盧宏皓，劉昭明，黃翠姬，虞珂娜，萬堃華

(廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006)

異型發(fā)酵乳酸菌(heterofermentative lactic acid bacteria)是指能夠進(jìn)行異型發(fā)酵代謝[1]，除生成乳酸外還生成CO2、乙醇和甘露醇等多種物質(zhì)的乳酸菌。與同型發(fā)酵乳酸菌(homofermentative lactic acid bacteria)相比，異型發(fā)酵乳酸菌生成的乳酸相對較少，但是由于其可以生成甘露醇、乙醇等風(fēng)味物質(zhì)，賦予發(fā)酵產(chǎn)品更好的風(fēng)味與口感，所以異型發(fā)酵乳酸菌被認(rèn)為是更好的蔬菜腌制的發(fā)酵菌種[2]。有研究表明，使用乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和檸檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)混合發(fā)酵韓國泡菜，改善了泡菜的風(fēng)味特性，延長了泡菜的貨架期[3]；在韓國泡菜發(fā)酵中采用檸檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)進(jìn)行發(fā)酵可以提高產(chǎn)品的品質(zhì)。異型發(fā)酵乳酸菌可以增加發(fā)酵食品的風(fēng)味，與其發(fā)酵過程中生成的代謝產(chǎn)物甘露醇密切相關(guān)。Choi等[4]研究發(fā)現(xiàn)模式泡菜的感官偏好與甘露醇濃度呈正相關(guān)；云琳等[5]認(rèn)為甘露醇是蘿卜泡菜的特征性風(fēng)味物質(zhì)，具有清爽的甜味。

異型發(fā)酵乳酸菌是發(fā)酵法生產(chǎn)甘露醇的優(yōu)良菌株[6]，因此有關(guān)優(yōu)良異型發(fā)酵乳酸菌的分離鑒定與發(fā)酵性能研究是其應(yīng)用于改善發(fā)酵食品風(fēng)味的基礎(chǔ)。發(fā)酵酸筍是以竹筍為原料經(jīng)發(fā)酵制得的發(fā)酵食品，為柳州螺螄粉的重要配菜，是形成螺螄粉獨(dú)特“酸爽”風(fēng)味的重要食材，而風(fēng)味物質(zhì)的形成依賴于異型乳酸菌的代謝。長期以來，酸筍的生產(chǎn)主要以小作坊的自然發(fā)酵法為主要模式，其產(chǎn)品質(zhì)量及安全性難以保證。目前，就我們所知，國內(nèi)尚未見到有從酸筍中分離異型乳酸菌的報(bào)道。為了獲得適用于酸筍接種發(fā)酵的異型乳酸菌，本研究以甘露醇為指標(biāo)，從自然發(fā)酵酸筍中篩選出產(chǎn)甘露醇的異型乳酸菌，并對其性能進(jìn)行研究，為異型乳酸菌接種發(fā)酵酸筍提供了指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

竹筍：購自廣西柳州市區(qū)桂中菜市場。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏4 g，牛肉膏5 g，檸檬酸三銨2 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1 mL，無水乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.5±0.2。

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中添加2%(W/V)瓊脂粉。

MRS選擇培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中額外添加2%(W/V)果糖。

引物27F/1492R：北京索萊寶科技有限公司；EB替代染料：北京普利萊基因技術(shù)有限公司；TBE buffer、2×Taq PCR MasterMix II、去離子水：天根生化科技有限公司。

其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

E220雙目生物光學(xué)顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；H3-18KR臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南可成儀器設(shè)備有限公司；P3PC紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；TC-XP-G XP基因擴(kuò)增儀 杭州博日科技有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)甘露醇乳酸菌的分離與鑒定

1.3.1.1 酸筍發(fā)酵

將鮮筍剝皮，清洗干凈，切分成長約4 cm、寬約3 cm、厚約0.5 cm的片狀，自然晾干后裝入2 L發(fā)酵瓶中(裝瓶量為容積的1/2)，然后加入涼白開水浸沒過鮮筍表面，封蓋自然發(fā)酵。

1.3.1.2 乳酸菌初篩

初篩的目的是從酸筍發(fā)酵液中分離純化出具有乳酸菌特征的菌株。因此，取第1，3，5天的酸筍發(fā)酵液各1 mL，用生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，采用傾注法[7]取適宜梯度的樣品稀釋液1 mL混勻于含有2% CaCO3的MRS平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h，同時(shí)接種1 mL生理鹽水作為空白對照。從平板中挑取有明顯溶鈣圈的單菌落接種于新的MRS平板進(jìn)行分離純化，純化3～4代，將分離純化所得的革蘭氏染色陽性、過氧化氫接觸酶陰性的菌株轉(zhuǎn)接于斜面，30 ℃培養(yǎng)48 h后于4 ℃保藏[8]。

1.3.1.3 乳酸菌復(fù)篩

復(fù)篩的目的是從初篩得到的乳酸菌菌株中篩選具有產(chǎn)甘露醇能力的異型發(fā)酵乳酸菌。將初篩獲得的菌株接入MRS液體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化2次后按1%(V/V)接種于MRS選擇培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取1.5 mL發(fā)酵液經(jīng)離心機(jī)離心(4 ℃，10000 r/min，10 min)，取上清液，采用改進(jìn)的高碘酸鈉氧化法測定其中甘露醇含量[9]。收集甘露醇產(chǎn)量大于18 g/L的異型發(fā)酵乳酸菌菌株。

1.3.1.4 分子生物學(xué)鑒定

將獲得的目標(biāo)菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，8000 r/min離心2 min，棄上清液，收集離心到的菌體并以其為模板，利用細(xì)菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因。在50 μL的反應(yīng)體系中加入DNA模板2 μL，27F引物1 μL，1492R引物1 μL，2×Taq PCR MasterMix II 10 μL，ddH2O 6 μL。

PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送交華大基因公司進(jìn)行16S rDNA測序，所得序列在NCBI中進(jìn)行比對，確定菌株，采用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 異型發(fā)酵乳酸菌生長曲線的測定

將獲得的高產(chǎn)甘露醇菌株于30 ℃培養(yǎng)24 h后按1%(V/V)接種于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每3 h取菌液適當(dāng)稀釋后測定其在波長600 nm處的吸光度值，繪制乳酸菌的生長曲線。

種子液制備：取供試菌種接種至MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，然后取1%(V/V)發(fā)酵液接種于新的MRS液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)12 h作為種子液。

1.3.3 異型發(fā)乳酸菌產(chǎn)酸能力的測定

在MRS液體培養(yǎng)基中接入1%(V/V)的種子液，30 ℃培養(yǎng)24 h后取發(fā)酵液經(jīng)離心后測定總酸含量?？偹岷康臏y定參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》，含量以乳酸計(jì)。

1.3.4 異型發(fā)酵乳酸菌降解亞硝酸鹽能力的測定

在已滅菌的含有10 μg/mL亞硝酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基中接入1%(V/V)的種子液，30 ℃培養(yǎng)24 h。

將發(fā)酵液離心后取1 mL上清液置于100 mL容量瓶中，加入2.5 mL 50 g/L飽和硼砂溶液,加入70 ℃左右的水約50 mL，混勻，于沸水浴中加熱 15 min，取出置于冷水浴中冷卻，并放置至室溫。加入1 mL 106 g/L亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入1 mL 220 g/L乙酸鋅溶液,以沉淀蛋白質(zhì)。加水至刻度，搖勻，放置30 min，除去上層脂肪，上清液用濾紙過濾,棄去初濾液15 mL，濾液備用。

亞硝酸鹽的測定方法參照GB 5009.33-2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》。

1.3.5 異型乳酸菌產(chǎn)甘露醇特性實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 果糖濃度與菌株產(chǎn)甘露醇的關(guān)系

將MRS液體培養(yǎng)基中的葡萄糖換成果糖，使培養(yǎng)基中果糖終濃度分別為20，40，60，80，100 g/L。在不同果糖濃度的培養(yǎng)基中分別接入1%(V/V)種子液，30 ℃培養(yǎng)48 h后取發(fā)酵液經(jīng)離心后測定甘露醇含量。

1.3.5.2 pH值與菌株產(chǎn)甘露醇的關(guān)系

MRS發(fā)酵培養(yǎng)基：根據(jù)1.3.5.1的結(jié)果選擇最優(yōu)果糖含量的MRS果糖培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為5.0，6.0，7.0。

根據(jù)1.3.3～1.3.5.1的結(jié)果選擇發(fā)酵性能最優(yōu)的菌株，在不同pH值的MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中接入1%(V/V)的種子液，30 ℃培養(yǎng)48 h，以不接種的果糖培養(yǎng)基作為對照組，以蒸餾水為空白并分別在0，8，24，48 h測定pH值、乳酸菌總數(shù)、甘露醇及總酸含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組3個(gè)平行試樣，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式。使用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用ANOVA進(jìn)行顯著性分析，顯著水平P<0.05，以不同字母表示，利用Microsoft Office Excel 2010、Origin 9、MEGA 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和圖形制作。

2 結(jié)果與討論

2.1 高產(chǎn)甘露醇異型發(fā)酵乳酸菌的分離篩選

從自然發(fā)酵酸筍中共分離、純化得到108株菌株，經(jīng)革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗(yàn)，共得到61株革蘭氏染色為陽性、過氧化氫為陰性的菌株，分別編號(hào)為1～61號(hào)，部分菌株的菌體形態(tài)見圖1。將初篩獲得的菌株在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，取其發(fā)酵液與高碘酸鈉試劑反應(yīng)，測定發(fā)酵液顏色變化較深的6株菌株的甘露醇含量，結(jié)果見圖2。

圖1 部分菌株的菌體形態(tài)Fig.1 The mycelial morphology of some strains

圖2 甘露醇產(chǎn)量

由圖2可知，3號(hào)、11號(hào)、12號(hào)菌株的甘露醇產(chǎn)量較高，產(chǎn)量達(dá)18 g/L以上，分別為18.43，18.30，18.03 g/L，其余菌種的甘露醇產(chǎn)量相對較低，達(dá)不到18 g/L，故棄去。選取3號(hào)、11號(hào)、12號(hào)菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)測定。

2.2 異型發(fā)酵乳酸菌生長動(dòng)力學(xué)

測定3號(hào)、11號(hào)、12號(hào) 3株異型發(fā)酵乳酸菌的生長曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 乳酸菌生長曲線Fig.3 The growth curves of lactic acid bacteria

由圖3可知，3株菌在0～3 h生長緩慢，為生長延滯期，在3 h后生長迅速，3～12 h為對數(shù)生長期，此時(shí)乳酸菌迅速生長繁殖，在12 h時(shí)OD值達(dá)到高峰并保持相對穩(wěn)定，此時(shí)，活菌數(shù)不再增加，進(jìn)入生長穩(wěn)定期。3株菌均在12 h進(jìn)入對數(shù)生長末期，處于對數(shù)生長期的菌種活性最高，此時(shí)接種可使菌體活性最高，所以種子液培養(yǎng)時(shí)間選擇12 h。

2.3 異型發(fā)酵乳酸菌的發(fā)酵性能

2.3.1 產(chǎn)酸能力

通常，異型發(fā)酵乳酸菌在發(fā)酵過程中的產(chǎn)酸能力不如同型乳酸菌，但是其產(chǎn)酸能力仍然是重要的發(fā)酵性能指標(biāo)，產(chǎn)酸能力強(qiáng)，有利于抑制雜菌的生長，提高產(chǎn)品的安全性[10]。3號(hào)、11號(hào)、12號(hào)3株異型發(fā)酵乳酸菌的產(chǎn)酸能力測定結(jié)果見圖4。

圖4 培養(yǎng)24 h乳酸菌產(chǎn)酸量Fig.4 The acid yield of lactic acid bacteria cultured for 24 hours

由圖4可知，培養(yǎng)24 h后，3株菌的產(chǎn)酸量分別為6.68，6.86，6.81 g/L，是具有較好產(chǎn)酸能力的優(yōu)良菌株。本研究的結(jié)果高于孔彥卓等[11]從豆清發(fā)酵液中分離的高產(chǎn)酸腸膜明串珠菌，其產(chǎn)酸量低于6 g/L。

2.3.2 降解亞硝酸鹽能力

在竹筍腌制的過程中，同其他腌制蔬菜一樣，極易產(chǎn)生亞硝酸鹽，對人體有潛在的危害。長期食用含大量亞硝酸鹽的食品，會(huì)引發(fā)致癌甚至死亡的危險(xiǎn)。使用乳酸菌降解亞硝酸鹽含量具有重要意義[12]。3號(hào)、11號(hào)、12號(hào)亞硝酸鹽降解量見圖5。

圖5 乳酸菌降解亞硝酸鹽能力Fig.5 The degradation ability of lactic acid bacteria on nitrite

由圖5可知，培養(yǎng)液中3株菌亞硝酸鈉剩余量分別為2.55，2.68，1.94 μg/mL，其中12號(hào)菌株的降解能力最強(qiáng)，亞硝酸鹽降解率為79.05%。高于相同培養(yǎng)時(shí)間下孟憲剛等[13]分離得到的乳酸菌亞硝酸鹽降解率(5%～60%)。

2.4 異型乳酸菌產(chǎn)甘露醇的能力

2.4.1 果糖濃度對甘露醇產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的影響

異型乳酸菌通過利用甘露醇脫氫酶將果糖轉(zhuǎn)化為甘露醇等有利的代謝產(chǎn)物，改善風(fēng)味，還能降低食品中糖含量，適于肥胖和糖尿病等人群食用。甘露醇產(chǎn)量和果糖轉(zhuǎn)化率見表1。

表1 甘露醇產(chǎn)量及果糖轉(zhuǎn)化率Table 1 The mannitol yield and fructose conversion rate

由表1可知，果糖濃度從20 g/L到60 g/L，所有分離株的甘露醇產(chǎn)量都有大幅度增加。其中12號(hào)菌株在40 g/L果糖濃度下的甘露醇含量最高(21.90 g/L)，果糖轉(zhuǎn)化率為54.75%。隨著果糖濃度從60 g/L增加到100 g/L，所有菌株的甘露醇產(chǎn)量開始下降，只有12號(hào)菌株在100 g/L果糖濃度下其甘露醇產(chǎn)量超過40 g/L，這說明12號(hào)菌株是比較優(yōu)良的產(chǎn)甘露醇的菌株，后面對其進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

2.4.2 初始pH值對果糖發(fā)酵的影響

12號(hào)菌株在不同初始pH值的培養(yǎng)基中甘露醇產(chǎn)量、總酸、pH值以及乳酸菌總數(shù)見圖6和圖7。

圖6 不同初始pH條件下12號(hào)乳酸菌的pH值及乳酸菌生長計(jì)數(shù)Fig.6 The pH value and growth count of No.12 Lactobacillus under different initial pH values

圖7 不同初始pH條件下12號(hào)乳酸菌的甘露醇及總酸產(chǎn)量Fig.7 The mannitol and total acid yield of No.12 Lactobacillus under different initial pH values

由圖6和圖7可知，在初始pH為5，6，7的條件下，12號(hào)菌株都能利用果糖生產(chǎn)甘露醇，且在pH 5的條件下培養(yǎng)48 h獲得了最高甘露醇產(chǎn)量(22.98 g/L)、最低pH值(4.03)和最高總酸含量(1.31%)。

當(dāng)果糖是唯一的碳源時(shí)，異型乳酸發(fā)酵可將果糖還原為甘露醇，最大理論產(chǎn)率約為67%。12號(hào)菌在初始pH 5的條件下發(fā)酵48 h甘露醇產(chǎn)量最高，為22.98 g/L，其產(chǎn)率達(dá)到57.45%，而在初始pH為6和7時(shí)甘露醇得率分別為55.48%、50.45%，較初始pH為5時(shí)甘露醇得率低，說明適當(dāng)降低初始pH可提高分離株的甘露醇產(chǎn)量。Saha等[14]研究發(fā)現(xiàn)中間乳桿菌產(chǎn)甘露醇的最佳pH值為5。Yue等[15]研究發(fā)現(xiàn)，采用兩段pH控制(即前12 h pH 5.5，其余發(fā)酵時(shí)間pH 4.5)可以提高短乳桿菌的甘露醇產(chǎn)量。

在6.45 log CFU/mL的接種量時(shí)開始發(fā)酵，不同pH條件下培養(yǎng)基中乳酸菌總數(shù)在發(fā)酵前8 h增長迅速，且以初始pH 7的乳酸菌增量最大，在8 h時(shí)達(dá)到9.11 log CFU/mL，說明不同初始pH值可以影響初始乳酸菌數(shù)量的增加[16]。隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，pH降低，乳酸菌含量在8 h后減少。

2.5 乳酸菌16S rDNA基因序列分析

將12號(hào)菌株所得序列在NCBI中進(jìn)行比對，采用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖8。

圖8 基于16S rDNA序列12號(hào)乳酸菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 The phylogenetic tree of No.12 Lactobacillus based on 16S rDNA sequence

Romi Wahengbam等[17]通過對竹筍發(fā)酵進(jìn)行連續(xù)7 d的微生物群落結(jié)構(gòu)和種群動(dòng)態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵早期(1～3 d)存在較多Leuconostoccitreum、Weissellacibaria等異型乳酸菌。由圖8可知，12號(hào)菌株與Leuconostoccitreum聚于一支，同源性均在99%以上，因此被鑒定為檸檬明串珠菌，將12號(hào)菌株命名為檸檬明串珠菌NM-12(LeuconostoccitreumNM-12)。

3 結(jié)論

本研究從自然發(fā)酵酸筍中共分離得到61株乳酸菌，通過復(fù)篩及性能測定，選出一株高產(chǎn)甘露醇乳酸菌，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，該菌株為檸檬明串珠菌，命名為檸檬明串珠菌NM-12(LeuconostoccitreumNM-12)。通過對其發(fā)酵性能測試可知，LeuconostoccitreumNM-12菌株的產(chǎn)酸量為6.81 g/L，亞硝酸鈉降解率為79.05%，在pH 5、果糖含量為40 g/L的條件下30 ℃培養(yǎng)48 h，其甘露醇產(chǎn)量為22.98 g/L，最大果糖轉(zhuǎn)化率為57.45%。