◎ 馬金麗
(云南云測(cè)質(zhì)量檢驗(yàn)有限公司,云南 昆明 650500)
現(xiàn)階段,全球范圍內(nèi)的糖尿病患者數(shù)量逐漸增多,其中90%以上的患者為2型糖尿病,這給醫(yī)療衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大負(fù)擔(dān)。糖尿病患者需要長(zhǎng)期借助藥物控制血糖,從而降低相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),延緩疾病進(jìn)展[1]。鹽酸二甲雙胍是2型糖尿病治療中常用的藥物,這一藥物的臨床應(yīng)用比較廣泛,且降糖效果明顯。目前市場(chǎng)上流通的鹽酸二甲雙胍有腸溶膠囊、緩釋片和片劑等,因廠(chǎng)家較多、制劑種類(lèi)差異較大,不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的藥物在質(zhì)量上存在差異,尤其是一些雜質(zhì)的存在,可能會(huì)在不同程度上威脅到人體的健康[2]。原料藥是鹽酸二甲雙胍制劑研究的重要基石,為提升用藥的安全性,需要展開(kāi)鹽酸二甲雙胍原料藥中的雜質(zhì)分析。
對(duì)鹽酸二甲雙胍原料藥合成工藝、降解途徑進(jìn)行分析,可知原料藥中包含6種雜質(zhì),其中最常見(jiàn)的有5種,其結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1。為研究方便,分別將其命名為甲、乙、丙、丁和戊。目前,藥典僅僅對(duì)第一種雜質(zhì)的含量作出了限定,而對(duì)于其他雜質(zhì),并無(wú)明確限定。且雜質(zhì)甲正電性不佳,于陽(yáng)離子交換柱上通常難以保留,和溶劑倒峰分離的情況不佳[3]。若測(cè)量中流動(dòng)相選取離子對(duì)比劑或純水相磷酸二氫銨水溶液,可能損傷色譜柱,且檢測(cè)成本較高[4]。為提升雜質(zhì)檢測(cè)的安全性及便利性,需要探討一種新的檢測(cè)方法。
表1 5種雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式表
鹽酸二甲雙胍對(duì)照品(批號(hào)為1169-100A1,其純度100.0%);雜質(zhì)甲的對(duì)照品(純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%);雜質(zhì)乙的對(duì)照品(純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.8%);雜質(zhì)丙的對(duì)照品(純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.2%);雜質(zhì)丁的對(duì)照品(純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)100.0%);雜質(zhì)戊的對(duì)照品(純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%);鹽酸二甲雙胍原料藥(純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.4%);磷酸二氫鉀、磷酸、色譜純的乙腈與實(shí)驗(yàn)室自制重蒸水。
Waterse2695系統(tǒng)的高效液相色譜儀,配套檢測(cè)器是Waterse2998二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Waterse2695系統(tǒng));CPA225D電子分析天平(德國(guó)賽多利斯);SK2510HP超聲波清洗器(上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司);UV-1801型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司);精密pH計(jì)(PHS-3C,上海雷磁儀電股份有限公司);電子分析天平(Sartorius BT-25S)。
1.3.1 溶液配制
(1)制作供試品。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g鹽酸二甲雙胍藥物,在100 mL容量瓶中稱(chēng)定,用體積比為80∶20的乙腈-水溶液作稀釋液,定容到刻度線(xiàn)后搖勻,獲得供試品溶液。
(2)制作對(duì)照溶液。從供試品溶液中,準(zhǔn)確量取0.1 mL,將之放在容量瓶中(容積為100 mL),以稀釋液乙腈-水稀釋到容量瓶的對(duì)應(yīng)刻度,將之搖勻,獲得對(duì)照溶液。
(3)制作雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液。稱(chēng)取含有雜質(zhì)甲、乙、丙、丁和戊的鹽酸二甲雙胍對(duì)照品,甲雜質(zhì)含量為2 mg,其他雜質(zhì)含量均為1 mg。將之放在容量瓶?jī)?nèi)(容積為10 mL),加入適量重蒸水,將其溶解,稀釋到相應(yīng)刻度后搖勻,獲得含雜質(zhì)的對(duì)照品溶液,其中1 mL鹽酸二甲雙胍甲雜質(zhì)含量為200 μg,其他雜質(zhì)含量為1 mL鹽酸二甲雙胍雜質(zhì)含量為100 μg。對(duì)其逐漸稀釋?zhuān)♂尡稊?shù)為10倍、100倍、1 000倍。
(4)制作系統(tǒng)適應(yīng)性溶液。稱(chēng)取50 mg鹽酸二甲雙胍對(duì)照品,放于容量瓶(10 mL),用體積比為80∶20的乙腈-水溶液作稀釋液將其溶解,精確量取0.05 mL含有雜質(zhì)甲的對(duì)照品儲(chǔ)備液,分別量取0.25 mL含有其他4種雜質(zhì)的對(duì)照品儲(chǔ)備液,將之放入上述容量瓶?jī)?nèi),以稀釋液定容至刻度線(xiàn),將之搖勻,作為系統(tǒng)適應(yīng)性溶液。
(5)制作混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液。從含有雜質(zhì)甲的對(duì)照品儲(chǔ)備液中,精密量取0.05 mL,從其他4種雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液中,分別精密量取0.25 mL,放到同一個(gè)容量瓶?jī)?nèi)(10 mL),加入稀釋液至刻度線(xiàn)后停止并搖勻,獲得混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液。
1.3.2 色譜條件
所 用 色 譜 柱 為 Ultimate HⅠLⅠC Amphion Ⅱ,為 250 mm×4.6 mm,5 μm。 所 用 流 動(dòng) 相 為 乙 腈-25 mmol·L-1磷酸二氫鉀,用磷酸對(duì)溶液的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié),使其為3.50,所用體積比為80∶20。色譜柱的溫度為45 ℃,每次進(jìn)樣量為20 μL。檢測(cè)時(shí)所用波長(zhǎng)為213 nm,流動(dòng)相的流速為1.0 mL·min-1。
從前面制備的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液中取樣,根據(jù)1.3.2色譜條件進(jìn)樣分析,對(duì)獲取的色譜圖做好記錄。如圖1所示,一級(jí)各雜質(zhì)分離度均為2.0以上,而雜質(zhì)甲保留時(shí)間(相對(duì))是0.1。
從系統(tǒng)適用性溶液中,準(zhǔn)確量取20 μL,進(jìn)行6次連續(xù)進(jìn)樣。得到甲、乙、丙、丁和戊5種雜質(zhì)的峰面積分別為0.64%、0.58%、0.52%、0.61%和2.1%,均在3.0%以?xún)?nèi),說(shuō)明這一檢測(cè)方法下,儀器具有良好的精密度。
對(duì)各項(xiàng)雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)瑥闹芯_量取20 μL,展開(kāi)檢測(cè),雜質(zhì)定量限∶信噪比是10;雜質(zhì)檢測(cè)限∶信噪比是3。分別制作雜質(zhì)甲、乙、丙、丁和戊的定量限溶液,各制作6份。對(duì)各種溶液峰面積RSD進(jìn)行計(jì)算。經(jīng)過(guò)測(cè)量,雜質(zhì)甲、乙、丙、丁和戊檢測(cè)限分別是 11.84 μg·L-1、29.36 μg·L-1、10.76 μg·L-1、10.57 μg·L-1和 180.26 μg·L-1; 定 量 限分 別 是 39.35 μg·L-1、98.79 μg·L-1、36.57 μg·L-1、35.41 μg·L-1和 605.78 μg·L-1;各項(xiàng)雜質(zhì) RSD 是 1.6%、1.0%、1.8%、1.5%和0.72%。
根據(jù)1.3.2中的色譜條件,量取鹽酸二甲雙胍混合雜質(zhì)的對(duì)照品溶液,在室溫下分別在放置2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h時(shí),從其中精確稱(chēng)取20 μL溶液進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè),對(duì)5種雜質(zhì)的峰面積變化率(RE)和RSD進(jìn)行測(cè)量。通過(guò)測(cè)量發(fā)現(xiàn),在12 h內(nèi)雜質(zhì)對(duì)照品溶液中,各雜質(zhì)峰面積變化率和RSD均為±3.0%范圍內(nèi)(見(jiàn)表2),說(shuō)明混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液,在這一時(shí)間段內(nèi)是保持穩(wěn)定的。
表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果分析表
以相同方法對(duì)供試品的5種雜質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)5種雜質(zhì)的RE和RSD均為±3.0%的范圍內(nèi),表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
根據(jù)系統(tǒng)適用性溶液配制方法,配制系統(tǒng)適用性溶液共6份,根據(jù)外標(biāo)法,對(duì)各項(xiàng)雜質(zhì)含量的RSD進(jìn)行計(jì)算,結(jié)果依次為0.51%、0.72%、0.75%、0.48%和0.85%,均在3.0%以?xún)?nèi),說(shuō)明這一檢測(cè)方法具有優(yōu)良的重復(fù)性。
采集鹽酸二甲雙胍原料藥9份,精確稱(chēng)取后,放在容量瓶之中(10 mL),將稀釋劑加入其中,超聲下溶解,將雜質(zhì)甲的儲(chǔ)備液加入其中,加入量分別是0.04 mL、0.05 mL、0.06 mL,而其他4種雜質(zhì)儲(chǔ)備液分別采集0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL。以稀釋劑將之稀釋到對(duì)應(yīng)刻度之后搖勻,將之制作為不同濃度的回收率樣品溶液,共計(jì)9份。并根據(jù)外標(biāo)法,對(duì)各種雜質(zhì)不同濃度下平均回收率與RSD進(jìn)行計(jì)算,具體結(jié)果見(jiàn)表3。各項(xiàng)雜質(zhì)在不同濃度之下,回收率為92.9%~104.3%,RSD在3.0%以?xún)?nèi),說(shuō)明這一方法具有優(yōu)良的準(zhǔn)確度。
表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果表(單位:%)
對(duì)4個(gè)廠(chǎng)家制造的鹽酸二甲雙胍原料藥中5種雜質(zhì)的含量同時(shí)進(jìn)行測(cè)定,先按照上述步驟,制作對(duì)照溶液,對(duì)檢測(cè)靈敏度進(jìn)行調(diào)整,確保主成分色譜峰峰高為滿(mǎn)量程20%左右。精確量取20 μL系統(tǒng)適用性溶液、20 μL供試品溶液,按照1.3.2色譜條件,對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定,采取外標(biāo)法對(duì)各種已知雜質(zhì)含量進(jìn)行計(jì)算。雜質(zhì)檢查的結(jié)果見(jiàn)表4。
對(duì)表4的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析,可知這4個(gè)廠(chǎng)家所生產(chǎn)的鹽酸二甲雙胍中,雜質(zhì)甲含量在0.02%以?xún)?nèi),而雜質(zhì)乙、丙、丁和戊的含量,均比定量限小,總雜質(zhì)含量低于0.2%。由此可見(jiàn),4個(gè)廠(chǎng)家所生產(chǎn)的鹽酸二甲雙胍原料藥中,雜質(zhì)的含量均符合相關(guān)要求。
表4 4個(gè)廠(chǎng)家鹽酸二甲雙胍中所含雜質(zhì)測(cè)定結(jié)果表(單位:%)
在鹽酸二甲雙胍原料藥物質(zhì)分析中,各國(guó)的藥典均提倡以磺酸基陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行檢測(cè),而且只是對(duì)雜質(zhì)甲展開(kāi)含量限定[5-6]。但這一條件中,雜質(zhì)甲出峰快,和溶劑峰的分離并不理想,因此筆者嘗試其他方法來(lái)進(jìn)行研究。
為對(duì)鹽酸二甲雙胍中5種雜質(zhì)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),可以通過(guò)陰陽(yáng)離子交換色譜柱來(lái)實(shí)現(xiàn)。在選取流動(dòng)相時(shí),考慮到對(duì)色譜柱的損傷和檢測(cè)成本,筆者選取親水作用色譜,最終選擇Ultimate HⅠLⅠC AmphionⅡ色譜柱。另外,在檢測(cè)波長(zhǎng)選擇時(shí),5種雜質(zhì)在210 nm附近均存在紫外吸收情況,雜質(zhì)甲為主要雜質(zhì),其最大吸收波長(zhǎng)為213 nm,因此本研究選取這一波長(zhǎng)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。
本文通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)本研究的方法具有良好的系統(tǒng)適用性,各雜質(zhì)和主藥能夠?qū)崿F(xiàn)分離,而檢測(cè)中的重復(fù)性、精密性、穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果均理想。另外,在定量分析中,通過(guò)外標(biāo)法來(lái)實(shí)施,其方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單??傮w來(lái)看,高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定鹽酸二甲雙胍中的5種雜質(zhì)的含量方法可靠、結(jié)果準(zhǔn)確,可推薦應(yīng)用。