王楷，黃思輝，吳騰飛，肖敏，邱振雄(通信作者)

深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院普外科 (廣東深圳 518000)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

10只雄性5周齡SPF裸鼠，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2016-0002。

1.2 主要試劑及儀器

生酮飼料(江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司)，HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞(納生物技術(shù)有限公司)，TUNEL檢測試劑盒(南通碧云天生物技術(shù)有限公司)，RNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾唯贊生物技術(shù)有限公司)；CFX ConnectTM實(shí)時熒光PCR儀[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]，MF53倒置熒光顯微鏡(廣州市明美光電有限公司)，BQ-318D切片機(jī)(伯納生物技術(shù)有限公司)。

1.3 裸鼠成瘤及藥物處理

對10只雄性SPF裸鼠予以皮下接種HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞(濃度為5×106個/ml，0.2 ml/只)，在瘤體為5 mm后，根據(jù)瘤體大小將裸鼠隨機(jī)分為正常飲食組(對照組)及KD飲食組(KD組)，每組5只，成瘤前兩組均自由進(jìn)食，成瘤5 mm開始對照組自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料，KD組進(jìn)食相等能量的生酮飼料，期間隔天記錄1次兩組的體質(zhì)量變化，于飲食30 d后，處死兩組并測量瘤體組織的大小。

1.4 TUNEL染色

將瘤體組織切片放入65 °C烤箱中烤2 h，然后放置在二甲苯中進(jìn)行脫蠟，隨后將切片依次放入100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇和純化水中各5 min，再將切片移入濕盒中，在每個樣本上滴加50 μg/ml Proteinase K工作液，于37 ℃下反應(yīng)30 min進(jìn)行修復(fù)，然后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)充分洗滌3次，5 min/次，用吸水紙吸掉組織周圍的PBS；在每張玻片上滴加足夠量的脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL)檢測液，于37 °C下避光孵育1 h，然后再用PBS洗滌3次，5 min/次，用吸水紙吸干玻片上的液體，用抗熒光淬滅封片后于熒光顯微鏡下觀察。

1.5 實(shí)時熒光PCR

按照RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行RNA提取操作，所有實(shí)驗用具均經(jīng)0.1%焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水浸泡并經(jīng)高壓滅活，然后進(jìn)行RNA含量測定，即取RNA樣品并加入99 μl DEPC處理水，用紫外分光光度計測260、280 nm光密度(optical density，OD)值，計算OD260/OD280比值，若此值在1.8～2.0之間，則認(rèn)為制備的RNA較純，隨后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA反應(yīng)；設(shè)計基因特異性引物，釆用20 μl反應(yīng)體系，盡量在避光條件下加入所需成分，充分混勻，并使所有試劑沉積于管底，隨后應(yīng)用CFX ConnectTM實(shí)時熒光PCR儀進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增及檢測。引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成，序列見表1。

表1 引物名稱及序列

1.6 Western Blot免疫印跡法檢測

將瘤體組織研磨成漿后，加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液于冰上裂解30 min，期間每隔5 min劇烈震蕩30 s，共震蕩150 s，然后經(jīng)高速離心機(jī)以12 000 r/min離心10 min，收集上清液到EP管中，于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫徊捎肂CA檢測試劑盒(Bicinchoninic acid Protein Assay Kit)測定蛋白濃度并定量，隨后將蛋白與上樣緩沖液以1︰3的比例混勻，并煮沸變性；配制好5%濃縮膠、10%分離膠，加入電泳緩沖液，拔出梳子，從左至右依次加入各組別的30 μg蛋白樣品，以60 V、300 mA電泳至樣品到分離膠，后改為以120 V、200 mA電泳至溴芬蘭到分離膠最下沿；取出分離膠，并按照海綿墊—三層濾紙—膠—聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF膜)—三層濾紙—海綿墊的順序夾好濕法轉(zhuǎn)膜1 h；以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別加入B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X(Bcl-2-associated X，Bax)蛋白抗體(1︰1 000)和GAPDH抗體(1︰1 000)，在4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜后，經(jīng)三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽+吐溫(Tris-HCl+Tween，TBST)緩沖液漂洗3次，分別加入山羊抗兔或鼠IgG二抗(1︰5 000)，室溫孵育1 h，再次經(jīng)TBST緩沖液漂洗3次，于暗室中，在膜上滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液(enhanced chemiluminescence，ECL)顯影。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 KD對裸鼠結(jié)腸癌皮下成瘤的影響

KD組的瘤體重量稍高于對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

注：*表示與對照組比較，P>0.05圖1 KD對裸鼠結(jié)腸癌皮下成瘤的影響

2.2 KD對裸鼠結(jié)腸癌皮下成瘤細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果顯示，KD組細(xì)胞凋亡率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 KD對裸鼠結(jié)腸癌皮下瘤組織中Caspase3和Caspase9 mRNA及Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

實(shí)時熒光PCR結(jié)果顯示，KD組Caspase3和Caspase9 mRNA表達(dá)水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。Western Blot結(jié)果顯示，KD組Bax蛋白表達(dá)水平高于對照組，Bcl-2蛋白表達(dá)水平低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

注：*表示與對照組比較，P<0.05；DAPI為4',6-二脒基-2-苯基吲哚，Apoptosis為細(xì)胞凋亡，Merge為融合圖2 TUNEL染色檢測KD對裸鼠結(jié)腸癌皮下成瘤細(xì)胞凋亡的影響

注：*表示與對照組比較，P<0.05；Caspase為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶圖3 兩組瘤體組織中Caspase3和Caspase9 mRNA表達(dá)水平的測定

注：*表示與對照組比較，P<0.05；GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，Bcl-2為B淋巴細(xì)胞瘤-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X圖4 兩組瘤體組織中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的測定

3 討論

本研究將人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞接種到雄性裸鼠皮下，制備裸鼠結(jié)腸癌移植瘤模型，并對裸鼠予以KD干預(yù)，結(jié)果顯示，干預(yù)后，KD組的瘤體重量雖高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明KD干預(yù)可延緩結(jié)腸癌瘤體的生長，與Hao等[9]的研究結(jié)果相似。進(jìn)一步的TUNEL染色結(jié)果表明，KD可促進(jìn)瘤體凋亡，且有研究發(fā)現(xiàn)，KD過程中的中間代謝產(chǎn)物β-羥丁酸可抑制HT29、Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞及C57BL-6小鼠的mTOR信號通路，并上調(diào)腸細(xì)胞中腸特異性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，繼而維持小鼠的腸道穩(wěn)態(tài)[16-17]，由此表明，KD干預(yù)可延緩結(jié)腸癌細(xì)胞皮下移植瘤瘤體生長并誘導(dǎo)瘤體凋亡，改善瘤體病理變化。Bcl-2、Bax為Bcl-2細(xì)胞凋亡家族的成員，兩者相互作用，將信號傳代給Caspase家族并誘導(dǎo)級聯(lián)放大，使細(xì)胞凋亡，因此，通過調(diào)控上述蛋白的表達(dá)，可影響腫瘤細(xì)胞的存活。本研究結(jié)果亦證實(shí)了KD可通過調(diào)控Caspase3和Caspase9 mRNA及Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)，繼而促進(jìn)結(jié)腸癌瘤體凋亡。

綜上所述，KD可抑制裸鼠結(jié)腸癌移植瘤生長，其是通過提高Caspase3和Caspase9 mRNA及Bax蛋白表達(dá)水平、降低Bcl-2蛋白表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的。