陳旭，施凱佳，王姣，姚姍，周田，姜成龍，陳小盼

2型糖尿病為全球高發(fā)性疾病，各種急、慢性并發(fā)癥涉及全身多個器官和組織，其中糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathies ，DCM）是一種獨立于冠心病、高血壓和心臟瓣膜病的心臟疾病，治療困難且病死率較高［1-2］。2型糖尿病患者因胰島素抵抗可致能量利用與消耗的失衡，造成糖脂代謝紊亂，使得心肌細胞逐漸出現氧化應激、凋亡以及炎癥反應等變化，心功能逐漸失代償，最終導致心力衰竭甚至猝死［3-4］。目前，臨床上缺乏有效根治DCM 的方法，強化血糖和血脂的控制只能減緩而不能逆轉心力衰竭的進展。吡格列酮（PGZ）是一種有效的胰島素增敏劑，能夠保護胰島β細胞功能，改善胰島素抵抗相關的糖脂代謝紊亂、全身性炎癥反應及動脈粥樣硬化等，具有抗氧化應激、抗凋亡的作用［5-6］。研究表明，PGZ 在體外可以改善H2O2、缺氧復氧等有害刺激誘導的線粒體氧化應激，減少活性氧簇（ROS）的產生，進而影響到蛋白激酶B（AKT）等信號通路的傳導［7-8］。因此，PGZ 有可能通過抑制 ROS，促進 AKT通路活化，從而對心肌細胞的凋亡產生影響。目前，有關在高糖（HG）高脂環(huán)境下PGZ 對心肌細胞的作用及其機制的研究鮮見。本研究構建了高糖棕櫚酸誘導的H9C2心肌細胞高糖高脂損傷模型，探討PGZ對其影響及可能機制，為揭示PGZ 在糖尿病源性心臟疾病中的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 H9C2大鼠心肌細胞購自武漢Procell公司；PGZ購自上海MCE公司；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco 公司；胎牛血清（FBS）、青/鏈霉素、二甲基亞砜（DMSO）、10～180 ku 彩色預染蛋白分子Marker、BCA 蛋白測定試劑盒、SDS-PAGE制膠試劑盒、ECL顯色試劑盒購自上海YEASEN 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國HYclone 公司；棕櫚酸（PA）和高脂溶劑購自西安鯤創(chuàng)科技發(fā)展有限公司；CCK-8 試劑購自日本同仁公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒、活性氧檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；兔抗蛋白激酶B（T-AKT）、磷酸化蛋白激酶B（PAKT）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白激酶3（Caspase3）、剪切半胱氨酸天冬氨酸蛋白激酶3（C-Caspase3）抗體購自美國CST生物公司；兔抗B-淋巴細胞瘤基因-2（BCL-2）、BCL-2 相關X 蛋白（BAX）、肌纖蛋白（ACTIN）抗體購自北京BIOSS 公司；N-乙酰半胱氨酸（N-acteyl-L-cysteine，NAC）購自美國GLPBIO公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗購自武漢三鷹公司；RIPA裂解液、PMSF、上樣緩沖液、電泳緩沖液、轉膜液、TBST緩沖液、0.22μm PVDF膜、牛血清白蛋白（BSA）、磷酸酶抑制劑、一抗稀釋液、二抗稀釋液及脫脂奶粉購自北京biosharp公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 H9C2 心肌細胞采用含1%雙抗和10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，1～2 d 換液，2～3 d 傳代。細胞融合率達80%～90%后進行后續(xù)試驗。

1.2.1 不同濃度PA 作用不同時間后對H9C2 細胞活力的影響 采用 0、0.05、0.1、0.2 和 0.4 mmol/L 的 PA 分別干預細胞12、24、48 h后用CCK-8法進行細胞毒性試驗，選定0.1 mmol/L濃度作為后續(xù)實驗濃度。

1.2.2 實驗2 觀察不同濃度葡萄糖作用不同時間后對細胞活力的影響，采用25、35、50、75 和100 mmol/L 的葡萄糖分別干預細胞 12、24、48 h 后進行CCK-8 試驗，選定 50 mmol/L 濃度作為后續(xù)實驗濃度。

1.2.3 實驗3 觀察在高糖棕櫚酸環(huán)境下不同濃度PGZ作用不同時間對H9C2細胞活力影響，將細胞隨機分為9組：對照組（25 mmol/L 葡萄糖）、溶劑組（棕櫚酸溶劑+0.1%二甲基亞砜）、HGPA 組（50 mmol/L 葡萄糖+0.1 mmol/L 棕櫚酸）、（2.5、5、10、20、40、80 μmol/L PGZ+HGPA）PGZ 組，分別干預細胞12、24、48 h 后進行CCK-8 試驗，選定5、10 μmol/L 濃度作為后續(xù)實驗濃度。

1.2.4 實驗4 研究PGZ 在高糖棕櫚酸環(huán)境下對H9C2 細胞凋亡的影響及其機制，將細胞分為5組：對照組（25 mmol/L葡萄糖）、溶劑組（棕櫚酸溶劑+0.1%二甲基亞砜）、HGPA 組（50 mmol/L葡萄糖+0.1 mmol/L棕櫚酸）、H-PGZ組（10μmol/L PGZ+HGPA）和L-PGZ 組（5 μmol/L PGZ+HGPA），干預48 h進行后續(xù)實驗。

1.2.5 實驗5 驗證ROS對于AKT通路和H9C2細胞凋亡的影響，將細胞分為HGPA 組和NAC+HGPA 組（1 mmol/L NAC預處理 2 h+HGPA）干預 24 h，Western blot 法檢測AKT 通路及凋亡相關蛋白表達。

1.3 CCK-8 法檢測細胞活力 將細胞懸液以每孔1×104個細胞密度接種于96孔板內，每孔100μL，每組5個復孔，置于常規(guī)培養(yǎng)箱孵育，細胞融合度達80%時，根據1.2.1、1.2.2、1.2.3 分組，每孔加入10 μL CCK-8 試劑后再繼續(xù)孵育細胞1.5 h，在450 nm 波段處測定其光密度（OD）值，重復3 次，取平均值。

1.4 AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率 H9C2以每孔1×105個心肌細胞接種于6孔板內，每孔加培養(yǎng)液1 mL，待細胞融合至約80%后按1.2.4 分組干預細胞48 h，用不含EDTA 的胰酶消化并收集細胞，PBS 重懸2 次后，加入Annexin V 結合緩沖液并在避光條件下用5 μmol/L Annexin V-FITC 孵育15 min，加入10 μmol/L 碘化丙啶（PI）避光孵育5 min 后通過流式細胞儀進行分析。細胞凋亡率=Q2細胞比率+Q3細胞比率。

1.5 DCFH-DA 法檢測ROS 水平 用無血清的DMEM 稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10μmol/L，按照1.2.4 分組干預細胞后分別加入1 mL稀釋好的DCFH-DA，置于37 ℃培養(yǎng)箱內孵育20 min后流式細胞儀檢測ROS水平。

1.6 微板法檢測各組SOD、MDA水平 將細胞培養(yǎng)在6孔板內，按照1.2.4分組干預細胞后收集細胞并超聲破碎，按照試劑說明書操作檢測各組MDA、SOD水平，重復3次。

1.7 Western blot 法測蛋白 根據1.2.4、1.2.5 分組干預后裂解并提取各組細胞總蛋白（冰上操作），BCA法蛋白定量。按需制取SDS-PAGE 膠并放入電泳槽后進行上樣。接著進行電泳，濃縮膠80 V 穩(wěn)壓至Marker 分離，改為分離膠120 V 穩(wěn)壓至溴酚藍指示液抵達凝膠底層，停止電泳。濕法轉膜2 h（冰水浴）。轉膜后用5%脫脂牛奶封閉液封閉2 h。T-AKT、P-AKT、BAX、BCL-2、Caspase3、C-Caspase3、ACTIN 一抗（均1∶1 000 稀釋）在4 ℃下孵育過夜。孵育后洗膜3 次。二抗（1∶10 000）搖床孵育2 h。洗膜后加ECL發(fā)光液，避光顯色數分鐘。Image J軟件解析各實驗組條帶灰度值，目標蛋白的相對表達量=（目標蛋白灰度值/內參蛋白灰度值）÷（對照組目的蛋白灰度值/對照組內參蛋白灰度值）。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行數據分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差（）表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同處理和不同干預時間對H9C2心肌細胞活力的影響

2.1.1 實驗1 12、24及48 h，H9C2心肌細胞活力隨PA濃度升高呈濃度依賴性下降（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Effects of different concentrations of PA on viability of H9C2 cells for different time points圖1 不同濃度PA作用不同時間后對H9C2心肌細胞活力的影響

2.1.2 實驗2 12 h時，與25 mmol/L葡萄糖組比較，35 mmol/L葡萄糖組H9C2細胞活力差異無統(tǒng)計學意義，50、75 及 100 mmol/L 葡萄糖組細胞活力增加（P＜0.05）；24、48 h時25、35、50、75以及100 mmol/L葡萄糖組細胞活力依次增加（P＜0.05），見圖2。

Fig.2 Effects of different concentrations of glucose on viability of H9C2 cells for different time points圖2 不同濃度葡萄糖作用不同時間后對H9C2心肌細胞活性的影響

2.1.3 實驗3 與對照組比較，48 h內溶劑組細胞活力差異無統(tǒng)計學意義，HGPA 組細胞活力降低（P＜0.05）。與HGPA組比較，12 h時80μmol/L PGZ組細胞活力降低（P＜0.05），其余各組差異無統(tǒng)計學意義，24 h 時 10 μmol/L PGZ 組細胞活力增加，40、80 μmol/L PGZ 組細胞活力下降（P＜0.05），其余各組差異無統(tǒng)計學意義，48 h時5、10和20μmol/L PGZ組細胞活力增加，40、80μmol/L PGZ 組細胞活力降低（P＜0.05），見圖3。

Fig.3 Effects of different concentrations of PGZ on viability of H9C2 cells for 12,24 and 48 h圖3 不同濃度PGZ干預12、24、48 h后對H9C2心肌細胞活力的影響

2.2 各組細胞凋亡率、ROS水平、SOD活性、MDA含量比較 與對照組比較，溶劑組各項指標差異均無統(tǒng)計學意義；與對照組和溶劑組比較，HGPA組凋亡率、ROS水平、MDA含量增加，而SOD活性降低（P＜0.05）；HGPA 組、L-PGZ 組、H-PGZ 組凋亡率、ROS水平、MDA 含量依次降低，而SOD 活性依次升高（P＜0.05），見表1、圖4。

Tab.1 Results of apoptosis rate,ROS,SOD and MDA of the different groups表1 各組凋亡率、ROS、SOD、MDA測定結果（n=3，）

Tab.1 Results of apoptosis rate,ROS,SOD and MDA of the different groups表1 各組凋亡率、ROS、SOD、MDA測定結果（n=3，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與溶劑組比較，c與HGPA組比較，d與L-PGZ組比較，P＜0.05。

組別對照組溶劑組HGPA組L-PGZ組H-PGZ組F凋亡率（%）12.97±0.39 13.00±0.47 42.23±3.52ab 31.24±2.49abc 22.65±1.03abcd 117.547＊＊ROS水平（%）11.11±0.77 11.72±1.50 80.58±2.27ab 65.24±1.51abc 50.16±4.45abcd 492.177＊＊SOD活性（U/mg prot）211.14±4.31 210.45±0.96 136.40±3.33ab 153.62±3.37abc 184.87±5.30abcd 241.659＊＊MDA含量（nmol/mg prot）25.35±0.92 25.46±0.60 61.31±1.53ab 54.34±3.03abc 43.15±1.68abcd 260.367＊＊

Fig.4 Apoptosis of different groups detected by flow cytometry圖4 流式細胞儀檢測各組凋亡情況

2.3 各組 T-AKT、P-AKT、Caspase3 等蛋白相對表達水平比較 與對照組比較，溶劑組各項指標差異無統(tǒng)計學意義；與對照組和溶劑組比較，HGPA組CCaspase3、BAX 表達水平升高，P-AKT、Caspase3、BCL-2 表達水平降低（P＜0.05）；HGPA 組、L-PGZ組、H-PGZ 組 C-Caspase3、BAX 依次下降，P-AKT、Caspase3、BCL-2 依次升高（P＜0.05），見圖5、表2。與 HGPA 組比較，NAC+HGPA 組 C-Caspase3 表達降低，P-AKT、Caspase3表達升高（P＜0.05），見圖6、表3。

Fig.5 Comparison of protein expression results between the five groups of cells圖5 各組蛋白表達結果比較

Tab.2 Comparison of protein expression results between the five groups of cells表2 各組蛋白相對表達水平比較

Fig.6 Comparison of protein expression results between the two groups of cells圖6 各組蛋白表達結果比較

Tab.3 Comparison of protein expression results between the two groups表3 HGPA組和NAC+HGPA組蛋白相對表達水平比較

3 討論

流行病學研究發(fā)現，2 型糖尿病的共病中高脂血癥的發(fā)生率達到了65.4%，僅次于高血壓，提示在2型糖尿病以及包括糖尿病心肌病在內的一系列并發(fā)癥的發(fā)展過程中高血糖和高血脂關系密切［9-10］。因此，本研究采用高糖和棕櫚酸共同作用建立高糖高脂損傷模型，并觀察PGZ 對高糖高脂損傷模型的影響。本研究結果顯示，與25 mmol/L 組比較，12 h時50、75 以及100 mmol/L 葡萄糖組細胞活力增加，24 h、48 h時25、35、50、75以及100 mmol/L葡萄糖組細胞活力依次增加，表明高糖對于細胞增殖具有促進作用。然而，有研究顯示，HG 會抑制H9C2 細胞增殖［11］，與本研究結果相反，原因可能為不同的培養(yǎng)條件和處理方法引起的通路差異所致，具體原因有待驗證。另有研究顯示，HG 通過下調GRIM-19 表達而促進H9C2細胞增殖［12］，與本研究HG促進細胞增殖結果相似，而GRIM-19是線粒體脫氫酶Ⅰ復合物的必需成分，其下調會引起線粒體損傷［13］。既往研究顯示，PA 可通過抑制AKT 磷酸化促進H9C2 細胞凋亡［8］。本研究結果亦顯示，48 h 內0、0.05、0.1、0.2、0.4 mmol/L 的PA 組心肌細胞活力依次降低，表明48 h 內PA 可抑制H9C2 心肌細胞增殖，且在0～0.4 mmol/L 濃度范圍內具有濃度依賴性。本研究用HG 和PA 共同作用建立高糖高脂損傷模型，由于藥物作用時間的不確定性，既要保證高糖和棕櫚酸能在短時間內對細胞活力有影響，又要保證較長時間后對細胞活力的影響不至于過大，綜合研究結果選擇 50 mmol/L 葡萄糖與0.1 mmol/L 的 PA 共同干預心肌細胞建立高糖高脂模型。

AKT 通路是心肌細胞內重要的凋亡調控通路［8］。既往研究表明，在H9C2心肌細胞內AKT磷酸化受到抑制，進而可減少抗凋亡蛋白BCL-2表達，增加促凋亡蛋白BAX表達，BCL-2/BAX失衡啟動了線粒體凋亡途徑，從而誘導Caspase 的級聯反應，最終引起Caspase3 剪切化，而剪切化的Caspase3 是細胞凋亡的最終執(zhí)行蛋白［14］。有研究顯示，PGZ 可通過促進PI3K/AKT通路的活化，從而減輕糖氧剝奪損傷中H9C2細胞凋亡［15］。本研究結果顯示，48 h時與對照組比較，HGPA組細胞凋亡率升高，P-AKT、BCL-2表達降低，BAX、C-Caspase3 表達升高，表明HGPA可以通過抑制AKT 磷酸化，促進抗凋亡蛋白BCL-2與凋亡蛋白BAX 表達失衡，誘導Caspase3 剪切化并促進細胞凋亡；與 HGPA 組比較，10 μmol/L 和5 μmol/L PGZ組細胞凋亡率降低，P-AKT、BCL-2表達升高，BAX、C-Caspase3 表達降低，證實了PGZ 可能通過增加AKT 的磷酸化，抑制HGPA 誘導的抗凋亡蛋白BCL-2與凋亡蛋白BAX的表達失衡，進而減輕Caspase3活化所引起的心肌細胞凋亡。

氧化應激反應是DCM 發(fā)生發(fā)展的重要分子機制，也被認為是DCM發(fā)展的“導火線”［16］。SOD是體內重要的抗氧化酶，MDA 則是體內重要的過氧化物，SOD和MDA的變化反映了體內氧化和抗氧化的失衡狀態(tài)［17］。本研究發(fā)現，48 h 時與對照組比較，HGPA組ROS和MDA增加，SOD減少，與HGPA組比較，10 μmol/L 和5 μmol/L PGZ 組ROS 和MDA 減少，SOD 增加，且 10 μmol/L 組比 5 μmol/L 組變化更明顯，證實PGZ可通過增加抗氧化酶SOD，減少HGPA所誘導的ROS 及其氧化產物MDA 的產生，抑制HGPA 所致的細胞內氧化應激狀態(tài)，且10μmol/L 比5μmol/L 效果更明顯。研究顯示，AKT 通路為心肌細胞內影響凋亡的重要通路，受到ROS的調節(jié)，ROS可以抑制AKT 磷酸化，從而促進細胞凋亡［8］。NAC是目前公認的有效的ROS 抑制劑。為了證實ROS對AKT 通路和凋亡的影響，本研究中采用抗氧化劑NAC與HGPA共同干預心肌細胞24 h，與單純HGPA組比較，NAC+HGPA 組 P-AKT 升高，C-Caspase3 表達降低，進一步表明抑制ROS可以促進AKT通路的活化，減少心肌細胞凋亡。

綜上所述，PGZ 對ROS 有抑制作用，可以促進AKT通路的活化，減少心肌細胞凋亡，其機制可能是通過抑制ROS并進一步促進AKT通路活化，從而減輕高糖棕櫚酸誘導的H9C2心肌細胞凋亡。