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        活化條件對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶酶活的影響

        2012-12-03 05:45:10趙國(guó)群周雪艷胡弢
        食品研究與開發(fā) 2012年10期
        關(guān)鍵詞:影響

        趙國(guó)群,周雪艷,胡弢

        (河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北 石家莊 050018)

        果葡糖漿是一種新發(fā)展起來(lái)的淀粉糖品,其糖分組成主要是果糖和葡萄糖。果葡糖漿具有甜度高,風(fēng)味好,發(fā)熱量低,溶解度高,滲透壓大等特點(diǎn),是蔗糖的很好代用品,因而廣泛應(yīng)用于食品工業(yè),尤其是軟飲料工業(yè)[1-2]。工業(yè)上生產(chǎn)果葡糖漿一般采用玉米淀粉為原料,先經(jīng)過(guò)雙酶液化,糖化,轉(zhuǎn)化為葡萄糖溶液,然后采用固定化葡萄糖異構(gòu)酶進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng),得到果糖和葡萄糖的混合液即果葡糖漿,再經(jīng)脫色,樹脂處理,蒸發(fā)濃縮,得到42%的果葡糖漿[3]。為了方便儲(chǔ)運(yùn)及較高的穩(wěn)定性,固定化葡萄糖異構(gòu)酶的商品形態(tài)為干燥的顆粒,其中只含極少量的水,因此酶顆粒使用前需進(jìn)行活化(水化)。活化過(guò)程就是用底物(葡萄糖漿)來(lái)使酶顆粒吸收水分,從而使酶發(fā)揮其催化功效[4]。關(guān)于葡萄糖異構(gòu)酶的固定化方法、穩(wěn)定性和葡萄糖異構(gòu)化的研究很多,但是關(guān)于固定化葡萄糖異構(gòu)酶活化的研究卻尚未見報(bào)道[5-7]。本文對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的最佳活化條件進(jìn)行了研究,以期提高活化后的酶活,進(jìn)而提高葡萄糖異構(gòu)為果糖的生產(chǎn)效率。

        1 材料與方法

        1.1 主要材料

        GENSWEETTMIGI-SA固定化葡萄糖異構(gòu)酶(簡(jiǎn)稱異構(gòu)酶):無(wú)錫杰能科生物制品有限公司產(chǎn)品,粒徑300~1200 μm,淺棕黃色;葡萄糖:石家莊華營(yíng)葡萄糖有限公司。

        1.2 主要儀器

        1100型高效液相色譜儀:安捷倫。

        1.3 方法

        1.3.1 活化時(shí)間對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響

        配制濃度為30%的葡萄糖溶液100 mL,用0.2 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH到7.5。取6支試管,每支試管中加入0.2 g異構(gòu)酶和5 mL所配制的葡萄糖溶液,然后將試管置于40℃水浴鍋中分別浸泡(活化)0、1、2、3、4、5h。傾倒、瀝干糖液,測(cè)定酶活。

        1.3.2 糖液濃度對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響

        分別配制濃度為 30%、40%、50%、60%、70%(W/V)的葡萄糖溶液100 mL,用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH到7.5。取5支試管,每支試管中加入0.2 g異構(gòu)酶和5 mL所配制的葡萄糖溶液。將試管置于40℃水浴鍋中活化4 h。傾倒、瀝干糖液。

        1.3.3 溫度對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響

        配制濃度為60%的葡萄糖溶液100mL,用0.2mol/L NaOH溶液調(diào)pH到7.5。取5支試管,每支試管中加入0.2g異構(gòu)酶和5mL所配制的葡萄糖溶液,分別在25℃、35℃、45℃、55℃、70℃水浴鍋中活化4 h。

        1.3.4 糖液pH值對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響

        分別將60%葡萄糖溶液的pH調(diào)整為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。取5支試管,每支試管中加入0.2 g異構(gòu)酶和5 mL所配制的葡萄糖溶液,然后將試管置于55℃水浴鍋中活化4 h。

        1.3.5 金屬離子對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響

        配制濃度為60%的糖液400 mL,用NaOH溶液調(diào)pH到7.5,并均分到5個(gè)燒杯中,然后分別添加MgSO4、CoSO4、ZnSO4、MnSO4,配制成 1.0 mmol/L 的葡萄糖液。取4支試管,每支試管中加入0.2 g異構(gòu)酶和5 mL配制好的含金屬離子葡萄糖溶液,然后將試管置于55℃水浴鍋中活化4 h。

        1.4 分析方法

        1.4.1 果糖含量的測(cè)定

        本試驗(yàn)采用高效液相色譜法來(lái)測(cè)定果葡糖漿中果糖的含量。其檢測(cè)條件為:Waters Sugar-Park色譜柱,示差折光檢測(cè)器,流速0.5 mL/min,溫度70℃,流動(dòng)相純水,流速0.5 mL/min,進(jìn)樣量20.0 μL。

        1.4.2 固定化葡萄糖異構(gòu)酶酶活的測(cè)定

        本試驗(yàn)按照GB 8274-87(固定化葡萄糖異構(gòu)酶制劑)中所示的方法測(cè)定葡萄糖異構(gòu)酶的酶活。0.2 g固定化葡萄糖異構(gòu)酶在葡萄糖溶液活化之后,傾倒、瀝干糖液,加磷酸緩沖液1.5 mL,硫酸鎂溶液0.5 mL,葡萄糖溶液1.5 mL,再加去離子水定容至5 mL,70℃反應(yīng)1 h,加高氯酸溶液5 mL終止反應(yīng),用高效液相法測(cè)定其中果糖含量。異構(gòu)酶的酶活力定義為:在pH為7.5,溫度為70℃的條件下,每小時(shí)生成1 mg果糖所需的最小酶量為1個(gè)酶活力單位。

        異構(gòu)酶酶活(U/g)=果糖濃度(mg/mL)×稀釋倍數(shù)×10(mL)÷ 酶質(zhì)量(g)

        2 結(jié)果與討論

        2.1 活化時(shí)間的影響

        將固定化葡萄糖異構(gòu)酶浸泡在30%葡萄糖溶液(40℃)中進(jìn)行活化,控制不同的活化時(shí)間,然后測(cè)定其酶活,結(jié)果見圖1。

        圖1 活化時(shí)間對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響Fig.1 Effect of activation time on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

        從圖1中發(fā)現(xiàn),活化1 h的異構(gòu)酶酶活卻明顯低于未經(jīng)過(guò)活化的異構(gòu)酶。隨著活化時(shí)間的延長(zhǎng),異構(gòu)酶酶活逐漸提高。當(dāng)活化時(shí)間為4 h時(shí),其酶活達(dá)到最高,為720.3 U/g。然而,當(dāng)活化時(shí)間延長(zhǎng)到5 h時(shí),異構(gòu)酶酶活又顯著下降,低于未經(jīng)過(guò)活化的異構(gòu)酶。為了方便儲(chǔ)存和運(yùn)輸,異構(gòu)酶固定化后被生產(chǎn)為干態(tài)。在干燥過(guò)程中,異構(gòu)酶因失水而發(fā)生空間構(gòu)象的變化,進(jìn)而影響其酶活。在葡萄糖溶液中進(jìn)行活化時(shí),異構(gòu)酶的空間構(gòu)象趨于恢復(fù)原態(tài),其恢復(fù)的程度可能與活化時(shí)間、活化溫度、糖液濃度等有關(guān),也可能與固定化時(shí)使用的固定載體有關(guān)?;蛟S正是這些影響因素不恰當(dāng)組合,使得活化后的異構(gòu)酶空間構(gòu)象恢復(fù)的不理想或最佳空間構(gòu)象未能長(zhǎng)時(shí)間保持,從而活化時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)均造成異構(gòu)酶酶活降低。

        2.2 糖液濃度的影響

        在果葡糖漿的生產(chǎn)上,通常使用40%~50%的葡萄糖漿(純度93%)進(jìn)行活化[4]??紤]到果葡糖漿的實(shí)際生產(chǎn),本試驗(yàn)采用的活化介質(zhì)為葡萄糖溶液。將固定化葡萄糖異構(gòu)酶分別在30%、40%、50%、60%、70%(W/V)的葡萄糖溶液中40℃下活化4h,試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

        圖2 糖液濃度對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響Fig.2 Effect of syrup concentration on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

        如圖2所示,糖液濃度對(duì)異構(gòu)酶酶活有著顯著的影響。當(dāng)糖液濃度為60%時(shí),異構(gòu)酶酶活最高,達(dá)到了811 U/g,同40%葡萄糖溶液的相比,異構(gòu)酶酶活提高了233 U/g。

        2.3 活化溫度的影響

        異構(gòu)酶固定化后,耐溫性增強(qiáng),但當(dāng)溫度超過(guò)70℃時(shí)仍容易變性失活,從而導(dǎo)致酶活降低。因此,生產(chǎn)商建議的活化溫度為25℃~55℃,見圖3。

        圖3 活化溫度對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響Fig.3 Effect of temperature on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

        如圖3所示,在25℃~55℃范圍內(nèi),隨著糖液活化溫度的升高,異構(gòu)酶酶活逐漸增加。當(dāng)活化溫度為55℃時(shí),活化后的酶活最高,達(dá)815 U/g,同25℃相比,異構(gòu)酶酶活增加了251.8 U/g。當(dāng)活化溫度超過(guò)55℃時(shí),異構(gòu)酶酶活明顯下降。根據(jù)此試驗(yàn)結(jié)果,在實(shí)際生產(chǎn)中選擇適宜的活化溫度對(duì)提高異構(gòu)酶酶活很重要。

        2.4 糖液pH值對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響

        根據(jù)來(lái)源不同,異構(gòu)酶的最適pH有所差異,一般糖異構(gòu)酶的最適pH在6.5~8.5,見圖4。

        圖4 pH對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響Fig.4 Effect of syrup pH on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

        由圖4可見,當(dāng)糖液pH從6.5升高7.5時(shí),異構(gòu)酶酶活逐漸升高。pH7.5與pH8.0的酶活基本相同。但在堿性條件下高溫(60℃)會(huì)使葡萄糖糖漿的顏色加深,所以糖液pH宜選定為7.5。

        2.5 金屬離子對(duì)酶活的影響

        葡萄糖異構(gòu)酶是金屬酶。在葡萄糖異構(gòu)化為果糖時(shí),Mg2+、Co2+、Mn2+等對(duì)該酶有激活作用,而 Ca2+、Hg2+、Cu2+等則起抑制作用[8-9]。那么在異構(gòu)酶活化時(shí)是否也需加入金屬離子呢?為了考察金屬離子在異構(gòu)酶活化時(shí)的影響,在60%葡萄糖溶液中分別添加1.0 mmol/L的 MgSO4、CoSO4、ZnSO4、MnSO4,然后 55 ℃下活化 4 h,試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

        圖5 金屬離子對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響Fig.5 Effect of metal ions on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

        由圖5可見,同未加任何金屬離子的對(duì)照相比,異構(gòu)酶活化時(shí)添加 Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+不但沒(méi)有使酶活升高,反而明顯降低了酶活。這說(shuō)明Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+在活化時(shí)均起抑制作用。造成這種想象的原因不清楚?;蛟S是活化時(shí)添加的金屬離子干擾了異構(gòu)酶水化過(guò)程中最佳空間構(gòu)象的恢復(fù),從而造成酶活的降低。

        3 結(jié)論

        葡萄糖異構(gòu)酶是果葡糖漿生產(chǎn)中的一個(gè)關(guān)鍵酶,其酶活的高低直接影響著生產(chǎn)效率和生產(chǎn)成本。本試驗(yàn)以果葡糖漿生產(chǎn)上普遍使用的GENSWEETTMIGISA固定化葡萄糖異構(gòu)酶為研究對(duì)象,研究了活化條件對(duì)其酶活的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明活化條件對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶酶活有著非常顯著的影響。GENSWEETTMIGI-SA固定化葡萄糖異構(gòu)酶的適宜活化條件為:葡萄糖液濃度60%、溫度55℃、pH 7.5、時(shí)間4 h。經(jīng)此條件活化之后,其酶活達(dá)815 U/g,同常規(guī)活化條件(例如,葡萄糖液濃度40%、溫度40℃、pH 7.0、時(shí)間 4 h)相比,異構(gòu)酶酶活提高了40%以上。此外,還發(fā)現(xiàn)活化時(shí)添加 Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+不但沒(méi)有使酶活升高,反而明顯降低了酶活。因此,在固定化葡萄糖異構(gòu)酶活化時(shí)不適宜加入Mg2+等金屬離子。

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