王國紅，李丹林，朱柏潤，馬懷良，穆 燕，律鳳霞，姜 明

（牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157012）

黑木耳（Auricularia auricula）又稱木耳、黑菜、樹雞等，屬真菌界擔(dān)子菌門木耳目木耳科木耳屬，是1種藥食兩用的大型真菌。黑木耳栽培區(qū)域分布較廣，在東北地區(qū)、貴州、云南、福建等地均有栽培［1］，中國黑木耳產(chǎn)量占全世界96%以上［2］。黑木耳營養(yǎng)價(jià)值高，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖等活性物質(zhì)，具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤、抑菌、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等作用［3-5］。黑木耳子實(shí)體中的黑色素是黑木耳特有的功能性物質(zhì)之一，在抗氧化、抗病毒、抗輻射、免疫調(diào)節(jié)和DNA保護(hù)方面發(fā)揮著重要生理功能［6，7］，可作為食品添加劑［8］、生物農(nóng)藥的保護(hù)劑［9］、防曬霜和染發(fā)劑［10］。近年來，黑木耳大棚吊袋栽培模式日益增多，產(chǎn)量也得到了提升，但是子實(shí)體黑色素少、顏色偏淡、商品性能較差，制約了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，在分子水平上研究黑木耳黑色素的合成途徑、表達(dá)、調(diào)控等機(jī)制具有重要意義。

多巴色素異構(gòu)酶（Dopachrome tautomerase，DCT）是酪氨酸酶合成家族成員之一，也是黑色素合成途徑中的重要限速酶。DCT有1個(gè)類似表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）的結(jié)構(gòu)域和2個(gè)富含組氨酸的金屬結(jié)合位點(diǎn)［11］。在黑色素合成的第2階段，DCT通過調(diào)節(jié)多巴色素向5，6-二羥基吲哚或5，6-二羥基吲哚羧酸的轉(zhuǎn)化形成真黑色素，當(dāng)DCT缺乏或不足時(shí)，將影響黑色素的代謝［12］。

盡管黑木耳全基因組測序已完成，還有相當(dāng)多的基因沒有明確的功能注釋信息。目前，關(guān)于黑木耳多巴色素異構(gòu)酶基因的研究較少，本研究克隆了多巴色素異構(gòu)酶基因，并通過生物信息學(xué)對多巴色素異構(gòu)酶基因的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行了預(yù)測分析，旨在為進(jìn)一步探究多巴色素異構(gòu)酶基因功能和黑色素代謝途徑提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

黑木耳菌Mn150、克隆載體pEGM-T試劑盒，購自Promega Corporation公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備；DNA提取試劑盒和普通DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒，購自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化和菌絲培養(yǎng) 將黑木耳菌Mn150接種在PDA固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)7 d后，挑取新鮮的菌絲再次接種到PDA液體培養(yǎng)基中，28℃165 r/min條件下培養(yǎng)7 d。

1.2.2 多巴色素異構(gòu)酶基因的克隆 ①引物設(shè)計(jì)。通過Primer Premier5設(shè)計(jì)DCT基因的特異性引物，引物為AuTau-F（5′—3′）：ATGCCAACTCTCGTCCTCAC；AuTau-R（5′—3′）：TTACTTCCCAAAGATTGTGG。②黑木耳菌DNA的提取及PCR擴(kuò)增。將菌液過濾，收集菌絲，吸去多余的水分，采用普通DNA提取試劑盒提取DNA，通過PCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20μL：ddH2O 6μL，2×Taq plus MasterMix 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA模板2μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，35次循環(huán)，72℃20 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，再用DNA純化回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。③連接反應(yīng)與遺傳轉(zhuǎn)化。將純化的PCR產(chǎn)物與載體連接，室溫1 h后再轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。10μL連接液加入到100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30 min，42℃熱激90 s，加入500μL LB液體培養(yǎng)基，37℃220 r/min振蕩培養(yǎng)45 min，再加入12μL IPTG，混勻。取100μL涂在含Amp、X-gal的LB固體平板培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)12～16 h。④陽性克隆的篩選和檢測。在LB平板上挑取10個(gè)白色單菌落，接種至含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃220 r/min振蕩培養(yǎng)5 h。以菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，PCR反應(yīng)體系為20μL：ddH2O 7μL，2×Taq plus MasterMix 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，菌液模板1μL，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃3 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，30次循環(huán)，72℃5 min。陽性菌液送哈爾濱擎科生物公司測序。

1.2.3 多巴色素異構(gòu)酶基因的生物信息學(xué)分析 利用在線軟件ExPASy Translate將測序驗(yàn)證后的多巴色素異構(gòu)酶基因的核酸序列翻譯為氨基酸序列，然后進(jìn)行生物信息學(xué)分析。運(yùn)用在線軟件ExPASy protparm tool分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；ExPASy ProtScale分析親水性與疏水性；運(yùn)用NCBI Conserved Domains search分析保守區(qū)和蛋白家族；利用在線軟件Signal P4.0 Server預(yù)測信號肽；運(yùn)用在線軟件TMHMM Server V2.0進(jìn)行跨膜區(qū)分析；利用SOPMA在線軟件預(yù)測分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳菌Mn150液體培養(yǎng)

黑木耳菌Mn150接種在PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)7 d后，產(chǎn)生大量菌絲球（圖1），過濾收集菌球，提取DNA。

圖1 黑木耳菌株Mn150液體培養(yǎng)

2.2 黑木耳菌絲DNA的提取

通過PDA液體培養(yǎng)，收集菌絲，利用普通DNA提取試劑盒提取黑木耳菌絲DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示條帶整齊、清晰，沒有拖尾和彌散現(xiàn)象（圖2）。這說明提取的DNA質(zhì)量較好，基本沒有降解，可用于PCR擴(kuò)增。

圖2 黑木耳DNA電泳結(jié)果

2.3 多巴色素異構(gòu)酶基因的克隆

以提取的DNA為模板，AuTau-F和AuTau-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得與目的條帶一致的特異性條帶，大小為625 bp（圖3）。PCR產(chǎn)物經(jīng)普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒回收后與pGEM-T Easy Vector載體連接，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得與目的條帶一致的特異性條帶，結(jié)果如圖4所示。將陽性菌液送哈爾濱擎科生物公司測序，獲得序列長度為625 bp。測序結(jié)果進(jìn)行序列比對，去除內(nèi)含子，獲得大小為355 bp的外顯子序列，之后進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖4 菌液PCR驗(yàn)證

2.4 多巴色素異構(gòu)酶基因的生物信息學(xué)分析

2.4.1 DCT理化性質(zhì)分析 運(yùn)用在線軟件ExPASy protparm tool分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，DCT蛋白由112個(gè)氨基酸殘基組成，分子式為C584H921N181O153S4，原子總數(shù)為1 843個(gè)，分子質(zhì)量為13.05 kDa，帶正電荷的氨基酸殘基有19個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基有10個(gè)，等電點(diǎn)為10.35，不穩(wěn)定系數(shù)為47.63，脂肪系數(shù)是80.80，總平均親水系數(shù)為-0.577，為親水蛋白。

2.4.2 DCT親水性與疏水性分析 為后期蛋白純化、表達(dá)研究提供參考，利用ExPASy ProtScale軟件對DCT蛋白的親、疏水性進(jìn)行了分析［13］，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，該蛋白第96位氨基酸處疏水性最強(qiáng)，得分為1.222；第65位氨基酸親水性最強(qiáng)，得分為-2.789；大部分氨基酸得分在0以下，說明DCT蛋白是親水性蛋白。

圖5 DCT蛋白親、疏水性預(yù)測

2.4.3 保守區(qū)和蛋白家族預(yù)測 通過對DCT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和蛋白家族預(yù)測（圖6），發(fā)現(xiàn)該蛋白的氨基酸序列含有1個(gè)4-Oxalocrotonate Tautomerase Superfamily保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是互變異構(gòu)酶超家族中的成員，說明DCT屬于4-Oxalocrotonate Tautomerase Superfamily基因家族。

圖6 DCT蛋白保守區(qū)和蛋白家族預(yù)測

2.4.4 信號肽預(yù)測 信號肽是引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈，位于分泌蛋白的N端，由16～26個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，包括疏水核心區(qū)、信號肽N末端和C末端3個(gè)區(qū)，各個(gè)區(qū)發(fā)揮不同的功能［14］。通過對DCT蛋白信號肽預(yù)測發(fā)現(xiàn)，DCT蛋白沒有信號肽（圖7）。

圖7 DCT蛋白信號肽預(yù)測

2.4.5 跨膜區(qū)預(yù)測 膜蛋白包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)?？缒^(qū)的主要作用是把膜蛋白固定在細(xì)胞膜上。經(jīng)TMHMM Server V2.0在線軟件進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測分析，結(jié)果表明DCT蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)，說明該蛋白不是跨膜蛋白（圖8）。

圖8 DCT蛋白跨膜區(qū)預(yù)測

2.4.6 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)指多肽鏈盤旋或折疊形成特定的空間結(jié)構(gòu)，包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲。利用SOPMA在線軟件對DCT蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白由20.54%的α-螺旋、5.36%的β-折疊、54.46%的無規(guī)卷曲和19.64%延伸鏈組成（圖9）。

圖9 DCT蛋白的二級結(jié)構(gòu)

3 小結(jié)與討論

酪氨酸酶家族相關(guān)基因包括酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1、多巴色素異構(gòu)酶，這3個(gè)成員在黑色素合成過程中具有不同的作用，共同決定黑色素的生物合成［15，16］。在黑色素合成途徑中，DCT是酪氨酸酶催化位點(diǎn)的下游的1個(gè)重要的調(diào)節(jié)酶，對黑色素的生物合成具有重要作用。研究黑木耳DCT對黑色素的合成具有較高的價(jià)值，通過對多巴色素異構(gòu)酶的調(diào)控，可以控制黑色素的產(chǎn)量，發(fā)揮黑木耳黑色素在抗氧化、抗病毒以及提高免疫力等方面的生物活性。除此之外，也可以拓展黑木耳黑色素在食品方面的應(yīng)用。目前，生物信息學(xué)分析主要針對目的基因的理化性質(zhì)分析、親疏水性分析、結(jié)構(gòu)域預(yù)測、基因家族和二級、三級結(jié)構(gòu)等方面［17］。生物信息學(xué)的發(fā)展為功能基因組學(xué)提供了有利的研究手段，通過生物信息學(xué)分析方法對克隆基因進(jìn)行功能預(yù)測能達(dá)到較好的效果。

本研究以黑木耳DNA為模板，克隆DCT基因，進(jìn)行測序，測序結(jié)果進(jìn)行序列比對，去除內(nèi)含子，獲得了大小為355 bp的外顯子序列。通過對DCT基因的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，DCT基因由112個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量為13.05 kDa，等電點(diǎn)為10.35，為親水性蛋白。該蛋白的氨基酸序列含有1個(gè)4-Oxalocrotonate Tautomerase Superfamily保守結(jié)構(gòu)域，DCT蛋白沒有信號肽，不含跨膜結(jié)構(gòu)。該蛋白由20.54%的α-螺旋、5.36%的β-折疊、54.46%的無規(guī)卷曲和19.64%延伸鏈組成。該結(jié)果可為DCT基因相關(guān)性質(zhì)和功能研究提供參考。