◎ 馬金麗

（云南云測(cè)質(zhì)量檢驗(yàn)有限公司，云南 昆明 650500）

現(xiàn)階段，全球范圍內(nèi)的糖尿病患者數(shù)量逐漸增多，其中90%以上的患者為2型糖尿病，這給醫(yī)療衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大負(fù)擔(dān)。糖尿病患者需要長(zhǎng)期借助藥物控制血糖，從而降低相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，延緩疾病進(jìn)展[1]。鹽酸二甲雙胍是2型糖尿病治療中常用的藥物，這一藥物的臨床應(yīng)用比較廣泛，且降糖效果明顯。目前市場(chǎng)上流通的鹽酸二甲雙胍有腸溶膠囊、緩釋片和片劑等，因廠(chǎng)家較多、制劑種類(lèi)差異較大，不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的藥物在質(zhì)量上存在差異，尤其是一些雜質(zhì)的存在，可能會(huì)在不同程度上威脅到人體的健康[2]。原料藥是鹽酸二甲雙胍制劑研究的重要基石，為提升用藥的安全性，需要展開(kāi)鹽酸二甲雙胍原料藥中的雜質(zhì)分析。

對(duì)鹽酸二甲雙胍原料藥合成工藝、降解途徑進(jìn)行分析，可知原料藥中包含6種雜質(zhì)，其中最常見(jiàn)的有5種，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1。為研究方便，分別將其命名為甲、乙、丙、丁和戊。目前，藥典僅僅對(duì)第一種雜質(zhì)的含量作出了限定，而對(duì)于其他雜質(zhì)，并無(wú)明確限定。且雜質(zhì)甲正電性不佳，于陽(yáng)離子交換柱上通常難以保留，和溶劑倒峰分離的情況不佳[3]。若測(cè)量中流動(dòng)相選取離子對(duì)比劑或純水相磷酸二氫銨水溶液，可能損傷色譜柱，且檢測(cè)成本較高[4]。為提升雜質(zhì)檢測(cè)的安全性及便利性，需要探討一種新的檢測(cè)方法。

表1 5種雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式表

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸二甲雙胍對(duì)照品（批號(hào)為1169-100A1，其純度100.0%）；雜質(zhì)甲的對(duì)照品（純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）；雜質(zhì)乙的對(duì)照品（純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.8%）；雜質(zhì)丙的對(duì)照品（純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.2%）；雜質(zhì)丁的對(duì)照品（純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)100.0%）；雜質(zhì)戊的對(duì)照品（純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）；鹽酸二甲雙胍原料藥（純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.4%）；磷酸二氫鉀、磷酸、色譜純的乙腈與實(shí)驗(yàn)室自制重蒸水。

1.2 儀器和設(shè)備

Waterse2695系統(tǒng)的高效液相色譜儀，配套檢測(cè)器是Waterse2998二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Waterse2695系統(tǒng)）；CPA225D電子分析天平（德國(guó)賽多利斯）；SK2510HP超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；UV-1801型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）；精密pH計(jì)（PHS-3C，上海雷磁儀電股份有限公司）；電子分析天平（Sartorius BT-25S）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

（1）制作供試品。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g鹽酸二甲雙胍藥物，在100 mL容量瓶中稱(chēng)定，用體積比為80∶20的乙腈-水溶液作稀釋液，定容到刻度線(xiàn)后搖勻，獲得供試品溶液。

（2）制作對(duì)照溶液。從供試品溶液中，準(zhǔn)確量取0.1 mL，將之放在容量瓶中（容積為100 mL），以稀釋液乙腈-水稀釋到容量瓶的對(duì)應(yīng)刻度，將之搖勻，獲得對(duì)照溶液。

（3）制作雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液。稱(chēng)取含有雜質(zhì)甲、乙、丙、丁和戊的鹽酸二甲雙胍對(duì)照品，甲雜質(zhì)含量為2 mg，其他雜質(zhì)含量均為1 mg。將之放在容量瓶?jī)?nèi)（容積為10 mL），加入適量重蒸水，將其溶解，稀釋到相應(yīng)刻度后搖勻，獲得含雜質(zhì)的對(duì)照品溶液，其中1 mL鹽酸二甲雙胍甲雜質(zhì)含量為200 μg，其他雜質(zhì)含量為1 mL鹽酸二甲雙胍雜質(zhì)含量為100 μg。對(duì)其逐漸稀釋?zhuān)♂尡稊?shù)為10倍、100倍、1 000倍。

（4）制作系統(tǒng)適應(yīng)性溶液。稱(chēng)取50 mg鹽酸二甲雙胍對(duì)照品，放于容量瓶（10 mL），用體積比為80∶20的乙腈-水溶液作稀釋液將其溶解，精確量取0.05 mL含有雜質(zhì)甲的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別量取0.25 mL含有其他4種雜質(zhì)的對(duì)照品儲(chǔ)備液，將之放入上述容量瓶?jī)?nèi)，以稀釋液定容至刻度線(xiàn)，將之搖勻，作為系統(tǒng)適應(yīng)性溶液。

（5）制作混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液。從含有雜質(zhì)甲的對(duì)照品儲(chǔ)備液中，精密量取0.05 mL，從其他4種雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液中，分別精密量取0.25 mL，放到同一個(gè)容量瓶?jī)?nèi)（10 mL），加入稀釋液至刻度線(xiàn)后停止并搖勻，獲得混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液。

1.3.2 色譜條件

所 用 色 譜 柱 為 Ultimate HⅠLⅠC Amphion Ⅱ，為 250 mm×4.6 mm，5 μm。 所 用 流 動(dòng) 相 為 乙 腈-25 mmol·L-1磷酸二氫鉀，用磷酸對(duì)溶液的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，使其為3.50，所用體積比為80∶20。色譜柱的溫度為45 ℃，每次進(jìn)樣量為20 μL。檢測(cè)時(shí)所用波長(zhǎng)為213 nm，流動(dòng)相的流速為1.0 mL·min-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

從前面制備的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液中取樣，根據(jù)1.3.2色譜條件進(jìn)樣分析，對(duì)獲取的色譜圖做好記錄。如圖1所示，一級(jí)各雜質(zhì)分離度均為2.0以上，而雜質(zhì)甲保留時(shí)間（相對(duì)）是0.1。

2.2 精密度試驗(yàn)

從系統(tǒng)適用性溶液中，準(zhǔn)確量取20 μL，進(jìn)行6次連續(xù)進(jìn)樣。得到甲、乙、丙、丁和戊5種雜質(zhì)的峰面積分別為0.64%、0.58%、0.52%、0.61%和2.1%，均在3.0%以?xún)?nèi)，說(shuō)明這一檢測(cè)方法下，儀器具有良好的精密度。

2.3 檢測(cè)限分析

對(duì)各項(xiàng)雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)瑥闹芯_量取20 μL，展開(kāi)檢測(cè)，雜質(zhì)定量限∶信噪比是10；雜質(zhì)檢測(cè)限∶信噪比是3。分別制作雜質(zhì)甲、乙、丙、丁和戊的定量限溶液，各制作6份。對(duì)各種溶液峰面積RSD進(jìn)行計(jì)算。經(jīng)過(guò)測(cè)量，雜質(zhì)甲、乙、丙、丁和戊檢測(cè)限分別是 11.84 μg·L-1、29.36 μg·L-1、10.76 μg·L-1、10.57 μg·L-1和 180.26 μg·L-1； 定 量 限分 別 是 39.35 μg·L-1、98.79 μg·L-1、36.57 μg·L-1、35.41 μg·L-1和 605.78 μg·L-1；各項(xiàng)雜質(zhì) RSD 是 1.6%、1.0%、1.8%、1.5%和0.72%。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

根據(jù)1.3.2中的色譜條件，量取鹽酸二甲雙胍混合雜質(zhì)的對(duì)照品溶液，在室溫下分別在放置2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h時(shí)，從其中精確稱(chēng)取20 μL溶液進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)，對(duì)5種雜質(zhì)的峰面積變化率（RE）和RSD進(jìn)行測(cè)量。通過(guò)測(cè)量發(fā)現(xiàn)，在12 h內(nèi)雜質(zhì)對(duì)照品溶液中，各雜質(zhì)峰面積變化率和RSD均為±3.0%范圍內(nèi)（見(jiàn)表2），說(shuō)明混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液，在這一時(shí)間段內(nèi)是保持穩(wěn)定的。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果分析表

以相同方法對(duì)供試品的5種雜質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)5種雜質(zhì)的RE和RSD均為±3.0%的范圍內(nèi)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

根據(jù)系統(tǒng)適用性溶液配制方法，配制系統(tǒng)適用性溶液共6份，根據(jù)外標(biāo)法，對(duì)各項(xiàng)雜質(zhì)含量的RSD進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果依次為0.51%、0.72%、0.75%、0.48%和0.85%，均在3.0%以?xún)?nèi)，說(shuō)明這一檢測(cè)方法具有優(yōu)良的重復(fù)性。

2.6 回收率試驗(yàn)

采集鹽酸二甲雙胍原料藥9份，精確稱(chēng)取后，放在容量瓶之中（10 mL），將稀釋劑加入其中，超聲下溶解，將雜質(zhì)甲的儲(chǔ)備液加入其中，加入量分別是0.04 mL、0.05 mL、0.06 mL，而其他4種雜質(zhì)儲(chǔ)備液分別采集0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL。以稀釋劑將之稀釋到對(duì)應(yīng)刻度之后搖勻，將之制作為不同濃度的回收率樣品溶液，共計(jì)9份。并根據(jù)外標(biāo)法，對(duì)各種雜質(zhì)不同濃度下平均回收率與RSD進(jìn)行計(jì)算，具體結(jié)果見(jiàn)表3。各項(xiàng)雜質(zhì)在不同濃度之下，回收率為92.9%～104.3%，RSD在3.0%以?xún)?nèi)，說(shuō)明這一方法具有優(yōu)良的準(zhǔn)確度。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果表（單位：%）

2.7 鹽酸二甲雙胍中所含雜質(zhì)測(cè)定結(jié)果分析

對(duì)4個(gè)廠(chǎng)家制造的鹽酸二甲雙胍原料藥中5種雜質(zhì)的含量同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，先按照上述步驟，制作對(duì)照溶液，對(duì)檢測(cè)靈敏度進(jìn)行調(diào)整，確保主成分色譜峰峰高為滿(mǎn)量程20%左右。精確量取20 μL系統(tǒng)適用性溶液、20 μL供試品溶液，按照1.3.2色譜條件，對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，采取外標(biāo)法對(duì)各種已知雜質(zhì)含量進(jìn)行計(jì)算。雜質(zhì)檢查的結(jié)果見(jiàn)表4。

對(duì)表4的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，可知這4個(gè)廠(chǎng)家所生產(chǎn)的鹽酸二甲雙胍中，雜質(zhì)甲含量在0.02%以?xún)?nèi)，而雜質(zhì)乙、丙、丁和戊的含量，均比定量限小，總雜質(zhì)含量低于0.2%。由此可見(jiàn)，4個(gè)廠(chǎng)家所生產(chǎn)的鹽酸二甲雙胍原料藥中，雜質(zhì)的含量均符合相關(guān)要求。

表4 4個(gè)廠(chǎng)家鹽酸二甲雙胍中所含雜質(zhì)測(cè)定結(jié)果表（單位：%）

3 結(jié)論

在鹽酸二甲雙胍原料藥物質(zhì)分析中，各國(guó)的藥典均提倡以磺酸基陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行檢測(cè)，而且只是對(duì)雜質(zhì)甲展開(kāi)含量限定[5-6]。但這一條件中，雜質(zhì)甲出峰快，和溶劑峰的分離并不理想，因此筆者嘗試其他方法來(lái)進(jìn)行研究。

為對(duì)鹽酸二甲雙胍中5種雜質(zhì)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，可以通過(guò)陰陽(yáng)離子交換色譜柱來(lái)實(shí)現(xiàn)。在選取流動(dòng)相時(shí)，考慮到對(duì)色譜柱的損傷和檢測(cè)成本，筆者選取親水作用色譜，最終選擇Ultimate HⅠLⅠC AmphionⅡ色譜柱。另外，在檢測(cè)波長(zhǎng)選擇時(shí)，5種雜質(zhì)在210 nm附近均存在紫外吸收情況，雜質(zhì)甲為主要雜質(zhì)，其最大吸收波長(zhǎng)為213 nm，因此本研究選取這一波長(zhǎng)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

本文通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)本研究的方法具有良好的系統(tǒng)適用性，各雜質(zhì)和主藥能夠?qū)崿F(xiàn)分離，而檢測(cè)中的重復(fù)性、精密性、穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果均理想。另外，在定量分析中，通過(guò)外標(biāo)法來(lái)實(shí)施，其方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單?？傮w來(lái)看，高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定鹽酸二甲雙胍中的5種雜質(zhì)的含量方法可靠、結(jié)果準(zhǔn)確，可推薦應(yīng)用。