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        牛奶中煙酸本底含量的測定

        2012-12-03 05:45:16劉志楠李海礁宋曉東葉峰喻東威解鑫
        食品研究與開發(fā) 2012年10期
        關鍵詞:標準檢測

        劉志楠,李海礁,宋曉東,葉峰,喻東威,解鑫

        (內蒙古蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司質量安全管理中心分析中心,內蒙古 呼和浩特 011500)

        牛奶是天然的全營養(yǎng)物質,其微量元素的含量比較全面。早在1867年人們就在實驗室中合成了煙酸,而其真正得到發(fā)展是始于20世紀30年代,1937年C.A.Elvehijiem等分離出煙酸,不久又在肝臟中獲得煙酞胺[1],一時間作為醫(yī)藥產品得到了迅速發(fā)展,新的用途被不斷的開發(fā)出來,其應用領域筱蓋醫(yī)藥、食品、飼料添加劑及化工助劑等行業(yè)。煙酸即3—毗吮甲酸,又名尼可丁酸,是結構最簡單、理化性質最穩(wěn)定的一種維生素,是人體和動物中不可缺少的營養(yǎng)成分,它參與組織的氧化還原過程,具有促進細胞新陳代謝和擴張血管的功能,能促進人體和動物的生長發(fā)育[2-3]。煙酸不僅參與細胞內呼吸過程而且在VB6、泛酸和生物素的存在下還參與脂肪蛋白質和DNA的合成[4-5],因此煙酸對人體有著重要的生理功能[6]。

        關于水溶性維生素的檢測,以往文獻報道的方法主要包括微生物、高效液相法、酶法和免疫法等[7-8],依據國標的方法,我們采用高效液相色譜法和微生物法對牛奶中的煙酸進行檢測。但國內文獻對牛奶中煙酸本底含量的相關報道卻很少。針對這種現象,我們選取410份中國各地的牛奶樣本進行大量的實驗,意在得出牛奶中煙酸含量的大致范圍,以指導乳制品企業(yè)在合理范圍內強化煙酸的添加量。本研究參考了AOAC[9]的方法,并使用煙酸檢測試劑盒[10]使微生物檢測煙酸的方法有較大程度的優(yōu)化,使檢測時間有較大幅度的縮短。

        為了評價食品標簽上標注成分的準確性。美國食品和藥物管理局FDA規(guī)定維生素在食品中的實際添加量必須為標簽上標注量的100%或更多,而原生維生素產品中的維生素含量必須為標簽上標注量80%或更多。European Directive2002/46/EC也制定了一系列法規(guī),用于檢測添加過維生素的食品中標注的維生素含量[11]。2010年我國針對乳制品食品安全體系存在的一些列問題作出了相應的規(guī)定,出臺了最新國家標準作為檢測乳品中各種營養(yǎng)素的國家強制性檢測標準,國標GB5413-2010[12]《食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測定》對嬰幼兒配方食品與奶粉中維生素含量的檢測方法、檢測限度、適用范圍等都做了明確的規(guī)定。作為乳品企業(yè)而言,產品必須符合國家的標準才可以出廠,其次了解煙酸的大致范圍可以給企業(yè)帶來新的利潤增長點。

        牛奶屬于動物源性食品,牛奶中煙酸的含量受飼料、季節(jié)、環(huán)境、種群和牛個體差異的影響較大,所以數據會在一定的范圍內浮動。

        1 材料與方法

        1.1 高效液相色譜法

        1.1.1 材料

        中國各地的牛奶樣本。

        1.1.2 試劑及設備

        淀粉酶:酶活力≥25 nkat/mg;鹽酸;氫氧化鈉;鹽酸(2.4 mol/L):準確移取10 mL鹽酸于50 mL容量瓶中,用水定容;氫氧化鈉溶液(2.5 mol/L):稱取5.0 g氫氧化鈉于50 mL容量瓶中,用水定容;高氯酸(HClO4):體積分數為60%;甲醇(CH4O):色譜純;異丙醇(C3H8O):色譜純;庚烷磺酸鈉(C7H15NaO3S):優(yōu)級純。

        U3000高效液相色譜儀(帶紫外檢測器):美國UltiMate;pH計(精度為0.01,型號為S40+電導率模塊)、天平(感量為 0.1 mg,型號為 XS204):瑞士mettler;E100H超聲波振蕩器:Elmasonic;培養(yǎng)箱(30℃~80℃,型號為Frioce11222):德國MMM。

        1.1.3 方法

        試樣經熱水提取、酸性沉淀蛋白質后,以C18色譜柱分離,用紫外檢測器定量。

        1.1.4 前處理

        稱取混合均勻固體試樣約5.0 g(精確到0.0001 g)加入約25 mL 45℃~50℃的水,或稱取混合均勻液體試樣約20.0 g(精確到0.0001 g)于150 mL錐形瓶中,振搖,靜置5 min~10 min,充分溶解,并冷卻至室溫。將上述錐形瓶置于超聲波振蕩器中振蕩約10 min。

        1.1.5 測定液的制備

        待試樣溶液降至室溫后,用鹽酸調節(jié)試樣溶液的pH至1.7±0.1,放置約2 min后,再用氫氧化鈉溶液調節(jié)試樣溶液的pH至4.5±0.1。將試樣溶液轉至50 mL容量瓶中,用水反復沖洗錐形瓶,洗液合并于50 mL容量瓶中,用水定容至刻度,混勻后經濾紙過濾,濾液再經0.45 μm微孔濾膜加壓過濾,用試管收集,即為試樣待測液。

        1.1.6 參考色譜條件

        色譜柱:C18柱(粒徑 5 μm,150 mm×4.6 mm)或具有同等性能的色譜柱。

        流動相:甲醇70mL,異丙醇20mL,庚烷磺酸鈉1g,用910mL水溶解并混勻后,用高氯酸調pH至2.1±0.1,經0.45 μm膜過濾。

        流速:1.0 mL/min。檢測波長:261 nm。柱溫:25℃。進樣量:10 μL。

        1.1.7 標準品配制

        煙酸及煙酰胺標準儲備液(1.0 mg/mL):稱取煙酸及煙酰胺標準品各0.1 g(精確到0.0001 g),分別置于100 mL容量瓶中,用水溶解定容。

        煙酸及煙酰胺混合標準中間液(40μg/mL):分別準確吸取煙酸及煙酰胺標準儲備液2 mL至50 mL定量瓶中,用水定容,臨用前配制。煙酸及煙酰胺混合標準系列測定液:分別準確吸取煙酸及煙酰胺混合標準中間液 0.0、1.0、2.0、5.0、10.0 mL,至 50 mL 容量瓶中用水定容。該標準系列濃度分別為0.00、0.80、1.60、4.00、8.00μg/mL。臨用前配制。

        1.1.8 試樣溶液的測定

        將試樣待測液進行色譜測定。記錄各組分色譜峰面積或峰高,根據標準曲線計算出試樣待測液中煙酸及煙酰胺各組分的濃度。

        1.2 微生物法

        1.2.1 材料

        中國各地的牛奶樣本。

        1.2.2 試劑及設備

        煙酸檢測試劑盒:德國ifp公司;Elx808酶標儀(630 nm):美國Biotek;AIR TECH超凈臺:蘇州安泰公司;微量可調移液器(100μL~1000μL、20μL~200μL):德國 Eppendorf;一次性無菌濾膜(0.2 μm~0.22 μm);5 mL一次性無菌注射器;15 mL無菌離心管;1.5 mL~2.0 mL無菌離心管。

        1.2.3 菌種

        植物乳酸桿菌 Lactobacillus plantarum(ATCC 8014)。

        1.2.4 方法

        某些菌體生長對某種特定維生素具有較強的依賴性。配制選擇性的培養(yǎng)基,即含有菌體生長除待測維生素以外的所有營養(yǎng)元素,待測維生素添加的多少直接影響菌體的生長情況。通過添加不同濃度的待檢測維生素作為標注曲線,就可以半定量判定樣品中的特定維生素的含量,最后通過細菌生長的濁度顯示出來,因此根據標準曲線法通過測定的濁度來得出樣品中的煙酸含量[13]。

        1.2.5 前處理

        取1 mL樣品至50 mL離心管中,準確加入雙蒸水39 mL,漩渦混勻。在超凈臺中用 0.2 μm~0.22 μm 無菌濾膜過濾至1.5 mL~2.0 mL無菌心管中。

        1.2.6 培養(yǎng)基制備

        加入10 mL無菌水至維生素培養(yǎng)基中,蓋好瓶蓋,搖勻。在90℃~100℃水浴中加熱5 min以上,其間振蕩至少2次,迅速冷卻至室溫(低于30℃)。使用0.2 μm~0.22 μm無菌濾膜過濾培養(yǎng)基至15 mL無菌離心管中。

        1.2.7 標準品配制

        煙酸標準品用無菌水配置成不同的濃度梯度(0、0.016、0.032、0.064、0.096、0.160 mg/100 g),在 630 nm處測定吸光度,以吸光度為縱坐標,標品濃度為橫坐標,繪制標準曲線。

        1.2.8 檢測步驟

        將菌體包被于微孔中,取出需要數量的微孔板條并在板上固定,未使用的微孔板條立即放回原來的箔袋中,并與干燥劑一起重新封好,儲存在2℃~8℃條件下;用移液器吸取150 μL待檢維生素培養(yǎng)基至微孔中;用移液器吸取150 μL標準品或樣品至指定的微孔中;用粘合箔蓋住微孔條或微孔;在(37±1)℃黑暗條件下孵育44 h~48 h。

        1.2.9 測量及計算

        將微孔板漩渦混勻,用酶標儀630 nm條件下讀取濁度。使用維生素專用軟件進行計算(4P法)。

        2 結果

        2.1 煙酸標準曲線和色譜圖

        微生物法煙酸標準曲線,見圖1;高效液相色譜法,見圖2。

        圖1微生物法標準曲線相關系數均為1.000,效果較好。圖2高效液相色譜法標準品峰值和峰形較好。

        2.2 不同方法檢測煙酸數據對比情況

        選取10組樣本進行對比試驗,微生物法和高效液相色譜法檢測牛奶中煙酸的STD、RSD和CV值的統(tǒng)計結果見表1。

        表1結果顯示:微生物法和高效液相色譜法檢測牛奶中煙酸數值的CV值都在10%的范圍內,相當于國標要求的檢測2個平行樣品之間的數值要求范圍,可見2種方法的結果是一致的,因此我們可以采用一種方法(微生物法)進行大量樣本的檢測。

        圖1 微生物法煙酸標準曲線Fig.1 Microbiological assay of nicotinic acid standard curve

        圖2 高效液相色譜法Fig.2 HPLC method

        表1 不同方法檢測煙酸的統(tǒng)計數值Table 1 Different methods for the detection of niacin statistics

        2.3 煙酸回收率的測定

        選取的20組樣本作回收率抽樣統(tǒng)計,結果見表2。

        由表2可見,微生物法回收率在79.5%~112.5%之間,檢測的結果符合回收率的要求。

        2.4 煙酸相對標準偏差的測定

        選取的20組樣本,同一樣品做平行樣檢測,相對標準偏差抽樣統(tǒng)計結果見表3。

        表2 煙酸回收率的測定結果Table 2 Nicotinic acid recovery measurement results

        表3 煙酸相對標準偏差的測定結果Table 3 Nicotinic acid and relative standard deviations of deter mination results

        由表3可見:微生物法檢測相對標準偏差在2.4%~9.9%之間,檢測的結果較好。

        2.5 煙酸大量數據的測定

        煙酸大量數據的測定,見表4;煙酸的測定范圍和煙酸含量正態(tài)分布圖,見圖3和圖4。

        表4 煙酸大量數據的測定結果Table 4 Results of determination of niacin to large amounts of data

        圖3 煙酸的測定范圍Fig.3 Determination of niacin range

        圖4 煙酸含量正態(tài)分布圖Fig.4 Nicotinic acid content of normal distribution

        由表4、圖3和圖4可見:410組煙酸數據平均值為 87μg/100 mL,數據范圍在 36μg/100 mL~138μg/100mL。牛奶中煙酸含量大部分在70μg/100mL~120μg/100 mL之間。

        3 結論與討論

        實驗結果顯示:微生物法和高效液相色譜法的檢測結果一致。另對微生物法檢測煙酸的標準曲線相關系數、回收率和相對標準偏差進行統(tǒng)計,檢測結果都很好,另外高效液相色譜法因其檢測速度較慢、成本較高,所以我們采用微生物法進行大量樣本的測定。

        微生物法對410組牛奶樣本進行統(tǒng)計分析結果顯示:煙酸平均值為87μg/100 mL,數據范圍在36μg/100 mL~138μg/100 mL之間。牛奶中煙酸含量大部分在 70μg/100 mL~120μg/100 mL 之間。

        煙酸性質比較穩(wěn)定,在沒有菌體污染的情況下損失較少。作為乳制品企業(yè)可以根據牛奶中煙酸的本底含量,適量添加煙酸即可以達到要求。

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