凝膠的性質(zhì)，可以作為明膠復(fù)配的良好選擇[11]。已研究開(kāi)發(fā)出明膠海藻酸鈉水凝膠支架用于骨組織缺損修復(fù)[12]和細(xì)胞遷移[13]，但對(duì)其復(fù)合材料的止血效果尚未探究。

本研究將鱈魚(yú)皮源明膠與海藻酸鈉進(jìn)行共混并交聯(lián)，制備出一種具有良好機(jī)械性能和止血活性的可吸收型復(fù)合止血敷料。通過(guò)測(cè)定該復(fù)合止血敷料的力學(xué)性能、結(jié)構(gòu)特征等指標(biāo)從而確定其制備的最佳工藝條件，并評(píng)價(jià)了該敷料的止血性能、生物相容性，初步探究了其止血機(jī)制，為新型止血醫(yī)用材料的開(kāi)發(fā)提供重要參考及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

太平洋鱈冷凍魚(yú)皮由青島浩源有限公司提供；戊二醛和十二烷基硫酸鈉 (SDS) 購(gòu)自Sigma有限公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

市售鱈魚(yú)皮明膠購(gòu)自青島東易科技有限公司；市售明膠海綿購(gòu)自江西祥恩醫(yī)療科技發(fā)展有限公司；活化部分凝血酶時(shí)間 (Activated partial thromboplastin time, APTT)、凝血酶原時(shí)間 (Prothrombin time, PT) 和凝血酶時(shí)間 (Thrombin time, TT) 檢測(cè)試劑盒，血栓烷素B2(TXB2)、血小板第四因子(PF4) 和P-選擇素檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Wistar大鼠 (210±10) g購(gòu)自山東魯抗醫(yī)學(xué)質(zhì)量檢驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 鱈魚(yú)皮明膠的制備

太平洋鱈魚(yú)皮明膠的制備參考Hou等[14]的方法。解凍清洗后的小塊鱈魚(yú)皮經(jīng)0.1 mol·L-1的氫氧化鈉 (NaOH) 溶液 (質(zhì)量體積比1∶25) 和0.1 mol·L-1的鹽酸 (HCl) 溶液 (質(zhì)量體積比 1∶25)浸泡處理后，沖洗至中性。將充分溶脹的魚(yú)皮放入錐形瓶中，在55 ℃的條件下水浴搖床振蕩提取4 h。提取液經(jīng)過(guò)濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后凍干得到鱈魚(yú)皮明膠。

1.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)

采用Laemmli[15]的方法配置7.5%分離膠和5%濃縮膠，電泳采用直流恒壓電源，電壓100 V，跑至距離膠邊緣約1 cm處。將膠置于考馬斯亮藍(lán)R-250中染色10～15 min，隨后用脫色液脫色過(guò)夜。

1.4 醫(yī)用復(fù)合止血海綿的制備

將 1、5、10、15、20 mg·mL-1的明膠溶液按體積比15∶8與海藻酸鈉溶液混合，在混合溶液中加入戊二醛溶液作為交聯(lián)劑，于4 ℃靜置24 h進(jìn)行交聯(lián)。真空脫氣15～30 min后，溶液倒入不銹鋼平板中，于-40 ℃下預(yù)凍12 h，冷凍干燥后得到鱈魚(yú)皮明膠復(fù)合止血敷料。

1.5 理化特征

1.5.1 吸水性

將敷料剪成1.0 cm3的立方塊，準(zhǔn)確稱量記為w0。室溫條件下，浸沒(méi)于蒸餾水中充分吸水，隨后用鑷子將其輕輕提出水面，放置在濾網(wǎng)中除去表面多余的水，再次精確稱量記為w1。3次測(cè)量，取平均值。吸水倍數(shù)的計(jì)算公式為[16]：

式中：w0為海綿干質(zhì)量 (g)；w1為海綿濕質(zhì)量 (g)。

1.5.2 持水力

在測(cè)定吸水率的基礎(chǔ)上，將膨脹狀態(tài)下的海綿進(jìn)行離心。離心后海綿的質(zhì)量為w2。持水力計(jì)算公式為[17]：

式中：w0為海綿的干質(zhì)量(g)；w1為海綿的濕質(zhì)量(g)；w2為排水后海綿的質(zhì)量 (g)。

1.5.3 交聯(lián)度

取敷料3～5 mg加入1 mL 碳酸氫鈉 (NaHCO3)溶液和1 mL 三硝基苯磺酸 (TNBS) 溶液 (5 mg·mL-1)，40 ℃ 反應(yīng) 2 h。隨后加入 3 mL 6 mol·L-1的HCl溶液，60 ℃反應(yīng)90 min。溶液經(jīng)去離子水稀釋至5 mL，測(cè)定其在345 nm處的吸光值。吸光值與游離氨基數(shù)存在以下關(guān)系[18]：

式中：[NH2]為賴氨酸側(cè)鏈ε-氨基含量；A為吸光度；V為溶液體積(mL)；ε=14.600；l為路徑長(zhǎng)度(cm)；m為樣品的質(zhì)量 (mg)。

根據(jù)以下公式計(jì)算交聯(lián)度 (%)：

式中：[NH2]為游離氨基質(zhì)量摩爾濃度 (mol·g-1)，下標(biāo)m和n分別表示交聯(lián)和無(wú)交聯(lián)樣品。

1.5.4 機(jī)械試驗(yàn)

將制備好的敷料剪成適當(dāng)大小，兩端固定在拉力機(jī)上，初始距離為15 mm，測(cè)試速度為60 mm·s-1，力度為300 N[19]。每組樣品平行測(cè)試9次。

抗張強(qiáng)度 (MPa)的計(jì)算公式為：

式中：Fmax為樣品斷裂瞬間的最大張力 (N)；S為樣品的橫截面積 (mm2)。

斷裂伸長(zhǎng)率的計(jì)算公式為：

式中：ΔL為樣品斷裂時(shí)延伸的位移 (mm)；L為標(biāo)距 (mm)。

1.6 體內(nèi)止血評(píng)價(jià)

1.6.1 股動(dòng)脈模型

大鼠麻醉后，暴露其右側(cè)股動(dòng)脈并于相同位置處切開(kāi)，然后迅速將復(fù)合止血敷料覆蓋在出血部位，施加連續(xù)壓力，每15 s觀察1次。以無(wú)菌紗布和市售明膠海綿作為對(duì)照，分別記錄止血時(shí)間。

1.6.2 肝損傷模型

麻醉大鼠后，打開(kāi)腹腔，暴露出肝臟中葉，從肝臟尖端1 cm處進(jìn)行切割，制備肝臟出血模型。其余操作同上，分別記錄止血時(shí)間。

1.6.3 尾部模型

大鼠的尾部用75%乙醇消毒，在尾部的1/3處拉直并切割。其余操作同上，分別記錄止血時(shí)間。

1.7 APTT、PT、TT 分析和 TXB2、PF4、P-選擇素檢測(cè)

APTT、PT、TT分析分別按照相應(yīng)檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)測(cè)定。血小板活化因子檢測(cè)按照TXB2、PF4和P-選擇素檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)測(cè)定。

1.8 生物相容性評(píng)價(jià)

參考GB/T 16886.11—2011《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第11部分：全身毒性試驗(yàn)》進(jìn)行全身急性毒性試驗(yàn)；參考GB/T 16886.10—2017《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第10部分：刺激與皮膚致敏試驗(yàn)》進(jìn)行刺激性試驗(yàn)；參考GB/T 16886.4—2016《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第4部分：與血液相互作用試驗(yàn)選擇》進(jìn)行溶血試驗(yàn)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用單因素方差分析 (One-way ANOVA)進(jìn)行處理，并采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。數(shù)值數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差()”表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE圖譜分析

采用SDS-PAGE對(duì)自提鱈魚(yú)皮明膠樣品和市售明膠的亞基成分進(jìn)行了分析。自提鱈魚(yú)皮明膠由3條α鏈 (α1，α2和α3) 和1條β鏈構(gòu)成，與斑點(diǎn)叉尾鮰 (Ictalurus punctatus) 和胡鯰 (Clarias gariepinus)皮中提取的明膠結(jié)構(gòu)類似[20-21]，具有典型的Ⅰ型膠原蛋白電泳條帶特征 (圖1) 。α鏈分子量在100～135 kD，由于α1和α3分子量十分接近，所以在SDS-PAGE凝膠上形成一個(gè)難以區(qū)分的條帶。自提鱈魚(yú)皮明膠β鏈的分子量約為245 kD，但在市售明膠的電泳圖譜中沒(méi)有觀察到清晰的條帶。根據(jù)SDSPAGE結(jié)果推斷出鱈魚(yú)皮明膠是由Ⅰ型膠原蛋白變性得到的，與市售明膠對(duì)比，自提鱈魚(yú)皮明膠樣品條帶清晰，幾乎沒(méi)有降解，可以作為醫(yī)用止血敷料的主要材料。

圖1 鱈魚(yú)皮明膠的SDS-PAGE電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE patterns of Pacific cod skin gelatin

2.2 不同明膠濃度對(duì)止血敷料理化表征的影響

不同明膠濃度對(duì)復(fù)合止血敷料理化性能的影響見(jiàn)表1。隨著明膠濃度的增加，復(fù)合敷料的抗張強(qiáng)度從 (0.010 0±0.003 7) MPa提高至 (0.085 9±0.003 6) MPa，斷裂伸長(zhǎng)率從 (7.54±0.37)%下降到(1.36±0.30)%。明膠質(zhì)量濃度超過(guò)10 mg·mL-1時(shí)，其抗張強(qiáng)度間無(wú)明顯差異 (P＞0.05)，而斷裂伸長(zhǎng)率則隨著明膠濃度的增大而逐漸減小，說(shuō)明隨著明膠濃度的增大，復(fù)合止血敷料的脆性和硬度增加，導(dǎo)致延伸性受到較大影響。如果敷料的機(jī)械強(qiáng)度較差則不能抗擊血液沖擊，容易造成二次出血，因此機(jī)械強(qiáng)度是衡量敷料質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。

表1 不同明膠濃度對(duì)復(fù)合止血敷料理化性能的影響Table 1 Physical and chemical properties of composite hemostatic sponge with different gelatin concentration

因?yàn)榉罅闲枰沾罅康膫跐B出物，防止細(xì)菌入侵傷口，因此吸水性和持水性是其理化性質(zhì)的重要指標(biāo)。吸水性的變化趨勢(shì)與抗張強(qiáng)度相同，明膠質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1時(shí)，取得最大倍數(shù)(49.20±2.24)，高于王運(yùn)智[22]通過(guò)冷凍干燥法和自組裝法得到的魚(yú)皮膠原止血海綿的吸水倍數(shù)(33.6和11.9)。明膠海綿的高吸水性使其在應(yīng)用時(shí)可吸附大量血液，從而對(duì)滲血表面造成局部壓迫，達(dá)到止血目的。持水性則隨著明膠濃度的增加從(21.00±0.20)% 升至 (37.99±0.30)%。當(dāng)明膠質(zhì)量濃度低于10 mg·mL-1時(shí)，敷料微觀結(jié)構(gòu)比較松散，吸水后無(wú)法保持較為完整的形狀。當(dāng)明膠質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1時(shí)，敷料結(jié)構(gòu)過(guò)于緊密，孔隙較小，導(dǎo)致吸水性能下降但持水率較高。

戊二醛可以與明膠中賴氨酸和羥基賴氨酸殘基的自由氨基反應(yīng)形成席夫堿型化合物，還可以與海藻酸鈉陰離子結(jié)構(gòu)表面的羥基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。交聯(lián)度隨著明膠濃度的增大而減小，明膠質(zhì)量濃度超過(guò)10 mg·mL-1時(shí)變化不大 (P＞0.05)。這說(shuō)明在明膠濃度較低時(shí)，暴露出的交聯(lián)位點(diǎn)能夠完全被戊二醛利用，隨著明膠濃度的增加，所能交聯(lián)的位點(diǎn)是有限的，所以交聯(lián)度逐漸趨于穩(wěn)定。

綜上所述，明膠質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1時(shí)，醫(yī)用復(fù)合止血敷料具有良好的物理性能，有利于快速吸收滲出物和血漿，加速凝血過(guò)程。

2.3 大鼠股動(dòng)脈模型、肝損傷模型及尾部模型的止血效果

斷尾止血實(shí)驗(yàn)過(guò)程見(jiàn)圖2-a。與自然止血組的(485±11) s相比，實(shí)驗(yàn)組和市售明膠海綿組均能明顯縮短斷尾止血所用時(shí)間(P＜0.01)，且實(shí)驗(yàn)組止血時(shí)間要短于市售明膠海綿組(P＜0.05)。肝創(chuàng)面模型的實(shí)驗(yàn)過(guò)程見(jiàn)圖2-b，止血指標(biāo)的結(jié)果表明(圖2-d)，實(shí)驗(yàn)組止血時(shí)間為 (108±4) s，短于羅非魚(yú) (Oreochromis mossambicus) 魚(yú)皮膠原海綿 (131 s)[22]。股動(dòng)脈模型的實(shí)驗(yàn)過(guò)程見(jiàn)圖2-c，切開(kāi)動(dòng)脈，立刻有大量血液涌出且壓力較大，對(duì)止血敷料的要求較高，自然止血組無(wú)法在一定時(shí)間完成止血。實(shí)驗(yàn)組的止血時(shí)間為 (64±9) s，明顯優(yōu)于市售明膠海綿組的 (87±9) s (P＜0.01)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組對(duì)出血量大、壓力強(qiáng)的動(dòng)脈出血有一定的控制作用。

圖2 復(fù)合止血敷料的止血性能評(píng)價(jià)Fig. 2 Hemostatic evaluation in vivo with different model

結(jié)果表明，明膠復(fù)合止血敷料的吸水性和多孔結(jié)構(gòu)有利于血液的吸收，同時(shí)明膠與海藻酸鈉起到了復(fù)配協(xié)同止血效果[23]。Wang等[24]制備了含海藻酸鈣多孔微球的殼聚糖復(fù)合海綿，與純殼聚糖和凝膠海綿相比，可以縮短止血時(shí)間、減少失血量。因此，將海藻酸鈉共混到明膠中，可促進(jìn)血小板黏附和各種凝血因子的活化[25]。復(fù)合止血敷料在吸收組織滲出液后轉(zhuǎn)變?yōu)槟z形態(tài)，可以持續(xù)為傷口提供潮濕環(huán)境，促進(jìn)傷口愈合。

2.4 APTT、PT、TT分析和血小板活性因子檢測(cè)

APTT是內(nèi)源凝血系統(tǒng)較為敏感和最為常用的篩選指標(biāo)，PT測(cè)定是外源性凝血系統(tǒng)的篩選實(shí)驗(yàn)，TT是指在血漿中加入標(biāo)準(zhǔn)化的凝血酶后血液凝固的時(shí)間。因此，試驗(yàn)采用APTT、PT和TT分析方法探討明膠復(fù)合止血敷料誘導(dǎo)的凝血途徑。與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組在第5、第15、第30和第60 分鐘4個(gè)不同浸提時(shí)間點(diǎn)的APTT均有極顯著降低(P＜0.01，圖3-a)，說(shuō)明內(nèi)源性凝血系統(tǒng)是明膠復(fù)合止血敷料的主要凝血途徑。據(jù)報(bào)道，海藻酸鈉的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以為血細(xì)胞提供支持，吸收大量的血液，激活傷口附近的凝血因子，誘導(dǎo)凝血的內(nèi)部通路[25]。復(fù)合止血敷料和市售明膠海綿對(duì)PT無(wú)顯著影響 (圖3-b)，表明它不刺激外源性的凝血途徑。明膠復(fù)合止血敷料和市售明膠海綿在第5、第15和第60分鐘時(shí)TT顯著降低(P＜0.01，圖3-c)，通過(guò)縮短凝血接觸活化時(shí)間實(shí)現(xiàn)快速止血。Li等[26]證實(shí)，明膠微球能有效誘導(dǎo)紅細(xì)胞聚集，改善凝血時(shí)間。Zhang等[27]發(fā)現(xiàn)殼聚糖/硅藻-生物硅復(fù)合海綿通過(guò)激活內(nèi)源性凝血途徑加速了凝血。因此，明膠復(fù)合止血敷料可激活內(nèi)源性凝血途徑和共同凝血途徑，縮短血液凝固接觸活化時(shí)間，活化Ⅷ、Ⅻ、Ⅺ等凝血因子，達(dá)到快速止血的目的。

對(duì)血小板活性因子TXB2、PF4和P-選擇素的含量進(jìn)行測(cè)定，可以判定明膠復(fù)合止血敷料對(duì)血小板黏附、聚集和活化等生理功能的作用，結(jié)果見(jiàn)圖3-d—3-f。與對(duì)照組相比，其他各組均能顯著增加血小板活性因子的釋放量 (P＜0.05)，從而快速有效激活血小板。此外，浸提時(shí)間的長(zhǎng)短并不影響血小板活性因子的釋放。

圖3 不同樣品對(duì)活化部分凝血酶時(shí)間、凝血酶原時(shí)間和凝血酶時(shí)間血小板活性釋放因子血栓烷素B2、血小板第四因子和P-選擇素的影響Fig. 3 Effect of different samples on APTT, PT, TT and release of platelet active factors (TXB2, PF4 and P-selection)

綜上所述，復(fù)合止血敷料在兩方面表現(xiàn)出有效的止血能力：1) 復(fù)合止血敷料具有適當(dāng)尺寸和分布均勻的三維網(wǎng)絡(luò)多孔結(jié)構(gòu)，使其具有快速的液體吸收性和良好的機(jī)械性能；2) 明膠海藻酸鈉復(fù)合敷料能夠激發(fā)內(nèi)源性凝血途徑和共同凝血途徑，加速各種凝血因子的釋放從而加速凝血[28]。

2.5 生物相容性評(píng)價(jià)

急性全身毒性試驗(yàn)是生物安全評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)，通常用于評(píng)價(jià)生物醫(yī)學(xué)材料或其浸出液對(duì)人體的影響[29]。對(duì)大鼠注射后的日常活動(dòng)、存活狀況和中毒情況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組的大鼠在觀察期72 h內(nèi)，無(wú)任何中毒癥狀發(fā)生，而陽(yáng)性對(duì)照組則在注射后隨即出現(xiàn)明顯的震顫和驚厥反應(yīng)，活動(dòng)量和爬行速度明顯下降。注射后72 h內(nèi)各組大鼠的平均體質(zhì)量見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組的大鼠體質(zhì)量變化均呈穩(wěn)步增長(zhǎng)趨勢(shì)，說(shuō)明制備的鱈魚(yú)皮明膠復(fù)合止血敷料無(wú)急性毒性，符合醫(yī)用材料全身急性毒性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

采用皮膚刺激試驗(yàn)和皮內(nèi)刺激試驗(yàn)評(píng)價(jià)明膠醫(yī)用敷料的刺激效果。相較于b處陽(yáng)性對(duì)照組出現(xiàn)嚴(yán)重的皮膚變紅以及組織腫脹等刺激現(xiàn)象，a、d處的實(shí)驗(yàn)組浸提液并未引起任何的皮膚刺激問(wèn)題，注射后72 h內(nèi)皮膚狀態(tài)均表現(xiàn)良好，與c處的陰性對(duì)照組結(jié)果一致，說(shuō)明鱈魚(yú)皮明膠復(fù)合止血敷料對(duì)皮膚無(wú)潛在刺激作用 (圖4)。受損皮膚刺激實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)組部分大鼠出現(xiàn)輕微紅斑，但24 h后消失。復(fù)合止血敷料的原發(fā)性刺激指數(shù)(PII) 為0.22，小于0.5，屬于極輕微刺激性，制備的明膠復(fù)合止血敷料符合生物材料單次接觸皮膚試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

圖4 注射24 h、48 h和72 h后的皮內(nèi)刺激情況Fig. 4 Intradermal stimulation at 24th, 48th and 72nd hour after injection

溶血率是血液與材料相互作用的體外評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[30]。GB/T 16886指出材料與血液接觸時(shí)紅細(xì)胞的破裂率不宜過(guò)高，即溶血率低于5%的材料才具備良好的血液相容性。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的鱈魚(yú)皮明膠復(fù)合止血敷料的溶血率為1.51%，低于5% (表2)，符合國(guó)家生物材料評(píng)價(jià)規(guī)定的安全范圍。

表2 急性全身毒性試驗(yàn)、皮膚刺激試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of acute systemic toxicity assay, dermal irritation test and hemolysis ratio

生物材料進(jìn)入臨床的必要評(píng)價(jià)是生物安全性評(píng)價(jià)，綜上所述，鱈魚(yú)皮明膠復(fù)合止血敷料符合國(guó)家醫(yī)療器械相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，為其臨床應(yīng)用提供了安全性理論依據(jù)。

3 結(jié)論

本文以鱈魚(yú)皮為原料提取明膠，并通過(guò)SDSPAGE對(duì)其亞基結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。在交聯(lián)劑作用下將鱈魚(yú)皮明膠與海藻酸鈉進(jìn)行復(fù)配，冷凍干燥得到復(fù)合止血敷料。該復(fù)合敷料具有良好的機(jī)械性能、吸水性、持水性和均一的多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，符合傷口海綿的要求。明膠復(fù)合止血敷料可以明顯縮短APTT和TT，激活內(nèi)源性凝血途徑和共同凝血途徑，還可以明顯增加TXB2、PF4和P-選擇素的釋放量，通過(guò)激活血小板來(lái)加速凝血過(guò)程。此外，一系列的生物相容性實(shí)驗(yàn)表明，復(fù)合止血敷料無(wú)全身急性毒性，不會(huì)引起紅斑、水腫等皮膚刺激現(xiàn)象，溶血率為1.51%，符合國(guó)家醫(yī)療器械標(biāo)準(zhǔn) (＜5%)。因此，鱈魚(yú)皮源明膠復(fù)合止血敷料可作為一種新型可吸收醫(yī)用敷料應(yīng)用于組織工程之中。