王曉婧，王星星，王萌，賈艷蘭

(山西工商學(xué)院，太原 030006)

壺瓶棗是山西省太谷縣的一大特色農(nóng)產(chǎn)品，棗肉中的類黃酮、總酚等含量十分高[1]。壺瓶棗含糖量高，每100 g果肉中含糖量約30～50 g，可以被酵母菌利用[2]，由于壺瓶棗成熟后容易落果，雨天出現(xiàn)大量裂棗，裂棗不利于運(yùn)輸儲(chǔ)存，造成很多浪費(fèi)而影響收入，裂棗的開發(fā)利用成為研究熱點(diǎn)[3-4]。山西呂梁的沙棘占地面積廣，沙棘是一種落葉灌木或小樹[5-6]，沙棘果實(shí)營養(yǎng)物質(zhì)豐富，如氨基酸是鹿茸的5倍，多酚類化合物是人參的4倍；其中維生素含量最高，是蘋果的200多倍，被稱為“Vc之王”[7-8]。

現(xiàn)階段人們生活水平普遍提高，健康飲食觀念現(xiàn)在深入人心，針對消費(fèi)者的健康需求，零蔗糖添加的果醋成為新的研究趨勢。果醋產(chǎn)品的開發(fā)，很大程度上提高了資源的合理利用效率，減少了因人為或自然條件引起的果蔬資源浪費(fèi)，對社會(huì)經(jīng)濟(jì)建設(shè)起到了極有力的推動(dòng)作用。

壺瓶棗糖含量高，利于酵母菌發(fā)酵，不需要添加糖類也可以達(dá)到發(fā)酵所需的糖度，而沙棘的糖含量超低，有機(jī)酸高，難以單獨(dú)發(fā)酵，可以把沙棘加入到棗漿中調(diào)節(jié)pH，把兩者的優(yōu)點(diǎn)集中在一起，在棗醋的口感、香味等方面改變，傳統(tǒng)的棗醋發(fā)酵需要先調(diào)節(jié)糖度再進(jìn)行酒精發(fā)酵，本試驗(yàn)在酒精發(fā)酵階段采用酵母菌和乳酸菌進(jìn)行混菌發(fā)酵，并進(jìn)行工藝優(yōu)化。

本文以壺瓶棗、沙棘為原料進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵制備復(fù)合果醋，選擇接種酵母菌和乳酸菌進(jìn)行混合菌種發(fā)酵，通過測定發(fā)酵液的酒精度和還原糖含量，篩選出酵母菌和乳酸菌的種類和接種量。以發(fā)酵液的酒精度、還原糖為評價(jià)指標(biāo)，在乳酸菌接種量、發(fā)酵pH、發(fā)酵溫度的單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用響應(yīng)面分析法對棗醋酒精發(fā)酵條件進(jìn)行工藝優(yōu)化，確定最佳工藝條件。

1 材料和方法

1.1 材料

壺瓶棗(裂棗)；沙棘：太原市小店區(qū)美特好超市；安琪葡萄酒·果酒專用酵母RW、SY：安琪酵母股份有限公司；嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌：西安綠藤生物科技有限公司。

1.2 試劑

鹽酸(HCl)、硫酸銅(CuSO4·5H2O)、氫氧化鈉(NaOH)、乙酸鋅[Zn(CH3COO)2·2H2O]、冰乙酸(C2H4O2)、酚酞：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；亞甲藍(lán)(C16H18ClN3S·3H2O)：天津市北辰方正試劑廠；酒石酸鉀鈉(C4H4O6KNa·4H2O)：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；亞鐵氰化鉀[K4Fe(CN)6·3H2O]：天津市申泰化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

BCD-521WDPW型冰箱 青島海爾集團(tuán)；JA2003型電子天平 上海菁海儀器有限公司；HH-T600型電熱恒溫水浴鍋 常州市雙舜儀器設(shè)備有限公司；JP12D-800型多功能榨汁機(jī) 蘇泊爾集團(tuán)有限公司；HH-S2型數(shù)顯二孔恒溫水浴鍋、TS-2102C型恒溫振蕩培養(yǎng)箱、TGL-16GB型高速臺(tái)式離心機(jī) 常州市金壇大地自動(dòng)化儀器廠；萬用電爐、酒精計(jì) 北京科偉永興儀器有限公司；DK-8B型電熱恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；WZ-108型折光儀 北京萬成北增精密儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 復(fù)合果醋的釀造工藝流程[9-11]

壺瓶棗、沙棘→篩選→清洗→預(yù)煮→打漿→酶解(果膠酶)→壺瓶棗沙棘混合液→接種(酵母菌RW、保加利亞乳桿菌)→酒精發(fā)酵→發(fā)酵結(jié)束→接種醋酸菌→醋酸發(fā)酵→過濾→調(diào)配→殺菌→壺瓶棗沙棘復(fù)合醋。

1.4.2 操作要點(diǎn)

1.4.2.1 原料挑選

新鮮的壺瓶棗(半紅期至全紅期裂棗)、沙棘[12]。

1.4.2.2 破碎、榨汁

破碎、去核，將果肉放入多功能榨汁機(jī)中，按質(zhì)量比加入水打漿，再將棗漿與沙棘汁按一定比例混勻，得到混合液。

1.4.2.3 酶解

將混合液升溫至55 ℃，并加入0.2%的果膠酶，恒溫酶解3.5 h，于90 ℃水浴鍋中滅酶5～10 min。

1.4.2.4 酒精發(fā)酵

以酶解完成的混合液為原料，接入適量安琪酵母、保加利亞乳桿菌置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行2 d的酒精發(fā)酵[13]。

1.4.2.5 醋酸發(fā)酵

加入食品質(zhì)量與安全微生物實(shí)驗(yàn)室二次擴(kuò)培的醋酸菌進(jìn)行醋酸發(fā)酵[14]。

1.4.3 酵母菌菌種及接種量的確定

以酶解后的壺瓶棗、沙棘混合液為基料，分別接種酵母RW和SY 0.2%進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間2 d，酒精發(fā)酵結(jié)束后，按照1.5.1和1.5.2的方法測定還原糖和酒精度，確定酵母菌菌種[15-17]。

在確定酵母菌的菌種基礎(chǔ)上，分別接種0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.3%進(jìn)行酒精發(fā)酵，按照1.5.1和1.5.2的方法測定酒精度和還原糖，確定酵母菌最佳接種量。

1.4.4 乳酸菌菌種的確定

在酵母菌菌種以及接種量確定的條件下，將一定量的嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、長雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌分別接入酶解液中，進(jìn)行混合菌種發(fā)酵，按照1.5.1和1.5.2的方法測定酒精度和還原糖，確定乳酸菌的菌種[18]。

1.4.5 單因素試驗(yàn)

1.4.5.1 乳酸菌接種量的單因素試驗(yàn)

選擇酵母菌接種量0.2%，發(fā)酵溫度25 ℃，初始pH 4.4，設(shè)置乳酸菌的接種量分別為0.20%、0.16%、0.12%、0.08%、0.04%，測定酒精度和酸度，確定最佳乳酸菌接種量。

1.4.5.2 發(fā)酵pH值的單因素試驗(yàn)

建立并實(shí)施分級診療制度，是實(shí)現(xiàn)“基層首診、雙向轉(zhuǎn)診、急慢分治、上下聯(lián)動(dòng)”合理有序就醫(yī)新格局，合理醫(yī)療資源配置和促進(jìn)基本醫(yī)療衛(wèi)生服務(wù)均等化的重要措施。2015年9月國務(wù)院辦公廳印發(fā)了《關(guān)于推進(jìn)分級診療制度建設(shè)的指導(dǎo)意見》，明確要求大力推行分級診療制度。2015年12月國家衛(wèi)計(jì)委下發(fā)了《關(guān)于做好高血壓、糖尿病分級診療試點(diǎn)工作的通知》，明確了不同級別醫(yī)療機(jī)構(gòu)的功能定位，將高血壓、糖尿病等慢性病作為分級診療試點(diǎn)開展先行工作。

在酵母菌接種量0.2%、乳酸菌接種量0.08%、發(fā)酵溫度25 ℃的條件下，設(shè)置pH梯度為3.6，3.9，4.0，4.2，4.4，4.6，測定發(fā)酵液中酒精度和還原糖，確定最佳發(fā)酵pH。

1.4.5.3 發(fā)酵溫度的單因素試驗(yàn)

酵母菌接種量0.2%、乳酸菌接種量0.08%、發(fā)酵pH 4.4，調(diào)整發(fā)酵溫度分別為19，22，25，28，31 ℃，測定發(fā)酵液中的酒精度和還原糖，確定最佳發(fā)酵溫度。

1.4.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，以乳酸菌接種量(A)、發(fā)酵pH(B)、發(fā)酵溫度(C)3個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以酒精度作為響應(yīng)指標(biāo)，確定酒精發(fā)酵的工藝條件，響應(yīng)面分析因素水平見表1[19]。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素及水平Table 1 The factors and levels of response surface test design

1.5 測定方法

1.5.1 總糖、還原糖的測定

參考GB 5009.7-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中還原糖的測定》第一法直接滴定法。

參考GB/T 15038-1994《葡萄酒、果酒通用試驗(yàn)方法》酒精度第三法酒精計(jì)法。

用蒸餾法蒸餾，取100 mL發(fā)酵液于500 mL圓底燒瓶中，加入50 mL蒸餾水，放4顆沸石在水浴鍋中蒸餾，將蒸餾出的溶液定容到100 mL量筒中，將酒精計(jì)放入量筒中，同時(shí)用溫度計(jì)測量溫度，靜置5 min，讀取刻度線數(shù)值，記錄溫度，將讀取的數(shù)據(jù)按附錄進(jìn)行溫度校正，得到20 ℃時(shí)發(fā)酵液的酒精度。

1.5.3 總酸的測定

參考GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中總酸指示劑法。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌菌種及接種量的確定

根據(jù)1.4.3的試驗(yàn)方法，酵母菌菌種及接種量的確定見圖1和圖2。

圖1 酵母菌種類對酒精發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of yeast species on alcohol fermentation

由圖1可知，接入酵母菌RW的發(fā)酵液測出的酒精度為5.3%，還原糖為0.698%，而酵母SY蒸餾出的酒精度為4.1%，還原糖為0.828%，結(jié)果顯示：菌種RW發(fā)酵后酒精度比菌種SY的高，還原糖比菌種SY的低，利用發(fā)酵糖產(chǎn)酒能力強(qiáng)，所以選擇酵母RW。

圖2 酵母菌接種量對酒精發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of yeast inoculation amount on alcohol fermentation

由圖2可知，當(dāng)酵母菌的接種量在0.10%、0.20%、0.30%時(shí)，酒精度最高，都是5.6%，而三者的還原糖分別為0.763%、0.729%、0.739%，其中0.20%的還原糖最低，為0.729%，結(jié)合酒精度與還原糖殘?zhí)橇浚式湍妇慕臃N量選擇0.20%。

綜上所述，酵母菌選擇酵母RW，接種量為0.20%。

2.2 乳酸菌菌種的確定

根據(jù)1.4.4所示的試驗(yàn)方法，乳酸菌的菌種選擇見圖3。

圖3 乳酸菌菌種對酒精發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of lactic acid bacteria species on alcohol fermentation

由圖3可知，嗜酸乳桿菌、長雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌4種菌種分別與酵母菌混合發(fā)酵后，結(jié)果顯示：嗜酸乳桿菌、長雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌酒精發(fā)酵后的酒精度都是4.4%，而保加利亞乳桿菌的酒精度為4.5%，并且保加利亞乳桿菌發(fā)酵后的還原糖殘?zhí)橇孔畹?，?.589%，可明顯看出保加利亞乳桿菌的產(chǎn)酒能力優(yōu)于其他3種乳酸菌，故乳酸菌的菌種選擇保加利亞乳桿菌。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 乳酸菌接種量對酒精發(fā)酵的影響

根據(jù)1.4.5試驗(yàn)方法，乳酸菌接種量對酒精度的影響見圖4。

由圖4可知，乳酸菌接種量增加，發(fā)酵液的酒精度在不斷降低，乳酸菌接種量為0.04%和0.08%時(shí)，酒精度達(dá)到6.4%和6.3%，酸度分別為3.65%和3.71%。乳酸菌接種量為0.04%和0.08%時(shí)酒精度高，但接種量為0.08%時(shí)酸度最高，所以選擇乳酸菌的接種量0.08%。

2.3.2 初始pH對酒精發(fā)酵的影響

發(fā)酵pH對酒精度的影響見圖5。

圖5 發(fā)酵pH對酒精發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of fermentation pH value on alcohol fermentation

由圖5可知，隨著pH值的升高，還原糖越來越低，酒精度越來越高，當(dāng)pH為4.4時(shí)，還原糖達(dá)到最低點(diǎn)，酒精度達(dá)到最高點(diǎn)。當(dāng)pH為4.4時(shí)，酒精度為6.35%，還原糖為0.568%，所以選pH 4.4為宜。

2.3.3 發(fā)酵溫度對酒精發(fā)酵的影響

發(fā)酵溫度對酒精度的影響見圖6。

由圖6可知，當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，酒精度最高，為6.3%，還原糖含量為0.865%。所以選擇溫度25 ℃為最適宜條件。

圖6 發(fā)酵溫度對酒精發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on alcohol fermentation

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以發(fā)酵液的酒精度為評價(jià)指標(biāo)，在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對乳酸菌接種量(A)、發(fā)酵pH(B)、發(fā)酵溫度(C)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The test design and results

運(yùn)用Design-Expert 8.0對表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，獲得乳酸菌接種量(A)、pH(B)、溫度(C)與酒精度(R)的二次多項(xiàng)回歸方程式：

R=6.02-0.22A-0.100B-0.025C+0.100AB+0.45AC+0.30BC-0.49A2-0.44B2-0.28C2。

對該響應(yīng)面二次回歸模型進(jìn)行方差分析, 結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果Table 3 Response surface quadratic regression equation model results of variance analysis

顯著性試驗(yàn)結(jié)果以P值大小表示，P值<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對模型進(jìn)行方差分析，由表3可知，模型的P值<0.01，極顯著，可用于預(yù)測復(fù)合棗醋的最佳酒精發(fā)酵工藝。失擬項(xiàng)的P=0.6603>0.05，不顯著，說明誤差較小，預(yù)測的結(jié)果較可靠。模型的F值為10.61，說明模型具有顯著性。只有0.26%的幾率會(huì)因?yàn)樵胍舳霈F(xiàn)如此大的“F值”。因此，可用此模型對復(fù)合棗醋酒精發(fā)酵的工藝條件結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測[21]。

由表3中方差分析結(jié)果可知，本試驗(yàn)中二次項(xiàng)A2、B2、交互項(xiàng)AC對結(jié)果的影響極顯著；一次項(xiàng)A、二次項(xiàng)C2及交互項(xiàng)BC的P<0.05，表明對結(jié)果的影響顯著；B和C及交互項(xiàng)AB的P>0.05，說明B、C、交互項(xiàng)AB對酒精度的影響不顯著。

對酒精度影響的各因素交互作用見圖7。其中，乳酸菌接種量與發(fā)酵溫度的交互作用影響極顯著，發(fā)酵pH與發(fā)酵溫度的交互作用對酒精度的影響顯著，乳酸菌接種量與發(fā)酵pH的交互作用對酒精度無顯著影響。

由Design-Expert 8.0分析處理得到酒精發(fā)酵階段最佳發(fā)酵條件為：乳酸菌接種量0.07%，溫度24.38 ℃，pH 4.35，在此條件下，酒精度為6.127%。

2.5 響應(yīng)面結(jié)果驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面預(yù)測結(jié)果，對結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。驗(yàn)證試驗(yàn)中將最佳條件進(jìn)行調(diào)整：乳酸菌接種量為0.07%，發(fā)酵pH為 4.3，發(fā)酵溫度為24 ℃，在此條件下測得酒精度為6.1%，與預(yù)測結(jié)果相接近。

3 結(jié)論

以山西省的壺瓶裂棗、沙棘為原料，通過單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化出復(fù)合棗醋酒精發(fā)酵階段的最佳發(fā)酵工藝：乳酸菌接種量0.07%，發(fā)酵pH 4.3，發(fā)酵溫度24 ℃，在此條件下，酒精度為6.1%。