沈惠琳 李為民# 胡成琛 錢(qián) 瑾 吳建良 李國(guó)棟

1 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院 浙江 杭州 310015

2 杭州市丁橋醫(yī)院 浙江 杭州 310016

丹皮酚是一種從牡丹皮中分離出來(lái)的天然酚類(lèi)化合物，具有多種臨床藥理功效，包括抗炎、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤等作用[1，2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可在乳腺癌、胃癌和大腸癌中發(fā)揮抗癌作用[1,3，4]。丹皮酚還可加強(qiáng)表阿霉素的化療療效，減輕心臟毒性[5]。但罕有丹皮酚作用胰腺癌及其分子機(jī)制的研究。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）作為機(jī)體應(yīng)對(duì)外界刺激的應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)參與腫瘤發(fā)生發(fā)展，其中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）起到調(diào)控細(xì)胞增殖及代謝能力的作用[6]。GRP78可通過(guò)肌醇酶-1（IRE1）/腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TRAF2)信號(hào)通路促使凋亡蛋白Caspase-12表達(dá)增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[7]。本研究旨在探討丹皮酚對(duì)胰腺癌細(xì)胞的抗癌作用，觀察丹皮酚對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78/TRAF2信號(hào)通路影響，研究其抗癌作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞株與主要試劑：人胰腺癌細(xì)胞PANC-1細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；丹皮酚(批號(hào)19051503，純度＞98%)，購(gòu)自上海普銳生物科技有限公司；二甲亞砜（DMSO，批號(hào)MFCD00002089）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑四苯基乙酸（4-PBA，批號(hào)MFCD00800247）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清（批號(hào)SA311.02）購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)11995065）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青霉素-鏈霉素溶液（批號(hào)C0222）、BCA試劑盒（批號(hào)P0010）和增強(qiáng)型CCK-8試劑盒（批號(hào)C0042）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒(批號(hào)70-APCC101-100)購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；GRP78抗體（批號(hào)ER40402）、TRAF2抗體（批號(hào)ET1612-5）、Bax抗體（批號(hào)EM1203）、內(nèi)參 GAPDH（批號(hào)EM1101）和HRP 標(biāo)記的IgG抗體（批號(hào)HA1001）均購(gòu)自浙江杭州華安生物有限公司；Cleaved Caspase-12抗體（批號(hào) 35965）和Cleaved Caspase-3抗體（批號(hào)9664）均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 主要儀器：ACB-4A1超凈工作臺(tái)(新加坡ESCO公司)；3111恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；X-30R低溫高速離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)；TS100倒置顯微鏡和光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)；80i熒光顯微鏡系統(tǒng)(日本Nikon公司)；1575全自動(dòng)酶標(biāo)儀洗板機(jī)（美國(guó)BIO-RAD公司）；PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2～3天更換一次新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按1∶3比例進(jìn)行傳代，部分細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將丹皮酚溶于DMSO中，配制成終濃度為12、25、50、100、200μg/ml的溶液，不同濃度丹皮酚處理PANC-1細(xì)胞，培養(yǎng)0～72h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 丹皮酚對(duì)細(xì)胞增殖的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞，用0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞，按4×104個(gè)/ml接種于96孔培養(yǎng)板中(每孔100μl)，培養(yǎng)過(guò)夜后予不同濃度丹皮酚(12.5～200μg/ml)干預(yù)24h、48h、72h，應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。每孔加入含有10μl CCK-8的培養(yǎng)基100μl，繼續(xù)孵育2h，經(jīng)振蕩混勻后采用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)450nm)檢測(cè)細(xì)胞存活率情況。

2.3 丹皮酚對(duì)細(xì)胞集落形成的影響：PANC-1細(xì)胞株分為3組，即空白對(duì)照組、100μg/ml丹皮酚組和200μg/ml丹皮酚組。通過(guò)不同濃度丹皮酚干預(yù)PANC-1細(xì)胞后，恒溫培養(yǎng)箱培育8～10天（每2～3天更換新鮮培養(yǎng)液）。采用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，PBS沖洗殘余染液、晾干，相機(jī)拍攝記錄各組細(xì)胞形成集落數(shù)量。

2.4 丹皮酚對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的PANC-1細(xì)胞株，經(jīng)消化、離心、重懸后，調(diào)整細(xì)胞濃度(l×l06個(gè)/ml，2ml/孔)接種至6孔板中，培養(yǎng)24h，用高壓滅菌后200μl黃槍頭均勻地從一端到另一端進(jìn)行劃痕并通過(guò)倒置顯微鏡(100×)拍照記錄劃痕的寬度，隨后給予不同濃度（100、200μg/ml）的丹皮酚干預(yù)24、48、72h后觀察劃痕愈合情況，以評(píng)估細(xì)胞遷移能力。

2.5 丹皮酚對(duì)細(xì)胞凋亡的影響：取PANC-1細(xì)胞株分別經(jīng)不同濃度丹皮酚（100、200μg/ml）干預(yù)48h后，收集細(xì)胞，分別（0.5～1.0）×105個(gè)細(xì)胞用70%乙醇在4℃中固定過(guò)夜，后加入10μl Annexin V-FITC和5μl PI,混勻，使用流式細(xì)胞儀上機(jī)測(cè)定，F(xiàn)lowJo軟件分析凋亡情況。結(jié)果將根據(jù)Annexin V-FITC和PI劃分為4個(gè)象限，其中早期凋亡細(xì)胞(Annexin V-FITC陽(yáng)性/PI陰性)和晚期凋亡/部分壞死細(xì)胞(Annexin V-FITC陽(yáng)性/PI陽(yáng)性)，計(jì)算（早期凋亡細(xì)胞+晚期凋亡）/部分壞死細(xì)胞百分比為總細(xì)胞凋亡率。

2.6 丹皮酚對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白影響：丹皮酚作用PANC-1細(xì)胞株對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（Bax和Cleaved Caspase-3）的影響，通過(guò)Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)量變化情況：①總蛋白提?。喝?00、200μg/ml丹皮酚干預(yù)PANC-1細(xì)胞48h，PBS清洗2遍，加入100μl RIPA裂解液，冰上裂解，低溫高速離心，取上清待用；②蛋白濃度測(cè)定：采用BCA法測(cè)定蛋白的總濃度；③SDS-PAGE電泳：蛋白樣本按每孔35μg變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至NC膜上，封閉lh，加入一抗4℃震蕩過(guò)夜，TBS-T洗膜，加入二抗室溫孵育lh，TBS-T清洗后加入ECL發(fā)光液，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.7 抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)丹皮酚促細(xì)胞凋亡的影響：實(shí)驗(yàn)組加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA預(yù)處理細(xì)胞來(lái)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)分為4組：空白對(duì)照組、單用丹皮酚（200μg/ml）組、單用4-PBA(300μmol/L)組和4-PBA聯(lián)合丹皮酚組。各組藥物作用48h后利用Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(GRP78、TRAF2)和凋亡相關(guān)蛋白（Cleaved Caspase-12）表達(dá)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用Prism5.0軟件和SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料兩組間以t檢驗(yàn)評(píng)價(jià)，多組間應(yīng)用單因素方差分析(ANOVA)評(píng)價(jià)。數(shù)據(jù)圖采用GraphPad Prism 7繪制。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 丹皮酚對(duì)細(xì)胞增殖和克隆能力的影響：為了研究丹皮酚對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1的影響，進(jìn)行了CCK-8測(cè)定(圖1B)。丹皮酚以劑量和時(shí)間依賴的方式抑制PANC-1細(xì)胞的增殖能力，分別在干預(yù)48h和72h時(shí)細(xì)胞存活率為 73.3%（100μg/ml）、68.5%（200μg/ml）和72.9%（100μg/ml）、60.3%（200μg/ml）(P＜0.05)。通過(guò)SPSS數(shù)據(jù)計(jì)算48h時(shí)間段200μg/ml丹皮酚的細(xì)胞抑制濃度(IC50)值為278μg/ml?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)中可知，100μg/ml和200μg/ml丹皮酚干預(yù)PANC-1細(xì)胞可明顯抑制細(xì)胞克隆形成（見(jiàn)圖1C）。因此，丹皮酚可抑制PANC-1細(xì)胞增殖及克隆能力。

圖1 丹皮酚化學(xué)結(jié)構(gòu)式（A）及其對(duì)PANC-1細(xì)胞存活率（B）和克隆形成能力（C）的影響(±s,n=3)

3.2 丹皮酚對(duì)細(xì)胞遷移作用的影響：劃痕實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，100μg/ml和200μg/ml丹皮酚均可抑制PANC-1遷移，其中丹皮酚作用72h后細(xì)胞劃痕愈合能力明顯下降(圖2)。

圖2 丹皮酚對(duì)PANC-1細(xì)胞的遷移能力的影響(±s,n=3)

3.3 丹皮酚對(duì)細(xì)胞凋亡的影響：用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度丹皮酚作用細(xì)胞48h后細(xì)胞凋亡水平。由圖3可知，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率（早期凋亡+晚期凋亡）為3.37%，100μg/ml丹皮酚組凋亡率為7.50%，200μg/ml丹皮酚組凋亡率為20.27%(圖3A-B)。

圖3 丹皮酚對(duì)PANC-1細(xì)胞凋亡能力的影響(±s,n=3)

3.4 丹皮酚對(duì)細(xì)胞凋亡和GRP78/TRAF2蛋白的影響：為了闡明丹皮酚對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響，我們采用Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白（Bax和Cleaved Caspase-3）。從圖4可知，100μg/ml和200μg/ml丹皮酚促使Bax和Cleaved Caspase-3的表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在丹皮酚促細(xì)胞凋亡中作用，與空白對(duì)照組比較，單用丹皮酚組可顯著上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、TRAF2和凋亡蛋白Cleaved Caspase-12的表達(dá)(圖5)。與單用丹皮酚組比較，4-PBA聯(lián)合丹皮酚組可抑制單用丹皮酚上調(diào)GRP78、TRAF2和Cleaved Caspase-12作用。

圖4 丹皮酚對(duì)PANC-1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響(±s,n=3)

4 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丹皮酚作用于胰腺癌細(xì)胞PANC-1可促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。死亡受體信號(hào)通路、線粒體通路和ERS信號(hào)通路是細(xì)胞凋亡的三大重要途徑。越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)ERS與癌細(xì)胞的凋亡和自噬密切相關(guān)[8]。中藥治療胰腺癌，早期以清熱解毒、疏肝利膽為主，晚期以扶正固本為主[9]。許多中草藥如姜黃素、溫郁金和艾葉均可誘導(dǎo)ERS[10-12]。利用中草藥誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生ERS，通過(guò)上調(diào)IRE1、TRAF2和Caspase-12蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。因此，我們通過(guò)本實(shí)驗(yàn)從ERS的角度進(jìn)一步研究丹皮酚調(diào)控胰腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

ERS可通過(guò)多種方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中包括激活ERS相關(guān)的促凋亡分子，如Caspase-12和GADD34[14]。在正常的生理狀態(tài)下，GRP78通常與IRE1緊密結(jié)合。IRE1通過(guò)招募TRAF2激活凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)。ASK1細(xì)胞因子作為各種細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵作用因素，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，可促進(jìn)c-Jun氨基末端激酶(JNK)磷酸化，進(jìn)而激活JNK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。TRAF2是凋亡信號(hào)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)傳遞到細(xì)胞質(zhì)的重要蛋白。敲除TRAF2的上游蛋白E3泛素連接酶（CHIP）后，IRE1不能作為復(fù)合物與TRAF2結(jié)合，無(wú)法激活A(yù)SK1-JNK信號(hào)通路和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在多種細(xì)胞凋亡因子，其中Caspase-12是ERS過(guò)程誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所必需蛋白。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中外界因素干擾下出現(xiàn)鈣離子的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，Caspase-12可被直接激活，激活狀態(tài)Caspase-12（即Cleaved Caspase-12）可裂解Caspase-3并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，GRP78/TRAF2/Caspase-12信號(hào)通路是ERS致細(xì)胞凋亡的重要分子機(jī)制之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚處理人胰腺癌細(xì)胞PANC-1后，ERS相關(guān)蛋白GRP78、TRAF2和凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-12、Cleaved Caspase-3、Bax表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)丹皮酚可誘導(dǎo)ERS和細(xì)胞凋亡。通過(guò)4-PBA抑制ERS，丹皮酚上調(diào)GRP78、TRAF2作用減弱，且促凋亡蛋白Cleaved Caspase-12作用也受抑制。因此，我們認(rèn)為丹皮酚誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能與其上游的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78/TRAF2信號(hào)通路變化有關(guān)。