門凱凱， 劉佳隆， 郭亞格， 張 瑾， 余祖華

(河南科技大學 動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，河南 洛陽 471023)

0 引言

近年來，雞腫瘤性疾病的發(fā)病率越來越高，雞腫瘤性疾病的多變性、高發(fā)性已經(jīng)給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的威脅[1-2]。雞馬立克病(Marek’s disease, MD)是由隸屬于強致病性α皰疹病毒的馬立克病毒(Marek’s disease virus, MDV)感染雞后引起的，可在雞體內迅速誘發(fā)惡性T細胞淋巴瘤，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大損失，因此，研究其發(fā)病機制是必要的。轉化生長因子β(transforming growth factor-β,Tgfβ)是一種多功能細胞因子，通過細胞表面受體信號轉導參與許多疾病的病理生理過程，其表達量變化與腫瘤疾病有著密切聯(lián)系[3-5]。Tgfβ1作為Tgfβ的一個亞型，在調節(jié)免疫細胞分化、維持免疫細胞功能和免疫穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，是腫瘤細胞中最常見的上調因子[6-9]，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的致癌或抑癌功能[10]，且Tgfβ1信號通路分子對腫瘤的調控作用是目前學術界研究熱點之一，但關于雞Tgfβ1在雞MD腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制有待深入研究。據(jù)此，本研究構建了雞Tgfβ1的干擾表達載體，將其轉染MDV轉化的腫瘤細胞系MDCC-MSB1并鑒定抑制表達效果，為后續(xù)研究雞Tgfβ1在MD腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及調控機制提供基礎材料。

1 材料與方法

1.1 材料

MDV轉化的腫瘤細胞系MDCC-MSB1、pG1.2載體、DH5α感受態(tài)均由河南科技大學動物疫病與公共衛(wèi)生實驗室保存；質粒提取試劑盒購于北京天根生化有限公司；限制性內切酶BsaI(RO535V)、SacI(ER1135)分別購于NEB和Thermo Scientific公司；反轉錄試劑盒(RR047A)、SYBR Green Master Mix(RR420)購于Taraka公司；Lipofectamine2000試劑、Opti-MEM培養(yǎng)基購于美國Invitrogen公司；Trizol試劑購于GenStar公司；RIPI裂解液、Bradford蛋白濃度測定試劑盒購于Servicebio公司；兔抗雞TGFβ1抗體(aa260-373)購自美國LifeSpan公司，HRP-羊抗兔二抗(ab6721)、小鼠抗β-actin(ab8226)購自美國Abcam公司；HRP-羊抗鼠二抗(SA00001-1)購自Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 雞Tgfβ1基因靶向短發(fā)夾核糖核酸序列的設計與合成

根據(jù)GenBank檢索的雞Tgfβ1基因全序列(NM-001318456.1)以及短發(fā)夾核糖核酸(short hairpin ribonucleic acid, shRNA)的設計原則，確定目標基因，設計出3條shRNA寡核苷酸序列。確定目標基因序列分別為Gallus-Tgfβ1-1：GCATCTTCTTCGTGTTCAA(位于Tgfβ1mRNA 110～168)；Gallus-Tgfβ1-2：GCATCTCCATCGAAGGCTT(位于Tgfβ1mRNA 109～167)；Gallus-Tgfβ1-3：CCACGAACCCAAAGGTTAT(位于Tgfβ1mRNA 106～163)。再按序列結構:BsaI+Sense+Loop+Antisense+終止信號+SacI+BsaI設計雞Tgfβ1的shRNA鏈(見表1)，送往生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 Tgfβ1 shRNA基因片段序列及靶點

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應引物的設計與合成

根據(jù)GenBank檢索的Tgfβ1mRNA基因全序列(NM-001318456.1)和雞GAPDH全序列(NC-052532.1),分別設計雞Tgfβ1和雞GAPDH熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)引物序列(見表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 熒光定量PCR引物

1.2.3Tgfβ1干擾表達載體的構建與鑒定

每個單鏈基因片段用30 μL annealing buffer溶解，得到上游2 μL +下游2 μL + 16 μL annealing buffer，94 ℃退火，室溫冷卻，100倍稀釋退火產(chǎn)物。BsaI酶切pG-1.2質粒，酶切體系：pG1.2質粒2 μg，BsaI 2 μL，CutSmart 4 μL，補ddH2O至40 μL，37 ℃酶切過夜。回收1%(質量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳大片段與退火片段連接。稀釋的退火片段1 μL，質粒載體線性化大片段1 μL，5×Ligase Buffer 2 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，ddH2O補至10 μL，22 ℃反應過夜。各取10 μL連接產(chǎn)物轉化至感受態(tài)細胞DH5α，分別涂布于含卡那霉素抗性(50 μg/mL) LB平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜。從耐卡那霉素(50 μg/mL) LB平板中挑選單克隆菌落，接種于5 mL耐卡那霉素LB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫(180 r/min)過夜。試劑盒提取質粒，經(jīng)SacI酶切鑒定正確的質粒送測序。

1.2.4 MDCC-MSB1培養(yǎng)與Tgfβ1干擾表達載體的轉染

MDCC-MSB1細胞在10%(體積分數(shù))胎牛血清RIPM1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以每孔1×106個在對數(shù)生長期狀態(tài)好的MDCC-MSB1細胞接種于6孔板。轉染共分成3組，每組分別為重組質粒及相應的pG1.2空載，即pG1.2-Tgfβ1shRNA-1和干擾NC-1組、pG1.2-Tgfβ1shRNA-2和干擾NC-2組、pG1.2-Tgfβ1shRNA-3和干擾NC-3組，每組3個復孔。轉染前2 h，細胞培養(yǎng)液換成無血清1640培養(yǎng)基。質粒在100 μL opti-MEM培養(yǎng)基稀釋；以質?！肔ipofectamine2 000轉染試劑=1 μg∶2 μL比例配制opti-MEM培養(yǎng)基-脂質體復合物100 μL，室溫靜置5 min。將兩液混合均勻靜置20 min后加入6孔板MDCC-MSB1細胞內輕輕混勻。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測Tgfβ1mRNA表達

Trizol法提取轉染48 h各組細胞總RNA，逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄成互補脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid, cDNA)，用cDNA做SYBR Green Master Mix qRT-PCR的體系：TB GreenPremix DimerEraser 10 μL、PCR Forward Primer 0.4 μL、PCR Reverse Primer 0.4 μL、Template 2 μL、ddH2O補至20 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40循環(huán)。GAPDH為內參，2-ΔΔCt法計算各組Tgfβ1mRNA相對表達量，根據(jù)相對表達量篩選出抑制率最高的干擾表達載體。

1.2.6 Western blot法檢測TGFβ1蛋白表達

用抑制率最高的干擾表達載體pG1.2-Tgfβ1shRNA-1轉染MDCC-MSB1細胞，Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定提取的48 h各組細胞蛋白濃度，加樣量為每樣50 μg，加5×SDS上樣緩沖液，沸水煮10 min。經(jīng)5%(質量分數(shù))濃縮膠和10%(質量分數(shù))分離膠SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移至0.22 μm 聚偏氟乙烯膜，用含4%(質量分數(shù))牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的TBST液4 ℃封閉2 h，用4% BSA的TBST液稀釋兔抗雞TGFβ1(1∶500)或小鼠單抗β-actin(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，第2天加入相應的HRP標記二抗4 ℃孵育3 h，超敏增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence, ECL)法顯色。

1.2.7 統(tǒng)計學方法

SPSS20.0統(tǒng)計學軟件單因素方差分析或t-test分析數(shù)據(jù)，P<0.05為差異顯著，用*表示；P<0.01為差異極顯著，用**表示。

2 結果

2.1 雞Tgfβ1 干擾表達載體的酶切和測序鑒定

M.marker；1，2.PG1.2-Tgfβ1 shRNA-1；3，4.PG1.2-Tgfβ1 shRNA-2；5，6.PG1.2-Tgfβ1 shRNA-3。 圖1 PG1.2-Tgfβ1 shRNA酶切鑒定

pG1.2載體帶有一個SacⅠ酶切位點，再根據(jù)pG1.2載體序列，引入SacⅠ位點設計雞Tgfβ1的干擾表達片段。提取陽性質粒被SacⅠ酶切出一條約600 bp條帶，即表明退火片段連接到pG1.2載體。PG1.2-Tgfβ1shRNA酶切鑒定見圖1。由圖1可知：SacⅠ酶切陽性重組質粒后，電泳結果顯示各質粒均有一條大小約600 bp的條帶。測序結果比對顯示，測序結果與原設定序列完全一致，結果表明設計合成的各shRNA片段均成功插入pG1.2載體，成功構建了雞Tgfβ1的干擾表達質粒，分別為PG1.2-Tgfβ1shRNA-1、PG1.2-Tgfβ1shRNA-2和PG1.2-Tgfβ1shRNA-3。

2.2 靶向雞Tgfβ1的干擾片段篩選

按照轉染試劑Lipofectamine2000和Tgfβ1干擾載體2 μL∶1 μg的比例,將構建的PG1.2-Tgfβ1shRNA-1、PG1.2-Tgfβ1shRNA-2、PG1.2-Tgfβ1shRNA-3質粒和各自空載PG1.2載體分別轉染MDCC-MSB1細胞，48 h后提取各組細胞總RNA，qRT-PCR檢測Tgfβ1相對表達量，分析比較其抑制效果。Tgfβ1干擾載體mRNA水平抑制效果見圖2。由圖2可知：構建的針對雞Tgfβ1mRNA不同靶位點的3個干擾載體均有顯著的抑制效果，其抑制率分別為74.43%、66.97%和73.44%。

圖2 Tgfβ1 干擾載體mRNA水平抑制效果

2.3 干擾表達載體對MDCC-MSB1細胞內雞TGFβ1蛋白表達的干擾效果

用抑制率最高的干擾載體PG1.2-Tgfβ1shRNA-1轉染MDCC-MSB1細胞，轉染48 h后熒光顯微鏡下觀察PG1.2-Tgfβ1shRNA-1組和PG1.2干擾NC組MDCC-MSB1均有熒光(見圖3a和圖3b)，空白對照組無熒光(見圖3c)。48 h提取細胞總蛋白，Western blot檢測TGFβ1蛋白表達量(見圖4a)并進行蛋白條帶的灰度值分析(見圖4b)。圖4b中，縱坐標為目的蛋白TGFβ1灰度值與內參β-actin灰度值的比值。與空白組相比，PG1.2-Tgfβ1shRNA-1組細胞內TGFβ1蛋白表達量顯著下降(P<0.05)，PG1.2干擾NC組細胞內TGFβ1蛋白表達量無顯著差異(P>0.05)。

(a) PG1.2-Tgfβ1 shRNA轉染的MSB1細胞 (b) PG1.2干擾NC轉染的MSB1細胞 (c) 陰性對照(無轉染的MSB1細胞)

(a) TGFβ1蛋白、β-actin內參蛋白Western blot

3 討論

近年來,隨著對腫瘤發(fā)病機制的不斷深入了解和研究，人們越來越清楚地認識到腫瘤疾病的發(fā)生涉及各方面的因素，并且在發(fā)展中牽涉更多步驟的病理過程[11-12]。腫瘤疾病的發(fā)病機制之所以是復雜的，是因為其在發(fā)生發(fā)展過程中涉及Tgfβ1/Smad等多條信號傳導通路及多種細胞因子，這些信號通路和細胞因子共同構成復雜的調控網(wǎng)絡[13-14]。Tgfβ1作為眾多信號分子中的一員，調節(jié)著多細胞生物生理發(fā)育的各個方面，由于其在動物界的高度保守性，使其在眾多信號分子中脫穎而出，與其相關的信號通路被深入研究。Tgfβ1信號通路在許多類型的腫瘤中發(fā)揮作用，其通路發(fā)揮作用的機制被越來越多的學者研究，并取得了一定的研究成果，文獻[15]提出miR-130a-3p靶向GCNT4并激活Tgfβ1/Smad3信號通路，可促進胃癌細胞生長。文獻[16]證明參皂苷Rg2通過調節(jié)Tgfβ1/Smad信號通路減輕心肌纖維化，從而改善心功能損害。Tgfβ1信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，Tgfβ1主要是通過跨膜絲氨酸-蘇氨酸激酶受體TgfβR1參與腫瘤調控，在腫瘤的發(fā)生過程中Tgfβ1主要通過組織微環(huán)境Smad和非Smad通路促進或抑制腫瘤發(fā)生[17]。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，Tgfβ1表現(xiàn)出不同的作用，Tgfβ1信號通路在腫瘤早期抑制腫瘤細胞的增殖，并將細胞阻止于G1期[18-19]。隨著腫瘤的發(fā)展，腫瘤細胞逃避發(fā)生突變的Tgfβ1信號通路介導的生長抑制效應，腫瘤細胞大量增殖[20]。Tgfβ1既是一種抑制因子又是一種啟動子，這種雙重作用的機制尚不清楚，但在Tgfβ1/Smad信號通路中任何一部分的中斷或缺失，都會導致該通路的抑瘤作用減弱，進而促進了腫瘤的發(fā)展。文獻[21]闡明調控Tgfβ1/Smad4通路可對宮頸癌SiHa細胞自噬關鍵基因Lc3產(chǎn)生影響，從而調控宮頸癌SiHa細胞的生物學特性。Tgfβ1/Smad信號通路的改變對其下游基因表達的影響，是其調控各種疾病更為關鍵的步驟，這種通路機制成為學術界研究的熱點，研究Tgfβ1及其信號通路在腫瘤發(fā)生中的作用及機制對腫瘤的有效防控具有十分重要的意義[22]。Tgfβ1信號通路在其他腫瘤疾病被深入研究，但在雞腫瘤疾病的作用及機制還有待深入研究，本研究基于Tgfβ1在腫瘤細胞的這種重要作用，通過構建雞Tgfβ1干擾表達載體，初步探索構建的干擾表達重組質粒對MDCC-MSB1細胞中Tgfβ1表達量的影響，為進一步研究Tgfβ1在MD腫瘤發(fā)生中的作用及機制奠定基礎。

RNA干擾技術介導細胞內特異靶基因表達沉默，使相應的功能表型出現(xiàn)缺失現(xiàn)象[23]，文獻[24]在胰腺癌中觀察到通過微小核糖核酸對ANLN基因的下調，抑制了細胞的侵襲性。以Tgfβ1為靶目標，RNA干擾技術為研究Tgfβ1功能及其在腫瘤性疾病中的調控機制提供了新維度。本研究根據(jù)雞Tgfβ1基因序列和shRNA設計原則設計了3個shRNA序列，通過基因重組技術將shRNA克隆入載體，構建pG1.2-Tgfβ1shRNA重組表達質粒。酶切和測序證實3種重組質粒插入序列與設計靶基因片段一致。用構建成功的3種重組質粒轉染MDCC-MSB1細胞，48 h后提取各組細胞總RNA，進行qRT-qPCR檢測Tgfβ1的表達量變化，結果顯示構建的3種干擾表達質粒轉染細胞后，對細胞內Tgfβ1 mRNA的表達量均有不同程度的抑制，其抑制率最高可達70%以上。篩選抑制效率最高的干擾表達重組質粒pG1.2-Tgfβ1shRNA-1轉染MDCC-MSB1細胞，于轉染后48 h提取細胞總蛋白，Western blot法檢測結果顯示轉染干擾表達重組質粒pG1.2-Tgfβ1shRNA-1后,TGFβ1蛋白表達量顯著降低。因此，本研究成功構建了pG1.2-Tgfβ1shRNA干擾表達載體，且其可以干擾MDCC-MSB1細胞中Tgfβ1的表達，為后續(xù)進一步探索Tgfβ1及其調控的關鍵分子在MD腫瘤發(fā)生中的作用奠定基礎。