許慶陵，周勇強，戰(zhàn)宇，顧彩琴，曾慶祝，*

（1.廣州大學分析測試中心，廣東 廣州 510006；2.廣州大學化學化工學院，廣東 廣州 510006）

牡蠣，肉味鮮美，是一種高營養(yǎng)的水產品，有“海中牛奶”之稱，是我國四大養(yǎng)殖貝類之一，在廣東、廣西、福建、浙江、臺灣等沿海地區(qū)都進行大量人工養(yǎng)殖，其大多數(shù)作為生鮮食品消費，但牡蠣出水后會很快死亡，容易被微生物污染，且不耐藏，不耐凍[1]。目前，國內牡蠣以鮮食和制成干肉制品或罐頭制品為主，少量加工成蠔油或其它調味品。隨著牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，牡蠣已出現(xiàn)供過于求和價格下跌的趨勢，開發(fā)牡蠣加工利用的新途徑對促進牡蠣養(yǎng)殖業(yè)進一步發(fā)展具有十分重要意義[2]。

目前，針對牡蠣的研究開發(fā)熱點有，從牡蠣中提取抗氧化活性肽和抗腫瘤活性肽[3-4]、采用胰蛋白酶、胃蛋白酶或木瓜蛋白酶制備牡蠣水解蛋白，但水解效果不甚理想[5]，采用Alcalase堿性蛋白酶制備牡蠣水解蛋白的研究報道相對較少。剛捕獲的魚貝類腥臭味輕微，但隨著鮮度下降，腥臭味逐漸增強。牡蠣肉經過酶解制得水解蛋白之后，呈現(xiàn)出牡蠣特殊香氣和味道，主要呈味成分是酶解產生的氨基酸、小分子肽類，以及醛、酮、酸和酚類等[6]。同時，水解液中也有一定腥味，這種腥味給牡蠣水解蛋白的風味帶來了負面影響，所以有必要對牡蠣水解蛋白進行脫腥，使其具有更加純正的牡蠣風味，其中，美拉德反應是一種脫腥的可選方法[7-8]。針對牡蠣酶解蛋白液脫腥技術的研究起步較晚，大多是在2009年才開始研究[7]，有關研究報道也不多。為此，本實驗采用Alcalase堿性蛋白酶道也不多。為此，本實驗采用Alcalase堿性蛋白酶對牡蠣進行水解制備牡蠣水解蛋白，通過正交試驗優(yōu)化其水解條件，并對牡蠣水解蛋白液的腥味脫去技術進行研究和優(yōu)化，豐富和完善牡蠣水解蛋白的制備技術，為牡蠣肉的深加工和綜合利用提供依據(jù)，提高牡蠣的經濟和社會價值。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

新鮮牡蠣：購自超市；Alcalase堿性蛋白酶：丹麥諾維信公司；食品級活性炭：市售；葡萄糖：市售；甲醛、鹽酸、氫氧化鈉等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

數(shù)顯恒溫水浴振蕩器THZ-82：江蘇省金壇市宏華儀器廠；DHS-20型精密酸度計：上海雷磁儀器廠；紫外/可見分光光度計UV－2100：北京瑞利儀器有限公司；自動凱氏定氮儀S5：德國Labor-Technik；六聯(lián)同步電動攪拌機JJ-6：江蘇金壇市華歐儀器廠；冷凍離心機J-6M：美國BECKMAN；旋轉蒸發(fā)儀Hei-VAP，德國Heidolph；微型實驗室噴霧干燥儀YC-015：上海雅程儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牡蠣水解蛋白制備

原料解凍→搗碎→按適當料液比加水→牡蠣原料漿液→調節(jié)酸堿度→加入蛋白酶→酶解→滅酶活→離心分離→真空濃縮。

1.3.2 測定方法

水解度（DH%）測定：甲醛滴定法[10]。

1.3.3 脫腥工藝

取一定量牡蠣水解蛋白液→加入脫腥劑（活性炭/葡萄糖）→恒溫脫腥→離心（4000 r/min，10 min）→過濾→上清液→感官評定。

1.3.4 感官評定方法

腥味感官評定標準見表1及表2。

表1 活性炭脫腥評分標準Table 1 Sensory evaluation tandards of deodorization by activecarbon

表2 美拉德反應產物風味評分標準Table 2 Sensory evaluation tandards of flavor by Mailard reaction

2 結果與討論

2.1 牡蠣水解蛋白制備工藝條件

2.1.1 酶添加量的確定

取5份牡蠣原料漿液，分別加入酶活量500×16.67 ×10-6、600 ×16.67 ×10-6、700 ×16.67 ×10-6、800 ×16.67×10-6、900 ×16.67×10-6kat/L 的 Alcalase堿性蛋白酶，于60℃水浴鍋中恒溫水解2.5 h（其間保持pH恒定），然后100℃水浴滅酶10 min，再經5000 r/min離心20 min，取上清液測水解度，結果見圖1。

圖1 酶加量對水解度的影響Fig.1 Effect of additive mount of enzyme on the DH

圖1表明，酶加量對牡蠣水解度的影響較大，隨著酶加量從 500×16.67×10-6kat/L～900×16.67×10-6kat/L的增加，牡蠣水解度由35.9%到41.28%增大。當酶加量增至 800×16.67×10-6kat/L（即：13.34 mkat/L）時，其水解度的增長趨勢平緩。從理論上不難解釋，隨著酶量的增加，酶與底物蛋白質的接觸幾率增加，酶對底物蛋白質的解裂作用增強，因此，水解度也逐漸增加?；诔杀疽蛩氐目紤]，選用13.34 mkat/L為適宜酶加量。

2.1.2 水解時間的確定

取5份牡蠣原料漿液，分別加入13.34 mkat/L Alcalase堿性蛋白酶，在60℃下分別恒溫水解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h（其間保持 pH 恒 1.5、2.0、2.5、3.0 h（其間保持pH恒定），然后100℃水浴滅酶10 min，再經5000 r/min離心20 min，取上清液測水解度，結果見圖2。

圖2 水解時間對水解度的影響Fig.2 Effect ofhydrolysis time on the DH

圖2表明，隨著水解時間延長，水解度逐漸增加，當水解時間達到2.5 h時，水解度達到最高，隨后水解度基本保持恒定，這說明酶解時間達2.5 h時，底物蛋白質已基本被水解，再延長酶解時間，水解度也不再增加?；诮洕室蛩兀附鈺r間初為2.5 h。

2.1.3 水解溫度的確定

取5份牡蠣原料漿液，分別加入13.34 mkat/L Alcalase堿性蛋白酶，分別在 40、50、60、70、80 ℃下恒溫水解2.5h（其間保持pH恒定），100℃水浴滅酶10min，再經5000 r/min離心20 min，取上清液測水解度，結果見圖3。

圖3 溫度對水解度的影響Fig.3 Effect ofhydrolysis temperature on the DH

圖3表明，在40℃～60℃時，隨著溫度的升高，水解度增加，60℃時水解度達到最高，超過60℃時水解度隨溫度的升高反而下降，這可能是由于隨著溫度的升高，Alcalase堿性蛋白酶的活性有所降低，因此水解效率降低。因此，酶解溫度初定60℃為宜。

2.1.4 酶解pH的確定

取5份牡蠣原料漿液，分別用0.05 mol/L NaOH溶液或 HCl溶液調 pH 為 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，分別加入13.34 mkat/L的Alcalase堿性蛋白酶，在60℃下酶解，其間分別保持各自恒定的pH，恒溫水解2.5 h，然后100℃水浴滅酶10 min，再5000 r/min下離心20 min，取上清液測水解度，結果見圖4?？芍?，pH對水解度的影響較大，當pH為8.0時水解度達最大，繼續(xù)增大pH會影響酶活力，導致水解度反而下降。所以，酶解pH初選8.0。

2.1.5 酶解工藝條件優(yōu)化

圖2 pH對水解度的影響Fig.2 Effect pH on the DH

為優(yōu)化牡蠣酶解工藝條件，在單因素試驗基礎上，采用L9（34）正交試驗設計方案，選擇酶加量、溫度、時間和pH 4個因素，每個元素選3個水平，以水解度為指標進行酶解工藝條件優(yōu)化。因素及水平安排見表3，正交試驗方案及結果見表4。

表3 正交試驗L9（34）因素水平表Table 3 Factor and levels of L9（34）

表4 正交試驗方案及結果Table 4 Orthogonal test results of hydrolysis

由正交試驗結果表4可知，影響水解度的主次因素為A>B>D>C，即酶加量>水解時間>pH>溫度。再對獲得的兩個實驗優(yōu)方案為A2B2C1D2和A2B3C1D2進行對比試驗發(fā)現(xiàn)，A2B2C1D2方案的水解度為最高39.25%。因此，確定酶解的最優(yōu)方案為A2B3C1D2，即：酶加量13.34 mkat/L，水解時間 2.5 h，pH8.0，溫度 65℃。

2.2 水解蛋白脫腥實驗

2.2.1 活性炭脫腥

2.2.1.1 活性炭使用量的確定

取10 mL水解蛋白液5份，按1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%比例分別加入活性炭（試驗組號依次為A1、A2、A3、A4、A5），充分攪拌，在 45 ℃恒溫水浴中保持80 min，再經4000 r/min離心10 min，上清液經過濾后按照表1的標準進行感官評分，評分結果見表5中A1～A5所示。

表5 活性炭使用條件對脫腥效果的影響Table 5 Effect of operation condition of active carbon on deodourization

由表5實驗A1～A5可知，隨著活性炭使用添加量的增加，其顏色、澄清度及脫腥效果都是越來越好。當活性炭添加量增至2.5%時，綜合得分及狀態(tài)與活性炭添加量增至3.0%時一樣，得分均為13分，此時，牡蠣酶解液的顏色為淡黃色，溶液澄清，腥味很小。因此，確定活性炭添加量為2.5%較為經濟適宜。

2.2.1.2 脫腥時間的確定

取10 mL水解蛋白液5份，各加入2.5%活性炭，充分攪拌，在45℃水浴中下分別保持20、40、60、80、100 min（試驗組號依次為 B1、B2、B3、B4、B5），再經4000 r/min離心10 min，上清液經過濾后按照表1的標準進行感官評分，評分結果見表5中B1～B5所示，可知，隨著脫腥時間的增加，牡蠣酶解液的感官評分越來越高，說明其脫腥效果越來越好。脫腥時間的達80 min時，脫腥效果已達到最佳。因此，確定80 min為宜，此條件下，牡蠣酶解液的顏色為淡黃色，溶液澄清透明，無腥味。

2.2.1.3 最適脫腥溫度的確定

取水解液5份，每份10 mL，加入2.5%活性炭，充分攪拌，分別置于 25、35、45、55、65 ℃（試驗組號依次為 C1、C2、C3、C4、C5）水浴中保持 80 min，再經4000 r/min離心10 min，上清液經過濾后按照表1的標準進行感官評分，評分結果見表5中C1～C5所示，可知，從25℃到45℃，感官評分隨水溫遞增，說明脫腥效果漸好。當脫腥溫度在55℃以上時，酶解液的顏色反而加深，澄清和腥味幾乎沒有變化，因此，確定適宜脫腥溫度為45℃。

2.2.2 美拉德反應脫腥

2.2.2.1 葡萄糖添加量的確定

取10mL水解液5份，分別加入1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%葡萄糖（試驗組號依次為 A1、A2、A3、A4、A5），攪拌至充分混勻，在100℃水浴中保持30 min，再經4000 r/min離心10 min，上清液經過濾后按照表2的標準進行感官評分，評分結果見表6中A1～A5所示。

表6 美拉德反應條件對脫腥效果的影響Table 6 Effect of condition of Maillard reaction on deodourization

由表6可知，在添加量為1.0%～3.0%時，酶解液的感官風味總分隨添加量增加，說明其感官風味越來越好；而當葡萄糖添加量超過3.0%以后，酶解液的香味濃郁，沒有腥味，苦味也幾乎沒有，但是，酶解液特有的風味有所減弱，而且鮮味受到一定抑制。因此，美拉德反應所用還原糖（葡萄糖）的適宜添加量為3.0%。

2.2.2.2 美拉德脫腥時間的確定

取10 mL水解液5份，加入3.0%葡萄糖，充分攪拌，在 100 ℃水浴中分別保持 10、20、30、40、50 min（試驗組號依次為 B1、B2、B3、B4、B5），再經 4000 r/min 離心10 min，上清液經過濾后按照表2的標準進行感官評分，評分結果見表6中B1-B5所示，可知，當反應時間達到30 min時，其感官風味評定分數(shù)升至最高，感覺無腥味及無苦味；當反應時間在40 min以上時，其鮮味反而因時間的延長而受到抑制。因此，確定美拉德反應還原糖（葡萄糖）的適宜反應時間為30 min，此時，酶解液具有糖香味，無腥味，鮮味濃郁，無苦味。

2.2.2.3 美拉德反應溫度的確定

取10 mL水解液5份，加入3.0%葡萄糖，充分攪拌，分別放置在 60、70、80、90、100℃（試驗組號依次為 C1、C2、C3、C4、C5）水浴中恒溫保持 30 min，再經4000 r/min離心10 min，上清液經過濾后按照表2的標準進行感官評分，評分結果見表6中C1～C5所示，可知，酶解液的感官風味評定總分隨反應溫度升高而遞增，說明溫度對其風味有影響。隨著溫度的升高，美拉德反應程度越深，產生的香味也越突出，在溫度為100℃下的美拉德反應所產生的感官風味達到最佳。因此，確定美拉德反應的適宜溫度為100℃，此時，酶解液具有濃郁香味，無腥味，鮮味濃郁，且無苦味。

3 結論

1）采用Alcalase堿性蛋白酶制備牡蠣水解蛋白的最適工藝條件為：酶用量13.34 mkat/L，水解溫度65℃，pH 8.0，水解時間2.5 h，在此條件下牡蠣蛋白質的水解度高達40.38%。

2）通過活性炭及美拉德反應對牡蠣水解蛋白液脫腥技術試驗發(fā)現(xiàn)：活性炭吸附及美拉德反應兩種方法對酶解液的脫腥均能產生一定的效果；活性炭脫腥的最適條件是活性炭使用量2.5%、脫腥時間80 min、脫腥溫度45℃；美拉德反應脫腥的最適條件是葡萄糖添加量3.0%、脫腥時間30 min、脫腥溫度100℃；綜合比較兩者的脫腥效果，美拉德反應為較好的脫腥方法。

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